將LAMP方法應(yīng)用于《動(dòng)物疫病防控》課程的教學(xué)改革探索

劉向楠，劉助紅，劉賢旭，田存鋒，康艷梅，劉國(guó)乾，李桂珍

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院 廣州 510430）

《動(dòng)物疫病防控》是一門綜合應(yīng)用性學(xué)科，具有較強(qiáng)的實(shí)踐性和應(yīng)用性。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是《動(dòng)物疫病防控》教學(xué)過(guò)程中的一個(gè)重要的必須環(huán)節(jié)，通過(guò)基本方法和技能培訓(xùn)，培養(yǎng)學(xué)生理論聯(lián)系實(shí)際、發(fā)現(xiàn)問(wèn)題及解決問(wèn)題的綜合能力。目前我國(guó)農(nóng)業(yè)院校開設(shè)的《動(dòng)物疫病防控》課程中在疫病實(shí)驗(yàn)室診斷方法部分普遍存在教學(xué)內(nèi)容相對(duì)陳舊，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容落后等問(wèn)題。例如，經(jīng)典的細(xì)菌培養(yǎng)或病毒分離方法耗時(shí)長(zhǎng)，主要適用于科研型實(shí)驗(yàn)室；熒光定量PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)方法近年來(lái)迅速發(fā)展和應(yīng)用，但對(duì)儀器設(shè)備要求較高，在基層推廣較為困難。為了學(xué)生能更好地學(xué)習(xí)《動(dòng)物疫病防控》課程，從業(yè)后滿足就業(yè)崗位的實(shí)際需要，本教學(xué)團(tuán)隊(duì)將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediatediso the rmalam plification，LAMP）技術(shù)添加到實(shí)訓(xùn)課程教學(xué)中，與學(xué)生共同探討了該方法的技術(shù)優(yōu)勢(shì)及在臨床應(yīng)用的價(jià)值，得到了較好的效果。

LAMP技術(shù)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是采用4或6條能夠識(shí)別目的基因上的6個(gè)特異區(qū)域的引物，依賴與Bst DNA聚合酶的強(qiáng)鏈置換活性，在65℃等溫條件下30min就能擴(kuò)增出約109～1010拷貝的靶序列。試劑盒內(nèi)配備變色反應(yīng)指示劑，可根據(jù)顏色變化判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。LAMP技術(shù)對(duì)核酸質(zhì)量要求不高，可配合核酸免提取技術(shù)使用，現(xiàn)場(chǎng)即可完成檢測(cè)，耗時(shí)短，無(wú)需昂貴儀器設(shè)備。目前，基于LAMP檢測(cè)方法建立的非洲豬瘟檢測(cè)試劑盒已獲得新獸藥證書，在獸醫(yī)臨床中得到廣泛應(yīng)用。故將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)應(yīng)用到《動(dòng)物疫病防控》能夠讓學(xué)生了解一線動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室診斷新方法，為學(xué)生畢業(yè)后走向工作崗位打下一定的基礎(chǔ)。

1 目前《動(dòng)物疫病防控》課程教學(xué)過(guò)程中采用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法

1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR）

該方法是目前教學(xué)和實(shí)踐中均廣泛使用的方法。PCR方法發(fā)明至今已有將近30年的歷史，技術(shù)非常成熟、配套試劑價(jià)格低廉、儀器設(shè)備價(jià)格也逐年降低，是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的主流方法之一，已具有替代傳統(tǒng)分離鑒定法的趨勢(shì)。但該方法在完成擴(kuò)增程序后需要進(jìn)行凝膠電泳，這一過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力且在開蓋過(guò)程中極易造成氣溶膠污染，因此在臨床一線實(shí)驗(yàn)室較少應(yīng)用。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）

ELISA是免疫學(xué)診斷中常用的檢測(cè)技術(shù)，已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病檢測(cè)。本方法具有靈敏度高、特異性好、操作較為簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，由于1d內(nèi)可以同時(shí)檢測(cè)幾百上千份標(biāo)本，因此在大型養(yǎng)殖企業(yè)中主要使用該技術(shù)方法評(píng)估疫苗免疫后的抗體水平。但是商品化的ELISA試劑盒主要以進(jìn)口產(chǎn)品為主，成本較高，并且檢測(cè)依賴于實(shí)驗(yàn)室，無(wú)法應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

1.3 血凝、血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HA、HI）

血凝實(shí)驗(yàn)及血凝抑制實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)新城疫、禽流感等禽傳染病的常用方法，也是檢測(cè)家禽免疫抗體水平的常用方法。因其操作簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、無(wú)需儀器設(shè)備和可以對(duì)抗體水平進(jìn)行量化的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于基層飼養(yǎng)場(chǎng)。但該方法僅應(yīng)用于特定的病原，絕大多數(shù)疫病不適用，1%紅細(xì)胞懸液的制備需要新鮮配制和保存，結(jié)果判讀主觀性較強(qiáng)。

1.4 瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)主要原理是利用擴(kuò)散原理，將可溶性抗原與抗體分別加入在半固體瓊脂孔內(nèi)，緩慢擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體對(duì)應(yīng)且比例適宜則形成白色沉淀線為陽(yáng)性結(jié)果，否則為陰性結(jié)果。此方法非常經(jīng)典，目前仍應(yīng)用于馬立克氏病等傳染病檢測(cè)。其缺點(diǎn)是需要過(guò)夜反應(yīng)，耗時(shí)長(zhǎng)，靈敏度欠佳。

2 LAMP檢測(cè)方法的教學(xué)應(yīng)用

在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域LAMP技術(shù)最早大規(guī)模應(yīng)用于水產(chǎn)病原微生物檢測(cè)，未引起足夠重視。伴隨著基于LAMP技術(shù)的非洲豬瘟病毒檢測(cè)試劑盒獲得農(nóng)業(yè)部的新獸藥證書并在基層得到大量使用，LAMP技術(shù)已被普遍接受和認(rèn)可。為了適應(yīng)技術(shù)進(jìn)步，緊跟發(fā)展趨勢(shì)，作為畜牧獸醫(yī)相關(guān)專業(yè)的學(xué)生有必要了解LAMP技術(shù)。

2.1 基本內(nèi)容

本課程以實(shí)踐應(yīng)用為導(dǎo)向，教師結(jié)合案例帶領(lǐng)學(xué)生分析豬塞內(nèi)加谷病的流行病學(xué)特征、臨床癥狀、病理變化以及設(shè)計(jì)LAMP方法的方案。

2.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

①了解豬塞內(nèi)加谷病毒的流行情況、致病性和預(yù)防措施；②掌握環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)的原理及操作方法；③建立豬塞內(nèi)加谷病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法。

2.3 實(shí)驗(yàn)原理

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)利用識(shí)別多區(qū)域特異性引物組和具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65℃左右等溫條件下30min即可擴(kuò)增109～1010拷貝的靶序列。在反應(yīng)體系中加入指示劑，可裸眼觀察判斷結(jié)果。

2.4 試劑與儀器

2×Lamp Master Mix購(gòu)自哈爾濱新?；驒z測(cè)有限公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；豬塞內(nèi)加谷滅活病毒由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所提供；金屬浴購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份有限公司。

2.5 實(shí)驗(yàn)方法

以豬塞內(nèi)加谷病毒作為檢測(cè)對(duì)象。

序列查找和引物設(shè)計(jì)：從Genbank上查找并下載豬塞內(nèi)加谷滅活病毒VP1基因序列，將序列遞交到在線網(wǎng)站http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.htm l自動(dòng)生成多個(gè)LAMP引物組合，評(píng)分最高的引物序列委托上海生工合成。

核酸提取：按RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取滅活病毒中的RNA，測(cè)定RNA濃度和純度。

按以下組分配置反應(yīng)混合液，轉(zhuǎn)入0.2mLPCR管中：

2×HNB Iso Amp Mix 12.5μL；

10×LAMPPrimerMix 2.5μL；

5M Beta in 2μL；

模板DNA 1μL；

Bst 2.0DNA Polymerase 1μL；

dd H2O補(bǔ)充至25μL。

Bst 2.0DNA Po lymerase 1μL；dd H2O補(bǔ)充至25μL。

將配置好的反應(yīng)液充分混勻并瞬時(shí)離心，置于65℃金屬浴中，30min后觀察顏色變化。若擴(kuò)增樣本為陽(yáng)性則由紫羅蘭色變?yōu)樘焖{(lán)色（圖1）。

圖1 豬塞內(nèi)加谷病毒LAMP檢測(cè)結(jié)果

2.6 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及的病原為新發(fā)傳染病，一般教材中未涉及該病原，需要老師課前與學(xué)生查閱相關(guān)參考文獻(xiàn)了解豬塞內(nèi)加谷病毒的背景信息。實(shí)操過(guò)程中按4～6人每組進(jìn)行分組，鼓勵(lì)組內(nèi)分工協(xié)作，共同完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，組間進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證LAMP技術(shù)的穩(wěn)定性。在結(jié)果判讀結(jié)束后，教師提供非洲豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬等其他病原序列，供學(xué)生進(jìn)一步演練引物設(shè)計(jì)環(huán)節(jié)。最終通過(guò)組內(nèi)匯總分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

本次從畜牧獸醫(yī)行業(yè)實(shí)際需求出發(fā)，理論與實(shí)踐相結(jié)合。在課前要求學(xué)生查閱文獻(xiàn)資料了解豬塞內(nèi)加谷病毒和LAMP技術(shù)相關(guān)知識(shí)，由學(xué)生自主設(shè)計(jì)引物鍛煉了學(xué)生分析問(wèn)題、解決問(wèn)題的能力。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，進(jìn)一步鞏固了核酸提取、反應(yīng)體系配制等分子生物學(xué)相關(guān)技能，提高了學(xué)生的動(dòng)手能力和團(tuán)隊(duì)協(xié)作能力。在課后的案例分析中，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)臨床案例進(jìn)行分析討論，舉一反三，強(qiáng)化了科學(xué)分析能力并增強(qiáng)了學(xué)生自主學(xué)習(xí)的積極性。為后續(xù)專業(yè)課程的學(xué)習(xí)及日后就業(yè)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 結(jié)語(yǔ)

目前《動(dòng)物疫病防控》實(shí)訓(xùn)內(nèi)容中的疫病實(shí)驗(yàn)室診斷側(cè)重于PCR方法、ELISA法和HA/HI實(shí)驗(yàn)進(jìn)行動(dòng)物疫病診斷，而臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了一些新檢測(cè)技術(shù)，LAMP技術(shù)在臨床應(yīng)用廣泛，將其應(yīng)用于《動(dòng)物疫病防控》課程，可以為學(xué)生提供一個(gè)相對(duì)真實(shí)的動(dòng)物疫病診斷環(huán)境，將理論和實(shí)踐結(jié)合起來(lái)，對(duì)學(xué)生的應(yīng)變能力和技能熟練度要求較高，提高實(shí)踐動(dòng)手能力，在實(shí)驗(yàn)中考察學(xué)生檢測(cè)技能，從而提高學(xué)生的學(xué)習(xí)效率和教習(xí)效果。█