趙雪君, 李 達, 劉士領, 王鳴華
(南京農業大學 植物保護學院,南京 210095)
近年來,塑料行業快速發展,塑料制品種類繁多,其主要類型包括聚乙烯 (PE)、聚丙烯 (PP)、聚苯乙烯 (PS)、聚氯乙烯 (PVC)、聚酰胺 (PA)、聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA) 和低密度聚乙烯(LDPE) 等傳統塑料以及聚丁二酸丁二醇酯 (PBS)、聚乳酸 (PLA) 等新型可降解塑料。因其性能優異、價格低廉,現被廣泛應用到人們生產生活的方方面面,如農用地膜、一次性塑料餐具、管道或門窗等。雖然塑料制品大大便利了人們的生活,但是塑料垃圾也對環境造成了一定的污染。據報道,2017年全球塑料產量已高達3.48 億噸[1],預計到2050 年,向環境中排放的塑料將達到120億噸[2]。暴露于環境中的塑料經物理、化學及生物降解作用,會形成尺寸更小的塑料顆粒或碎屑。目前,學術界通常認為粒徑小于5 mm 的塑料顆粒為微塑料 (microplastics)[3-4]。微塑料污染是全球普遍性的環境問題,但近年來對微塑料污染的研究主要集中在水生環境中,而對陸地環境微塑料污染問題的關注較少。已有研究表明,土壤亦是重要的微塑料儲存庫之一,土壤中的微塑料污染也應引起重視[5-8]。例如,浙江桑溝灣楮島和上海農田中微塑料豐度分別為17.1 和10.3 個/kg[9-10],山東濱海潮灘土壤和杭州灣沿岸平原農田土壤中微塑料豐度分別為634 和263~571 個/kg[11-12],而陜西農田土壤及武漢郊區蔬菜地土壤中微塑料豐度最高可達3 140 和12 560 個/kg[13-14]。
農藥施用后大部分散落于土壤中,在土壤中發生擴散、遷移和降解等行為。近年來,有研究發現微塑料可以影響農藥的環境行為。如Wang等研究表明,PE 對氟環唑、戊唑醇、腈菌唑、嘧菌酯、西瑪津、特丁津、莠去津和精異丙甲草胺8 種農藥的水解具有抑制作用,抑制率為36.84%~192.14%,此外還發現高濃度的微塑料可以減少農藥在水-沉積物中的殘留量,但會延長其在環境中的半衰期,增加農藥在環境中的持久性與危害[15]。Fang 等研究了PS 對己唑醇、腈菌唑和三唑醇的吸附行為,發現PS 對3 種殺菌劑的吸附容量大小順序為己唑醇>腈菌唑>三唑醇,且當PS 粒徑為10 μm 時,對3 種殺菌劑的吸附容量最大,粒徑為100 μm 時吸附容量最小[16]。Wang 等研究發現,室內模擬條件下,PE 可吸附多菌靈、敵百蟲、除蟲脲、馬拉硫磷和苯醚甲環唑,吸附容量大小順序為:除蟲脲>苯醚甲環唑>馬拉硫磷>多菌靈>敵百蟲[17]。
異菌脲 (iprodione) 是二甲酰亞胺類保護性殺菌劑的代表品種[18],據中國農藥信息網統計,目前我國登記的含有異菌脲成分的產品占二甲酰亞胺類殺菌劑登記數量的58%,廣泛用于防治葡萄、番茄、油菜和馬鈴薯等作物上由灰葡萄孢屬、核盤菌屬、叢梗孢屬、小菌核菌屬等引起的多種病害,對病原菌生活史中的各發育階段均有抑制作用[19-20]。但異菌脲對非靶標生物的毒性較高,如對虹鱒魚為中毒,急性毒性LD50(96 h) 值為4.1 mg/L;對羊角月牙藻中毒,急性毒性EC50(72 h) 值為1.9 mg/L;對蜜蜂高毒,接觸毒性LD50(48 h) > 0.4 mg/bee[21]。此外,異菌脲對斑馬魚具有發育毒性、肝毒性和心臟毒性,還會改變小鼠微粒體酶活性,導致小鼠肝細胞增殖和肝腫大[22],并導致雄性大鼠的生殖畸形、延緩其青春期的發育[23]。目前關于異菌脲的研究主要集中在檢測、活性、毒性以及環境行為等方面,如程冰峰發現異菌脲在東北黑土、青海草甸土、南京黃棕壤和江西紅壤土中為易降解農藥,但不易移動,難淋溶[24]。研究表明,土壤中的微塑料可以吸附農藥等有機污染物,抑制其在土壤中的移動和降解,從而加重對生態環境的負面效應。然而關于微塑料對異菌脲在土壤中環境行為的影響尚不明確。因此,本文在室內模擬條件下研究了PA 和PMMA 微塑料對異菌脲在土壤中吸附、遷移、淋溶和降解的影響,以期明確微塑料對異菌脲乃至二甲酰亞胺類農藥環境行為影響的共同規律,并為微塑料對其他農藥環境行為的影響規律研究提供借鑒,從而為微塑料污染防控、農藥合理應用提供理論依據。
異菌脲 (iprodione) 標準品 (質量分數99.5%,上海安譜實驗科技股份有限公司);PA 微塑料和PMMA 微塑料 (0.075 mm,東莞市樟木頭華創塑膠原料商行)。乙腈 (色譜純);乙腈 (分析純);丙酮 (分析純);無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、氯化鈣和氯化鈉 (分析純)。pH 4~7 緩沖溶液按照GB/T 31270.2—2014 配制[25]。
Agilent 1260 高效液相色譜儀 (配有UV 檢測器,美國Agilent 科技有限公司);HWS 智能恒溫培養箱 (寧波江南儀器廠);R-3 旋轉蒸發器 (瑞士Buchi 公司);JN25-12D 超聲波清洗機 (寧波江南儀器廠);TDL-40B 臺式離心機 (上海安亭儀器有限公司);渦旋混合儀[桂寧 (上海) 實驗器材有限公司];BT50-1J 蠕動泵 (保定蘭格恒流泵有限公司)。
供試土壤為南京黃棕壤,采自江蘇省農業科學院試驗基地。取0~20 cm 的表層土壤,除去動植物殘體、石塊等雜質,風干、磨碎后過篩 (土壤降解和遷移淋溶試驗土壤過0.85 mm 篩、土壤吸附試驗土壤過0.25 mm 篩),避光保存于4 ℃冰箱。測定土壤pH 值、有機質含量和陽離子交換量,其理化性質如表1 所示。使用前將土壤取出恢復至室溫,并加水至飽和持水量的40%,于人工氣候箱中恒溫 (25 ℃)、恒濕 (相對濕度75%)避光培養14 d 備用。吸附試驗的土壤使用前需在120 ℃條件下濕熱滅菌30 min。

表1 供試土壤的理化性質Table 1 The physico chemical properties of the tested soil
1.2.1 含微塑料土壤的制備 在預試驗中,分別在土壤中添加質量分數為0.5%、1%和2%的微塑料。結果表明,添加2%的PA 和PMMA 分別使土壤的吸附性增強了8.6%和24.7%,其他2 個添加水平和對照處理相比差異不顯著。因此,選取2%的微塑料添加量進行土壤吸附試驗。稱取土壤于白瓷盤中,分別加入質量分數為2%的微塑料PA 和PMMA,攪拌均勻備用。以不含微塑料的土壤作為對照。
1.2.2 含藥土壤的制備 稱取100 g 1.2.1 節中制備的含不同類型微塑料的土壤于燒杯中,添加2.5 mL 1 000 mg/L 的異菌脲丙酮溶液,待丙酮揮發完全后將土壤混合均勻。再向其中加入400 g空白土壤,充分混勻,得到異菌脲添加水平為5 mg/kg 的含藥土壤。
1.3.1 土壤吸附 選取PA 和PMMA 為供試微塑料,通過預試驗發現,土壤對PA 和PMMA 的飽和吸附率分別為25.67%和42.7%。異菌脲在對照土壤中不同水土比[V(水) :m(土壤),mL/g]條件下的吸附結果表明,當水土比分別為5 : 1、10 : 1、20 : 1 和50 : 1 時,土壤對異菌脲的吸附率分別為67.4%、63.7%、58.3%和38.3%。由于異菌脲在水中的溶解度較小,并考慮到加入微塑料后土壤對異菌脲的吸附率會提高,因此在正式試驗中選擇水土比為50 : 1 進行土壤吸附試驗。
1.3.1.1 吸附動力學試驗 分別稱取2.0 g 含2%PA 的土壤、含2% PMMA 的土壤和空白對照土壤于250 mL 錐形瓶中,加入100 mL 含異菌脲質量濃度為5 mg/L 的0.01 mol/L 氯化鈣水溶液,蓋上橡膠塞。將錐形瓶置于恒溫振蕩器中,在25 ℃、180 r/min 條件下振蕩平衡,分別于0、0.5、2、4、6、8、12 和24 h 取樣,通過高效液相色譜 (HPLC)測定異菌脲的含量。同時設置加入含5 mg/L 異菌脲的氯化鈣水溶液的土壤為對照。每處理設3 個平行。
1.3.1.2 等溫吸附試驗 分別稱取2 g 含2% PA 的土壤、含2% PMMA 的土壤和空白對照土壤于250 mL 錐形瓶中,分別加入100 mL 含不同質量濃度 (0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mg/L) 異菌脲的氯化鈣水溶液,蓋上橡膠塞。將錐形瓶置于25 ℃、180 r/min 的恒溫振蕩器中,振蕩平衡24 h。離心后取上清液,過0.22 μm 濾膜,HPLC 測定異菌脲的含量。同時以加入5 個質量濃度異菌脲的氯化鈣水溶液的土壤為對照。每處理設3 個平行。
1.3.1.3 pH 值對吸附的影響 異菌脲在堿性條件下易水解[14],為減少異菌脲水解對吸附試驗的干擾,吸附試驗在pH 值為4、5、6 和7 的緩沖液中進行。分別稱取2 g 含2% PA 的土壤、含2%PMMA 的土壤和空白對照土壤于250 mL 錐形瓶中,加入100 mL pH 值分別為4、5、6 和7 的含5 mg/L 的異菌脲水溶液,蓋上橡膠塞。在恒溫振蕩器中 (25 ℃、180 r/min) 振蕩平衡24 h,離心,取上清液過0.22 μm 濾膜,測定不同pH 緩沖液中異菌脲的含量。同時設未加土壤的異菌脲水溶液為對照。每處理設3 個平行。
1.3.2 異菌脲在土壤中的降解 參照《化學農藥環境安全評價試驗準則》進行[25]。分別稱取5.0 g含2% PA 的含藥土壤、含2% PMMA 的含藥土壤和空白對照含藥土壤于 50 mL 離心管中,加入1.2 mL超純水,調節土壤含水量為24%。旋轉振搖使水分在土壤中均勻分布,稱重。使用透氣硅膠塞塞緊瓶口,置于25 ℃恒溫培養箱內黑暗培養,每48 h 稱重并及時補充水分。設置9 個取樣時間點(0、3、7、14、21、28、35、49 和63 d),定時取樣后,檢測土壤樣品中異菌脲的含量。每處理設3 個平行。
1.3.3 異菌脲在土壤中的遷移、淋溶
1.3.3.1 土壤薄層層析法 分別稱取30.0 g 1.2.1 節制備的3 種供試土壤于燒杯中,加入24 mL超純水,攪拌直至土壤呈均勻的泥漿狀。將泥漿涂布于7 cm × 20 cm 的層析玻璃板上,控制土層厚度約1.0 mm,振蕩使泥漿表面水平且均勻分布,在室內陰涼處避光陰干。在距層析板底部1.5 cm處均勻點滴20 μL 500 mg/L 的異菌脲丙酮溶液,待丙酮揮發后,將層析板置于層析槽內,用水作展開劑。待展開劑到達薄板前沿2 cm 處時,取出層析板并在室溫下避光晾干。將層析板上土壤等距離分為6 段,分別測定每段土壤中異菌脲的含量,并計算比移值 (Rf) 值。每處理設3 個平行。
1.3.3.2 土柱淋溶法 將直徑5 cm、柱長35 cm的PVC 管底部用紗布封緊后,分別加入500 g 過0.85 mm 篩的3 種供試土壤,制成約30 cm 高的土柱。在土柱中緩慢、均勻地加入118 mL、 0.01 mol/L 的氯化鈣水溶液,放置過夜,保證水分均勻地滲透于整個土柱。在土柱表層覆蓋約1 cm 厚的石英砂,在其表面均勻滴加5 mL、 100 mg/L 的異菌脲丙酮溶液,用300 mL 氯化鈣水溶液以0.5 mL/min 的速率淋洗土柱,收集淋出液。淋洗完畢后,將土柱等距離分為3 段,采用HPLC 測定各段土柱及淋出液中異菌脲的含量。每處理設3 個平行。
1.4.1 樣品前處理
1.4.1.1 土壤樣品 稱取5 g 土壤樣品于50 mL離心管中,加入5 mL 超純水和30 mL 乙腈,于2 000 r/min 渦旋10 min,超聲20 min。再加入3 g 氯化鈉和3 g 無水硫酸鎂,渦旋5 min,于4 000 r/min 離心5 min。取15 mL 上清液過無水硫酸鈉于平底燒瓶中,旋轉蒸發至近干,加2 mL 乙腈溶解,待HPLC 檢測。
1.4.1.2 水樣 取1 mL 水樣,過0.22 μm 濾膜,HPLC 檢測。
1.4.2 添加回收試驗 在空白水樣、空白土壤、含2% PA 的土壤和含2% PMMA 的土壤樣品中分別添加 0.05、0.2 和5.0 mg/kg 的異菌脲標準溶液,每個水平重復5 次,測定回收率及相對標準偏差 (RSD)。
1.4.3 液相色譜檢測條件 Eclipse XDB-C18 色譜柱 (150 mm × 4.6 mm, 4.0 μm);流動相為V(乙腈) :V(水) = 60 : 40 ;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量20 μL;檢測波長208 nm。
準確稱取0.010 1 g 異菌脲標準品于10 mL 容量瓶中,以乙腈溶解并定容,配成1 005 mg/L 的異菌脲標準母液,再用流動相梯度稀釋,配制成0.05、0.1、1.0、5.0 和10.0 mg/L 的異菌脲標準工作溶液。在上述儀器條件下檢測,以異菌脲的質量濃度為橫坐標 (x),峰面積為縱坐標 (y) 繪制標準曲線。
1.5.1 土壤吸附 異菌脲在土壤中的吸附率和吸附濃度可按照公式 (1) 和 (2) 計算。
式中:A為異菌脲在土壤中的吸附率;M為初始溶液中異菌脲質量,mg;Ce為經土壤吸附平衡時水相中異菌脲的質量濃度,mg/L;V0為水溶液體積,mL;x為吸附于土壤中的異菌脲質量,mg。
式中:C0為土壤樣品中異菌脲的初始含量,mg/kg;Ct為t時刻土壤樣品中異菌脲的含量,mg/kg;k為降解速率常數,1/d;t為反應時間,d;t1/2為降解半衰期,d。
1.5.3 土壤中的遷移、淋溶
1.5.3.1 土壤中的遷移 根據各段土壤中異菌脲含量在層析板上的分布情況,可按照公式 (6) 計算異菌脲在土壤中的比移值 (Rf)。
式中:Ri為淋出液及各段土柱中異菌脲含量占添加總量的比例,%;m0為異菌脲添加總量,mg;mi為淋出液及各段土柱中異菌脲質量,mg。其中,i= 1、2、3 和4,分別表示0~10 cm、10~20 cm、20~30 cm土壤和淋出液。
以異菌脲標準溶液質量濃度為橫坐標,以HPLC 的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,回歸方程為y= 152x+ 4.69,R2= 0.999 9,保留時間為6.0 min (圖1)。結果表明,異菌脲在0.05~10.0 mg/L 質量濃度范圍內呈良好的線性關系,峰型對稱,準確性好,靈敏度高,出峰時間合理,可以滿足對異菌脲的定量檢測需要。
添加回收試驗結果 (表2) 表明,異菌脲在空白土壤、含2% PA 的土壤和含2% PMMA 的土壤中添加水平為0.05~2.0 mg/kg時,平均回收率為78.1%~97.9%,RSD 為1.4%~8.3%。

表2 異菌脲在土壤中的平均添加回收率及相對標準偏差Table 2 The average recoveries and relative standard deviation for iprodione in soil
2.2.1 吸附動力學 異菌脲在3 種土壤中的吸附曲線如圖2 所示。土壤對異菌脲的吸附量隨著時間的延長而增加,其吸附率在0~2 h 內快速上升,之后緩慢增加,直至24 h 達到吸附平衡。土壤對農藥的吸附主要包括液膜擴散和粒內擴散。初始階段的吸附主要以液膜擴散為主,液膜擴散趨于飽和后則粒內擴散開始占主導,導致擴散阻力增加,因此吸附速率減小,最后達到吸附平衡。在吸附平衡時,對照土壤、含2% PA 的土壤、含2% PMMA 的土壤對異菌脲的吸附率分別為48.7%、57.3%和73.4%,含2% PA 和2% PMMA的土壤對異菌脲的吸附率分別是對照組土壤的1.2 倍和1.5 倍,表明微塑料可以顯著提升土壤對異菌脲的吸附性能。
2.2.2 等溫吸附 如表3 所示,利用Freundlich模型對異菌脲在3 種土壤中的等溫吸附進行擬合,其相關系數均大于0.93,表明異菌脲在3 種土壤中的等溫吸附符合Freundlich 模型,且1/n均小于1,可知異菌脲在3 種土壤中的吸附均屬于非線性吸附。此外,異菌脲在對照土壤、含2%PA 的土壤和含2% PMMA 的土壤中的Kf值分別為91.67、110.18和262.32,進一步表明微塑料可以明顯增加土壤對異菌脲的吸附能力,且PMMA比PA 對提升土壤吸附性能的效應更顯著。

表3 異菌脲在3 種供試土壤中的等溫吸附方程及其相關參數Table 3 The adsorption parameters of iprodione in three types of soil
2.2.3 pH 值對吸附行為的影響 不同pH 值下土壤對異菌脲的吸附率如圖3 所示。結果表明,pH 值可顯著影響3 種土壤對異菌脲的吸附。pH值為4 時,3 種土壤對異菌脲的吸附率均最小;隨著pH 值的增加,吸附率均呈現出增加的趨勢,pH 值為7 時吸附率均最大,此時,對照土壤、含2% PA 的土壤和含2% PMMA的土壤對異菌脲的吸附率分別為40.0%、50.9%和59.7%。
微塑料對土壤中異菌脲降解的影響結果如圖4 所示,異菌脲在3 種土壤中的降解符合一級動力學方程 (表4)。結果顯示,異菌脲在對照土壤中降解最快,半衰期為19.8 d,降解速率常數為0.035 d-1;在含2% PA 的土壤中降解次之,半衰期為26.7 d,降解速率常數為0.026 d-1;在含2% PMMA 的土壤中降解最慢,半衰期為40.8 d,降解速率常數為0.017 d-1。可見PA 和PMMA 可以延緩異菌脲在土壤中的降解,結合吸附試驗結果,發現微塑料對異菌脲的吸附能力越強,其對異菌脲在土壤中降解的延緩作用也就越強。

表4 異菌脲在3 種土壤中的降解動力學參數Table 4 The degradation kinetics parameters of iprodione in three types of soil
2.4.1 微塑料對異菌脲在土壤中移動的影響 異菌脲在3 種土壤薄層中的Rf值分別為0.12、0.097和0.091。異菌脲在對照土壤中的Rf值最大,在含2% PMMA 的土壤中的Rf值最小。異菌脲在微塑料添加土壤中的Rf值均小于對照土壤中的Rf值,同時添加微塑料的土壤的Rf值與對照土壤相比均存在顯著性差異 (P<0.05)。由此推斷PA和PMMA 可以抑制異菌脲在土壤中的遷移。
2.4.2 微塑料對異菌脲在土壤中淋溶的影響 結果 (圖5) 表明,添加微塑料對異菌脲在土壤中淋溶的影響較大。異菌脲在對照土柱中移動性能較好,在第一、第二和第三段土柱中的分布比例分別為85.4%、10.7%和3.9%,淋出液中未檢出。異菌脲在含2% PA 和含2% PMMA 的土柱中移動性較差,全部分布在0~10 cm 段,含量為100%,第二、第三段土柱以及淋出液中均未檢出。
本研究結果表明,PA 和PMMA 兩種微塑料對異菌脲表現出了較強的吸附性能,土壤中添加質量分數為2%的上述兩種微塑料后,土壤對異菌脲的吸附性能明顯增強,Kf值分別是空白對照土壤的1.2 倍和2.9 倍,吸附率分別是空白對照土壤的1.2 倍和1.5 倍。其次,通過擬合Freundlich模型可知,異菌脲在3 種處理土壤中的吸附均屬于非線性吸附。這與前人的研究結果一致。如Jiang 等發現,微塑料可以不同程度地吸附三唑酮和苯醚甲環唑,且PBS 的吸附能力顯著強于傳統不可降解微塑料,PBS 可使兩種農藥在12 h 達到吸附平衡,速率幾乎是PE 和PVC 的兩倍,且PBS 對兩種農藥的最大吸附容量是PE 和PVC 的1.3~7.4 倍;此外,他們利用掃描電鏡對3 種微塑料進行表征,發現表面有褶皺的PE 和PBS 吸附能力強于表面光滑無孔的PVC[26]。Gong 等發現,不同微塑料對氟蟲腈的吸附能力不同,PBS>PLA>PP>PE>PS>PVC;對微塑料表面形態的表征實驗也發現了相似的結果,PE、PS、PLA 和PBS 呈不規則的碎片狀,表面平整或皺縮,其層狀結構提高了吸附能力和吸附容量;而PVC 和PP 則呈顆粒狀,因此吸附能力較弱。其中PP 表面有大量微孔,導致PP 吸附能力大于PVC[27];Yang 等研究發現,PA 和PMMA 對Cu2+的吸附能力大于PE。PA 和PMMA 除了與PE 和PP 擁有相同的官能團 —CH2之外,表面還分別有極性官能團酰胺基(-NHCO-) 和酰氧基 (-COO-) 的存在[5];當微塑料接觸液體時,表面具有極性基團的微塑料更有利于液體分子在塑料表面展開,發生潤濕現象,從而更易吸附環境中的小分子[28]。從以上研究結果可知,不同微塑料的物理和化學結構差異是導致微塑料對農藥吸附行為差異的主要因素。
農藥在土壤中的吸附和遷移、淋溶往往表現出負相關關系,即隨著吸附性能的增強,遷移及淋溶性能相應減弱。如劉娟等發現,噻蟲嗪的水溶性較好,因此其吸附性能較好,但移動擴散能力較弱[29]。在本研究中,土壤中添加兩種微塑料對異菌脲的吸附性能提高的同時,其遷移和淋溶性能也相應減弱。淋溶試驗結果表明,異菌脲在對照土壤中淋溶性較好,3 段土柱中均有異菌脲檢出,而在含微塑料的土壤中淋溶性較差,異菌脲全部分布在第一段土柱中。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》的等級劃分[30],異菌脲在對照土壤中為不易移動,在含微塑料的土壤中均為不移動。表明土壤中的微塑料會增加土壤對農藥的吸附性能,從而減弱農藥在土壤中的移動性能。
本研究表明,異菌脲在土壤中的降解符合一級動力學方程,降解半衰期為19.8 d,屬于易降解的農藥,這與此前的報道一致[24]。然而,在土壤中添加PA 和PMMA 兩種微塑料后,異菌脲在土壤中的降解半衰期明顯延長,而且吸附效果更好的PMMA 對其降解的延緩作用強于PA,二者分別使異菌脲在土壤中的半衰期延長了3 5% 和106%,這可能是由于微塑料吸附農藥后,隔離了其與微生物的接觸,最終延緩了土壤中異菌脲的降解。其他研究結果也表明,環境中的微塑料會延長農藥的降解半衰期。Wang 等的研究表明,PE 可以延長8 種農藥的降解半衰期,而對于降解半衰期中等、logKow值較高的農藥,其延緩降解的效果更明顯[15]。由此可以推測,微塑料可以延緩農藥在環境中的降解,增強了農藥在環境中的持久性,這不僅增加了對環境生物的風險,而且藥物也可能通過食物鏈進入人體內,對人體健康產生潛在危險。
綜上,微塑料可以提高土壤對異菌脲的吸附能力,延長農藥在土壤中的降解半衰期,進而抑制農藥向土壤深層的遷移和淋溶,減少了農藥對地下水的污染風險,但加劇了農藥對表層土壤和地表水的威脅。