不同基質和覆土栽培條件下雙孢蘑菇中吡蟲啉和咪鮮胺殘留差異影響

郭燕云, 陳珊珊, 張其才, 饒欽雄, 王獻禮, 程 琳, 宋衛國*,

(1. 上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2. 上海市農業科學院 農產品質量標準與檢測技術研究所，上海 201403)

近年來，食用菌產量和食用菌進出口貿易額逐年增加，年產量超過 3 400 萬 噸，為中國農業經濟增長做出了重大貢獻[1-2]。但食用菌在生產過程中的農藥殘留問題仍然沒有得到解決，不僅給人類及動植物帶來健康風險，同時也給食用菌進出口貿易帶來嚴重影響[3-4]。農藥施用后會殘留在食用菌覆土和培養料中，再通過生物富集在食用菌子實體中殘留[5-7]，劉燁潼等[8]對天津市售 5 種食用菌抽樣檢測發現，農藥殘留總體合格率為 92.3 %，其中雙孢蘑菇的合格率為76.9%，相比于香菇(100 %)、平菇 (90.6 %)、白靈菇 (96.7 %)和金針菇 (100 %)，雙孢蘑菇質量問題更為突出。

雙孢蘑菇Agaricus bisporus是一種草腐型食用菌，目前在全球范圍內廣泛栽培，近年來雙孢蘑菇工廠化栽培發展勢頭強勁[9]。常規栽培中使用稻秸稈、麥秸稈等作為培養料，泥炭土、田園土等作為覆土材料，也可在泥炭土中加入一定比例的草木灰、椰糠、廢棄菌渣等材料提高雙孢蘑菇產量[10-14]。雙孢蘑菇生產中覆土和培養料構成稍有差異，覆土有機碳含量不同，稻秸稈和麥秸稈組成比例也不同[15-17]。研究表明，有機碳含量和pH值均會影響雙孢蘑菇栽培過程中農藥的富集和降解[18-20]，關于雙孢蘑菇的覆土性質和培養料原料種類對農藥的殘留消解有何影響、如何影響，尚未見報道。歐盟 (EU) 規定吡蟲啉在栽培真菌中的最大殘留限量 (MRL) 為 0.05 mg/kg，中國尚未制定吡蟲啉在食用菌中的 MRL[21]。中國規定鮮蘑菇中咪鮮胺的MRL 值為2 mg/kg[22]，日本規定咪鮮胺在雙孢蘑菇中的MRL 值為2 mg/kg[23]，歐盟規定其在栽培真菌和野生菌中的 MRL 值分別為3 mg/kg 和 0.05 mg/kg[21]。綜上，本研究選取常用的代表性覆土材料——泥炭土并添加草木灰和椰糠，并基于稻/麥秸稈兩種比例的培養料，研究了吡蟲啉和咪鮮胺在不同栽培基質中的消解動態，旨在為雙孢蘑菇生產中農藥的安全使用及風險評估提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藥劑、試劑與儀器

吡蟲啉標準品 (imidacloprid，純度 99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司)；咪鮮胺標準品 (prochloraz，100 μg/mL，溶劑為甲醇，天津阿爾塔科技有限公司) ；80%吡蟲啉水分散粒劑 (80% imidacloprid WG，天津市華宇農藥有限公司)；50 % 咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑 (50% prochloraz manganese salt WP，上海生農生化制品股份有限公司)；乙腈和甲醇(HPLC 級，德國 Merck 公司)；氯化鈉 (分析純，上海埃彼化學試劑有限公司)；乙酸銨和甲酸均為色譜純 (純度 ≥99.0 %，上海安譜實驗科技股份有限公司)；WondaPakQuEChERS 檸檬酸鹽提取試劑包 (4 g 硫酸鎂，1 g 氯化鈉，0.5 g 檸檬酸氫二鈉，1 g 檸檬酸鈉，日本島津公司)。

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀 (美國Waters 公司)；AB 5500 型三重四極桿質譜儀 (美國 ABSCIEX 公司)；MX-S 渦旋儀 (美國賽洛捷克公司)；ADV 230 數顯型渦旋混合器 (美國 Henry Troemner 公司)；D-37520 冷凍離心機 (美國 Thermo公司)；CQ-250-DST 型超聲波清洗器 (上海躍進醫用光學器械廠)；HWS-250 電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；Ultra 系列超純水儀 (上海首立實業有限公司)；N-EVAP-12 氮吹儀(美國Organomation 公司)；CM230 L 手推式攪拌機 (鞏義市吳軍機械廠)；PB936 奧克斯食品料理機 (中山市歐麥斯電器有限公司)；S220-K 型手持式pH 計 (梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗地點與條件 田間試驗地點設在上海聯中食用菌專業合作社，供試雙孢蘑菇Agaricusbisporus菌種為美國 A15 (由上海聯中食用菌專業合作社提供)，室內試驗設在上海市農科院質標所實驗室。以6 m × 1.35 m 的床架為1 個小區，2 m ×1.35 m 的區域為試驗單位，小區間設隔離帶，設置3 個重復。覆土和培養料的組成同文獻方法[17]。培養料發酵與出菇栽培過程同文獻方法[24]。

1.2.2 不同覆土和培養料理化性質 常規覆土和椰糠土中的有機碳、有機質含量較高，草木灰土pH 值較高，這是由于草木灰本身呈堿性，添加到覆土中導致覆土pH 值升高。3 種覆土的含水量基本保持一致。兩種培養料的有機碳、有機質含量、pH 值和含水量基本保持一致 (表1)。

表1 不同覆土和培養料理化特性Table 1 Physico-chemical properties of different casing soil and composts

1.2.3 試驗方法

1.2.3.1 施藥劑量 根據吡蟲啉、咪鮮胺在其他農作物上的推薦劑量，本研究中以推薦劑量的3 倍作為施藥劑量，即80 % 吡蟲啉水分散粒劑用量1.5 g/m2，50 % 咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑用量為7.2 g/m2。

覆土：每個試驗單位2 m × 1.35 m 的床架，80 %吡蟲啉水分散粒劑4.05 g，50 % 咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑19.44 g，添加1 L 自來水，配制成藥液。

培養料：每個試驗單位2 m × 1.35 m 的床架，80 %吡蟲啉水分散粒劑為0.81 g，50 % 咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑為3.89 g (由于培養料采取噴霧施藥方式，施藥劑量約為覆土的1/5)，添加200 mL自來水，配制成藥液。

1.2.3.2 農藥在不同覆土中消解試驗 采用一次施藥多次采樣的方法，設置3 個處理：常規覆土(ST1)、草木灰土 (ST2，常規覆土添加20 %草木灰)、椰糠土 (ST3，常規覆土添加20 % 椰糠)。ST1 處理時，每個試驗單位2 m × 1.35 m 的床架稱取準備好的常規覆土85 kg 置于手推式攪拌機中，邊攪拌邊噴霧加入已配好的藥液，然后將拌好的覆土覆蓋到3 次發酵培養料的床架上。ST2、ST3 處理中，稱取64 kg 原土、17 kg 草木灰/椰糠、4 kg 自來水 (調整覆土含水量使其一致)，同樣采用邊攪拌邊噴霧施藥，將覆土覆蓋到培養料上。不同覆土試驗中使用的培養料均為3 次發酵培養料 (52%小麥秸稈、39.3%雞糞、1.6%棉籽殼、2.3%棉籽餅和4.8%石膏)，由上海聯中食用菌專業合作社提供。另設不添加農藥的空白覆土對照 (CK1)。

1.2.3.3 農藥在不同培養料中消解試驗 試驗設置兩個稻秸稈/麥秸稈配比的培養料，分別為m(稻秸稈) :m(麥秸稈)=0 : 10 (CT1)、2 : 8 (CT2)，由上海聯中食用菌專業合作社提供，將藥液采用噴霧方式均勻噴灑在3 次發酵培養料表面，再覆蓋上空白覆土。另設不添加農藥的空白培養料對照(CK2)。

1.2.3.4 采樣方法 采用五點采樣法，分別在施藥后2 h 及1、3、5、7、10、20、30、40、50 d 采樣，分別采集覆土和培養料各200 g (培養料采樣時將覆土與培養料接觸部分去除，以防止混入的覆土顆粒影響試驗結果) 及空白樣品，于真空冷凍干燥機中干燥72 h，用粉碎機打成粉末，于-20 ℃保存，備用。每潮雙孢蘑菇直徑長至 5 cm 左右 (即26 d、35 d、45 d) 時采摘各500 g，去除根部，盡量不帶覆土，用料理機將子實體勻漿，于 -20 ℃保存，備用。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 參考Zhang 等的方法[25]。分別稱取2 g 雙孢蘑菇覆土、培養料或子實體 (10 g)樣品于 50 mL 塑料離心管中，加入10 mL 超純水浸泡 10 min (其中雙孢蘑菇子實體樣品無需加水)后加入 10 mL 乙腈，手動渦旋提取 2 min，超聲提取 10 min；加入檸檬酸鹽提取鹽試劑包，振蕩1 min，于 5 000 r/min 下離心5 min；取上清液1 mL 于試管中，加入 1 mL 超純水，過 0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.2 儀器檢測條件

色譜條件：Waters BEH C18色譜柱 (2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)；流速 0.4 mL/min，流動相 A 為甲醇，B 為 5 mmol/L 乙酸銨。梯度洗脫程序：5%A 開始，保持1.5 min；＞1.5～4.5 min，從5% A 增加到95 % A；＞4.5～5.5 min，由95 % A 降至5% A；5% A 保持1 min。進樣量 2 μL，柱溫 30 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源正離子掃描 (ESI+)；多反應監測模式 (MRM)，離子化電壓為 5 kV；溫度 500 ℃；噴霧氣流速 55 μL/min；氣簾氣流速35 μL/min；吡蟲啉定量離子對m/z256/175.1，定性離子對m/z256/209；咪鮮胺定量離子對m/z376.1/308，定性離子對m/z376.1/70.1。

1.3.3 標準溶液配制及標準曲線繪制 準確稱取吡蟲啉 0.01 g 標準品，用甲醇溶解，配成100 mg/kg的標準溶液，于-20 ℃保存，待用。將吡蟲啉和咪鮮胺標準溶液用甲醇分別稀釋成 0.005、0.05、0.1、0.5 和1 mg/L 系列標準溶液，按1.3.2 節的條件測定，分別以吡蟲啉和咪鮮胺的質量濃度為橫坐標，離子峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4 添加回收試驗 根據預試驗結果，分別向空白覆土、培養料或子實體提取液中添加0.02、0.1 和1 mg/L 3 個水平的吡蟲啉和咪鮮胺標準溶液, 每個水平重復 5 次。按1.3.1 節的方法進行樣品前處理，按1.3.2 節的條件測定，計算添加回收率及相對標準偏差。

1.3.5 基質效應 通過溶劑標準曲線斜率及基質標準曲線斜率的比值計算基質效應 (Me)。當Me介于0.8～1.2 時，基質干擾程度較低[26]。

2 結果分析

2.1 線性范圍、添加回收率、相對標準偏差及基質效應

在 0.005 ～ 1 mg/L 范圍內，吡蟲啉和咪鮮胺的質量濃度與各自對應的峰面積間呈良好的線性關系。線性方程為吡蟲啉y= 2.40 × 106x+ 1.22 × 104，R2= 0.999 7；咪鮮胺y= 9.83 × 105x+ 9.22 × 103，R2= 0.999 8。以3 倍信噪比計算檢出限 (LOD)，以10 倍信噪比計算定量限 (LOQ)，結果見表2。

添加回收試驗測定結果表明，在 0.02 ～ 1 mg/L添加水平下，吡蟲啉和咪鮮胺在覆土、培養料和雙孢蘑菇子實體3 種基質中的平均回收率為 78% ～94 %，相對標準偏差 (RSD) 為 1.6 % ～ 13 % (表2)，符合農藥殘留分析的要求[27]。

表2 吡蟲啉和咪鮮胺在覆土、培養料和子實體中的平均添加回收率、相對標準偏差、檢出限和定量限 (n = 5)Table 2 Average recoveries, RSDs, LOD and LOQ of imidacloprid and prochloraz in casing soil,compost and fruiting body(n = 5)

在本試驗條件下，吡蟲啉在覆土、培養料和雙孢蘑菇子實體中的基質效應分別為0.96、0.95 和0.98，咪鮮胺在覆土、培養料和雙孢蘑菇子實體中的基質效應分別為0.98、0.99 和1.03，兩種農藥的基質效應均在 0.8 ～ 1.2 之間，可忽略不計，因此本研究采用溶劑標準溶液進行外標法定量。

2.2 吡蟲啉、咪鮮胺在覆土中的消解動態

2.2.1 吡蟲啉在覆土中的消解動態 由圖1 可知：隨著施藥后時間的增加，吡蟲啉在3 種覆土中的殘留量呈明顯的下降趨勢，消解動態符合一級反應動力學方程 (表3)。覆土中有機碳含量與吡蟲啉消解速率呈負相關，隨著有機碳含量的增加，半衰期變長。草木灰土的有機碳含量低于常規覆土和椰糠土，而半衰期最短，說明pH 值也對吡蟲啉在雙孢蘑菇覆土中的消解有較大影響，各因素之間是否有協同或拮抗作用仍需進一步研究。

表3 吡蟲啉和咪鮮胺在3 種覆土中的消解動態Table 3 Dissipation dynamics of imidacloprid and prochloraz in three casing soil

2.2.2 咪鮮胺在覆土中的消解動態 由圖1 可知：咪鮮胺在常規覆土、草木灰土、椰糠土3 種覆土的消解規律跟吡蟲啉相似，但與吡蟲啉相比，咪鮮胺在這3 種覆土中消解更快。

總體來看，草木灰和椰糠的加入均會加快吡蟲啉和咪鮮胺的消解，且消解速率與覆土的有機碳含量、酸堿度有關，其中pH 值對其在雙孢蘑菇覆土中的消解有較大影響。

2.3 吡蟲啉、咪鮮胺在培養料中的消解動態

2.3.1 吡蟲啉在培養料中的消解動態 由圖2 可知：吡蟲啉全麥草培養料 [m(稻秸稈) :m(麥秸稈)=0 : 10] 中的初始殘留量為157.9 mg/kg，50 d的殘留量為1.6 mg/kg，半衰期為7.7 d；而在20 %稻秸稈 [m(稻秸稈) :m(麥秸稈) =2 : 8] 的培養料中的初始殘留量為139.1 mg/kg，50 d 的殘留量為1.7 mg/kg，半衰期為8.0 d (表4)。與全麥草配方相比，吡蟲啉在20 %稻秸稈配方中消解得更慢，這可能是由于稻麥秸稈本身物理結構不同，稻秸稈更容易板結，培養料通氣性變差，抑制了與農藥降解有關的酶的活性[28]，從而使得吡蟲啉在培養料中半衰期變長。

2.3.2 咪鮮胺在培養料中的消解動態 由圖2 可知：咪鮮胺在兩種培養料中的消解規律與吡蟲啉相似。在全麥草培養料中50 d 的消解率為97 %，半衰期為10.9 d，而在20%稻秸稈培養料中50 d的消解率為88.6 %，半衰期為 12.8 d (表4)。

表4 吡蟲啉和咪鮮胺在兩種培養料中的消解動態Table 4 Dissipation dynamics of imidacloprid and prochloraz in two composts

總體看來，全麥草培養料中吡蟲啉和咪鮮胺的消解速率更快，從農藥消解角度來看，實際生產中選用全麥草培養料優于20 %稻秸稈培養料。

綜上，吡蟲啉和咪鮮胺在培養料中的消解率明顯高于覆土，在培養料中屬于易消解的農藥 (t1/2＜30 d)，并且吡蟲啉或咪鮮胺在兩種培養料中的消解均表現為在全麥草中的半衰期長于在20%稻秸稈中的，這也以說明培養料中農藥的消解可能與稻/麥秸稈的物理結構有關。

2.4 不同栽培基質對雙孢蘑菇子實體中吡蟲啉、咪鮮胺殘留的影響

結果 (表5) 表明：在不同覆土處理下，兩種農藥在雙孢蘑菇3 潮次菇中均有檢出，且在常規覆土處理的子實體中的殘留量均高于在草木灰土和椰糠土中的。覆土中的農藥會向雙孢蘑菇中遷移，草木灰土和椰糠土處理中吡蟲啉在雙孢蘑菇子實體中的殘留量顯著降低，草木灰土處理中咪鮮胺在雙孢蘑菇子實體中的殘留量顯著降低。

表5 兩種農藥在不同覆土和培養料栽培的雙孢蘑菇中的殘留量Table 5 Residues of two pesticides in Agaricus bisporus cultivated with different casing soil and composts

在不同培養料處理下，兩種農藥在全麥草處理的子實體中殘留量均低于20%稻秸稈中的，說明半衰期較長的處理，最終雙孢蘑菇子實體中殘留量也較大。同一處理不同潮次子實體內的農藥殘留有所不同，第二潮次吡蟲啉殘留最低，咪鮮胺殘留量最高。但這種變化并不呈現明顯的規律性，可能跟采摘、栽培措施、菇體大小等有關。

3 結論與討論

本研究報道了吡蟲啉和咪鮮胺在雙孢蘑菇3 種覆土和兩種培養料中的消解規律，采用超高效液相色譜-串聯質譜 (UPLC-MS/MS) 法測定了農藥在覆土和培養料中不同時間段的殘留量。結果表明，在0.005 ～ 1 mg/L 范圍內，兩種農藥的質量濃度與峰面積間呈良好的線性關系 (R2＞ 0.99)，在0.02、0.1 和1 mg/L 3 個添加水平下，吡蟲啉和咪鮮胺在覆土、培養料和雙孢蘑菇3 種基質中的回收率為78%～94%，RSD 為 1.6% ～ 13%，檢出限均為 0.0001～0.002 mg/L，均滿足農藥殘留分析的要求。

在不同栽培基質中，吡蟲啉和咪鮮胺的消解規律均符合一級反應動力學方程。消解半衰期均表現為：覆土中常規覆土 ＞ 椰糠土 ＞ 草木灰土，培養料中m(稻秸稈) :m(麥秸稈) = 2 : 8 ＞m(稻秸稈) :m(麥秸稈) = 0 : 10。這可能與農藥本身的性質有關。研究表明，土壤中有機質有利于農藥的降解[29]。農藥消解速率與覆土酸堿性也有相關性，特別是堿性條件下吡蟲啉因為易水解而消解變快[30]。吡蟲啉和咪鮮胺本身在堿性條件下易水解[29]，當pH = 11 時，咪鮮胺在不同緩沖溶液中的水解速率較快[31]。而且，pH 值對土壤空隙中發生的反應有較大影響，其效果取決于反應是堿催化還是酸催化，溫度、濕度、根際分泌物、土壤粒徑等因素也會對農藥殘留消解造成影響[32]。而草木灰土的pH 值為9.28，可能導致添加草木灰覆土中農藥消解較快，50 d 的消解率達到85.6 %。此外，栽培基質中有機碳含量也會影響農藥的消解，同種農藥在有機質含量高的土壤中移動速率更快[33]，有機碳含量高會提高農藥的吸附和消解能力[34]，使半衰期縮短。吡蟲啉和咪鮮胺在培養料中的消解速率快于覆土，這與前期其他農藥的消解規律一致[7]。

吡蟲啉殘留物定義為吡蟲啉及其衍生物含有6-氯-吡啶基的代謝物，咪鮮胺殘留物定義為咪鮮胺及其含有2,4,6-三氯苯酚結構的代謝物[35]。本研究中分析了母體化合物在雙孢蘑菇及栽培基質中的消解動態，但缺少對其代謝物的分析。根據前期研究[22]，覆土中吡蟲啉代謝物吡蟲啉脲、6-氯煙酸、吡蟲啉烯烴的總量與親本吡蟲啉相比不超過2.4%。有研究表明，土壤中吡蟲啉代謝物的總和從未超過6%，母體化合物在土壤中始終是主要成分[36]。因此，吡蟲啉母體化合物消解速率在總殘留物消解中占據主導作用，但仍需要關注培養料和覆土變化對代謝物及其含量的影響。咪鮮胺最終代謝物為2,4,6-三氯苯酚，有研究發現在蘑菇土壤中2,4,6-三氯苯酚的殘留量隨時間呈現增長的趨勢，其代謝物含量未超5 %[37]。因此本研究未對咪鮮胺代謝物2,4,6-三氯苯酚進行測定，母體化合物消解一定程度上反映了培養料和覆土對咪鮮胺殘留消解的影響，然而需要進一步研究代謝物變化對總體殘留量的改變，以更準確地反映雙孢蘑菇栽培基質對咪鮮胺殘留的影響。在本研究栽培基質模擬試驗中，環境條件 (溫度和濕度) 基本保持一致，主要的影響因素為基質有機質含量、組分、pH 值等各因素，但仍需要更深入研究確定主導因素及相關影響機理，從理論上進一步揭示栽培基質對農藥殘留的改變規律，為合理選擇培養基配方、科學合理施用農藥和降低農藥殘留風險提供理論支持。