延邊圈養黑熊熊源葡萄球菌分離鑒定

閔鵬飛，千慧燕，楊冰祎，宋建臣，賈立軍*,劉德志

1.延邊大學農學院動物醫學系，吉林延吉 133000；2.吉林省磐石市富太鎮畜牧服務站，吉林磐石132307

葡萄球菌是一種非常常見的人獸共患病原菌，隸屬于芽孢桿菌目細球菌科葡萄球菌屬，細菌形態通常為圓形或卵圓形，常呈葡萄串狀排列，無芽孢，無鞭毛，無莢膜。革蘭氏染色陽性。近期吉林省延邊朝鮮族自治州某熊場發現一只不明原因死亡的黑熊。經過現場的初步診斷與勘察，并結合該死亡黑熊生前的臨床癥狀、現場的初步解剖結果判斷，懷疑該死亡黑熊生前很可能感染疑似葡萄球菌的病原菌。為進一步確定病因、診治和預防黑熊的傳染性疾病。本研究利用實驗室診斷方法進行了分離純化、生物化學鑒定、16S rRNA分子鑒定等操作。通過上述實驗得到的數據再結合臨床癥狀以及解剖結果，我們最終確定該菌株為金黃色葡萄球菌。本試驗的順利進行對葡萄球菌的研究工作做出了一定貢獻。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

此次試驗的實驗動物來自于延邊某熊場，現場采集死亡黑熊的肝臟、脾臟等實驗材料。

1.2 主要試劑

生化鑒定管、營養瓊脂、藥敏紙片、質粒小提試劑盒、生化試劑管、血瓊脂平板、革蘭氏染色液等。細菌16S rRNA通用引物由生工生物技術有限公司合成。其它實驗所用到的試劑均由延邊大學預防獸醫實驗室提供。

1.3 細菌的分離純化

將熊場采集的黑熊臟器放置于超凈工作臺上進行進一步處理。用接種環取樣后，分別劃線接種于營養瓊脂培養基、血瓊脂平板培養基和高鹽甘露醇培養基。將上述培養基放入恒溫培養箱中培養24 h。24 h后用接種環挑取培養基上生長良好的單個菌落,接種于3 mL的LB液體培養基中37 ℃震蕩培養一夜后進行革蘭氏染色鏡檢。

1.4 細菌的染色及形態觀察

使用革蘭氏染色法對分離菌株進行染色,并將染色后的載玻片放置于顯微鏡下觀察。

1.5 細菌的生化鑒定

將純化后的細菌制作成細菌懸液。準備五個試管，用記號筆分別做好標記，依次向五個試管中加入葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇五種糖溶液，并向五個試管中滴加0.4%的溴麝香草酚藍作為指示劑。將配置好的細菌懸液滴入五個試管中，每管3滴。用封口膜封口，封口膜用75%酒精擦拭滅菌，接種完后放36±1 ℃培養24 h，觀察結果。

1.6 16S rRNA分子鑒定

采用DNA提取試劑盒說明書對該菌株的DNA進行提取,運用細菌16S rRNA通用引物進行PCR鑒定。取PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。選取PCR陽性產物進行測序，將測序結果提呈NCBI進行對比。

1.7 藥物敏感性實驗

將氧氟沙星、復方磺胺甲唑、頭孢呋辛、萬古霉素、慶大霉素五種藥物的藥敏紙片放置于培養皿上，紙片之間距離應該大致相等。為使實驗結果更加準確，應進行至少5組以上的實驗，放好紙片后，將所有的培養皿倒置于37 ℃恒溫培養箱中，24 h后觀察結果。

1.8 小鼠致病性實驗

取10只健康的1月齡昆明鼠，分成兩個組，第一組5只昆明鼠分別腹腔注射0.5 mL提取完成的細菌懸液并做好標記。另一組5只昆明鼠分別腹腔注射0.5 mL的生理鹽水作為對照組并做好標記。兩組小鼠分放在10個鼠籠飼養，飼料、飲水、溫度等飼養條件均相同。每日定期觀察實驗小鼠的死亡情況并做好紀錄。

2 結果

2.1 剖檢變化

死亡黑熊生前體溫升高，呼吸次數及頻率加快并伴隨腹瀉。排出黑色、水樣稀便,全身皮膚顏色以及性狀發生改變。剖檢可見死亡黑熊肝臟表面出現灰白色的壞死點,脾臟、腎臟不同程度腫大，有紫黑色的出血點。

2.2 分離菌的培養及染色結果

分離所得的菌株，在營養瓊脂培養基上生長良好，生成表面濕潤光滑的圓形菌落，呈現淺黃色直徑1～2 mm斑點狀凸起。在血瓊脂平板培養基形成金黃色、圓形、濕潤凸起的大型菌落，菌落周圍可見透明的溶血環。高鹽甘露醇培養基的菌落形態與營養瓊脂平板的菌落形態大致相同。顯微鏡下可觀察到分離菌為革蘭氏陽性球菌，染色為藍紫色，無芽孢、無菌毛、無鞭毛。呈單個或多個聚集排列。多個細菌聚集時細菌形態類似于葡萄串狀。

2.3 生化鑒定結果

五個試管顏色全部變為黃色，說明分離菌株分解葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇。且分離菌株分解上述五種糖后產生酸性物質但是不產生氣體。

表格1 生化鑒定結果

2.4 PCR鑒定結果

將測序后得到的序列于NCBI上比對后發現，分離菌株的16s rRNA與金黃色葡萄球菌的16s rRNA核苷酸同源性為100%。

2.5 藥物敏感性實驗結果

除復方磺胺甲唑藥敏紙片周圍幾乎不出現抑菌環外，其它種類的藥敏紙片周圍都出現大小不一的抑菌環。由此可以推斷出，分離菌株對大多數種類的抗生素敏感性較強，對磺胺類藥物的敏感性較弱。

2.6 小鼠致病性實驗結果

實驗組小鼠接種細菌懸液后表現明顯，初期癥狀為精神沉郁，被毛凌亂，食欲減退。第3天開始陸續出現死亡現象，第5天實驗組小鼠全部死亡。將小鼠臟器中分離的細菌鏡檢，結果與黑熊體內分離出的細菌形態一致。由此可說明黑熊體內分離出的細菌對小鼠有很強的致病性。

3 討論

相關文獻證明，金黃色葡萄球菌感染可以導致牛、羊身體多處淋巴結腫大且肝、腎等不同程度病變[1,2]。細菌培養以及革蘭氏染色結果可表明該分離菌在普通瓊脂培養基上可以生成光滑的S型菌落。且血瓊脂平板及高鹽甘露醇培養結果表明，分離菌具有高強度的耐鹽性和溶血性。革蘭氏染色結果表明分離菌為革蘭氏陽性球菌，細菌排列形狀與葡萄球菌排列形狀基本相同。根據相關學者的研究[3]，金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥率可以高達90.91%，且金黃色葡萄球菌對于磺胺類藥物最不敏感。最終生化及PCR結果證實，分離菌的生化鑒定結果與金黃色葡萄球菌生化鑒定結果高度相似。16s rRNA結果顯示分離菌核苷酸同源性與金黃色葡萄球菌核苷酸同源性為100%。小鼠致病性實驗表明，分離菌株對昆明鼠有很強的致病性。綜上所述，我們可以證實此次從死亡黑熊體內分離出來的細菌為金黃色葡萄球菌。

本次實驗的成功進行對國內金黃色葡萄球菌的研究工作做出了補充與完善，為今后金黃色葡萄球菌的研究提供了較為詳細的資料。尤其對未來東北地區特別是延邊地區黑熊熊源葡萄球菌病的防治工作具有重要意義，對東北地區的黑熊養殖業做出了巨大的貢獻。