lncRNA SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中的表達及其對炎癥因子分泌的影響

劉楓，張韓，李彥明，魯雪麗

(河南大學淮河醫院a.重癥醫學科；b.心血管內科，河南 開封 475000)

膿毒癥是由于微循環障礙、細胞凋亡等多種原因引起的全身多個器官功能異常的疾病，凝血異常、心血管反應失調、內皮功能障礙是膿毒癥的常見特征，心臟是膿毒癥最常見的受損器官之一，約有50%的膿毒癥患者伴有心肌損傷[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是常見的體外誘導膿毒癥心肌細胞損傷的因子，心肌細胞分泌炎癥因子和過度凋亡是膿毒癥心肌損傷發生的關鍵機制[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度超過200個核糖核苷酸的長鏈非編碼RNA，通過RNA的形式調控多個生理活動，如細胞凋亡、新陳代謝、血管再生、心臟老化、胚胎發育等[3]。很多研究已報道，lncRNA與缺氧復氧心肌損傷、膿毒癥心肌損傷、糖尿病心肌病等心臟疾病有關[4]。以前的研究發現，lncRNA SLC8A1-AS1在心肌梗死中表達下調，而上調SLC8A1-AS1可改善心臟功能，減少炎癥因子分泌，縮小心肌梗死面積，SLC8A1-AS1可能是心肌損傷的保護因子[5]。現階段對SLC8A1-AS1在膿毒癥心肌細胞損傷中的作用還不清楚。本研究首先檢測了膿毒癥大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1的表達，并以LPS誘導構建體外膿毒癥心肌細胞模型，探討SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細胞炎癥因子分泌的影響，為靶向分子治療膿毒癥心肌損傷提供方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料清潔級SD大鼠購自鄭州大學動物實驗中心，體質量180～200 g，雌雄各半。動物生產許可證號：SCXK(豫)2018-001，動物使用許可證號：SYXK(豫)2018-005，動物質量合格證號：0050472。大鼠心肌H9C2細胞購自深圳市拓普生物科技有限公司；TNF-α含量檢測試劑盒購自深圳市科潤達生物工程有限公司；IL-6含量檢測試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；RNA反轉錄試劑盒購自大連TaKaRa；IL-1β含量檢測試劑盒購自上海研謹生物科技有限公司；p65抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology。陰性對照表達載體(pcDNA)、SLC8A1-AS1過表達載體(pcDNA-SLC8A1-AS1)均由武漢金開瑞生物工程有限公司構建。本實驗符合動物倫理學標準，并經河南大學淮河醫院實驗動物倫理委員會審查通過。

1.2 膿毒癥心肌損傷大鼠模型構建Model組大鼠按照下述方法構建[6]：用100 g·L-1的水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠仰臥置于操作臺上，消毒，于大鼠的前腹部中線進行3 cm剖腹手術，將腹腔打開，分離盲腸，以3.0無菌絲線結扎盲腸，并用16號針頭將結扎位置對穿2次，擠壓盲腸，觀察穿孔位置出現少量糞便時，將盲腸返回，縫合，關腹，將切口消毒。Normal組大鼠不做穿刺，其余同Model組。最后每組大鼠剩余9只。各組大鼠在造模后24 h再次以水合氯醛麻醉，處死，打開胸腔，留取心肌組織，用于1.3中檢測。

1.3 qRT-PCR方法檢測膿毒癥大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1表達采用Trizol提取心肌組織中的總RNA，以RNA反轉錄試劑盒獲得第1條cDNA，反轉錄體系如下：1 μL總RNA、1 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser、6 μL RNase free ddH2O，42 ℃孵育2 min。在上述體系中加4 μL 5×PrimerScript Buffer、1 μL RT Primer mix、1 μL PrimerScript RT Enzyme mixI、10 μL Reaction mix before，最后加RNase free ddH2O至20 μL，37 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 s，置于4 ℃保存。取cDNA，配制如下體系：2 μL上游和下游引物、5 μL cDNA模板、0.4 μL DYE Ⅱ、10 μL 2×SYBR RT-PCR mix，最后加ddH2O至20 μL。置于PCR儀中，設置程序為：95 ℃ 30 s(預變性)，95 ℃ 5 s(變性)，60 ℃退火延伸，循環40次。結果以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為參照，以2-△△Ct法計算SLC8A1-AS1的表達。

1.4 細胞轉染和分組將心肌H9C2細胞分成以下幾組。(1)Control組：正常培養。(2)LPS組：實驗0 h時用10 mg·L-1的LPS處理培養。(3)Vector+LPS組：實驗前12 h，在細胞中轉染陰性對照表達載體；實驗0 h時，用10 mg·L-1的LPS處理培養。(4)SLC8A1-AS1+LPS組：實驗前12 h，在細胞中轉染SLC8A1-AS1過表達載體；實驗0 h時，用10 mg·L-1的LPS處理培養。細胞轉染方法按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行。取培養12 h后的Control、LPS、Vector+LPS、SLC8A1-AS1+LPS組細胞，按照1.3中qRT-PCR方法檢測SLC8A1-AS1的表達。

1.5 ELISA法檢測細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平收集培養12 h后的Control、LPS、Vector+LPS、SLC8A1-AS1+LPS組細胞培養液上清，分別用ELISA法檢測培養液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，按照檢測試劑盒的說明書進行檢測。

1.6 NF-κB信號激活劑PMA對SLC8A1-AS1影響心肌細胞的作用檢測取轉染SLC8A1-AS1過表達載體以后的心肌細胞，用10 mg·L-1的LPS和1 μmol·L-1的NF-κB信號激活劑PMA處理培養，記為SLC8A1-AS1+LPS+PMA組，以SLC8A1-AS1+LPS組為參照，用ELISA法檢測細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2 結果

2.1 SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中表達下調Model組大鼠心肌組織中SLC8A1-AS1表達低于Normal組(P<0.05)。SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中表達下調。見表1。

表1 膿毒癥大鼠心肌組織中 SLC8A1-AS1表達變化

2.2 SLC8A1-AS1過表達載體上調膿毒癥心肌細胞模型中SLC8A1-AS1表達與Control組比較，LPS組心肌細胞中SLC8A1-AS1表達降低(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細胞中SLC8A1-AS1表達升高(P<0.05)。見表2。

表2 SLC8A1-AS1過表達載體轉染后膿毒癥心肌細胞模型中SLC8A1-AS1表達

2.3 上調SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細胞模型炎癥因子分泌的影響與Control組比較，LPS組心肌細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α增多(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α減少(P<0.05)。見表3。

表3 上調SLC8A1-AS1后膿毒癥心肌細胞模型分泌IL-1β、IL-6、TNF-α水平

2.4 上調SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細胞模型NF-κB信號的影響與Control組比較，LPS組心肌細胞中p65蛋白表達升高(P<0.05)。與Vector+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS組心肌細胞中p65蛋白表達降低(P<0.05)。見圖1和表4。

圖1 Western blot方法檢測上調SLC8A1-AS1對膿毒癥心肌細胞模型中p65蛋白表達的影響

表4 上調SLC8A1-AS1后膿毒癥心肌細胞模型中p65蛋白水平

2.5 NF-κB信號激活劑對上調SLC8A1-AS1影響膿毒癥心肌細胞炎癥因子分泌的作用與SLC8A1-AS1+LPS組比較，SLC8A1-AS1+LPS+PMA組分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)。見表5。

表5 NF-κB信號激活劑對上調SLC8A1-AS1影響膿毒癥心肌細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α水平

3 討論

非編碼RNA是近些年來生命科學領域中的研究熱點，包含lncRNA、miRNA、環狀RNA等，其中lncRNA是指長度超過200個核糖核苷酸的非編碼RNA，lncRNA在人體組織的各個器官中表達，并且參與多個生理活動，lncRNA與細胞生長、染色質印記、細胞凋亡、炎癥等有關[7]。很多研究已經證實，lncRNA調控人類疾病進展，并且lncRNA有望成為疾病治療的分子靶點[8]。心肌損傷是造成心臟功能異常的關鍵，其受到lncRNA的調控[9]。有研究顯示，SLC8A1-AS1在心肌梗死動物模型中下調，而上調SLC8A1-AS1能夠減輕心肌損傷，縮小梗死面積，抑制炎癥[5]。本研究結果顯示，SLC8A1-AS1在膿毒癥大鼠心肌組織中下調。

膿毒癥是一種全身系統疾病，病死率和發病率極高，心功能不全、心肌抑制等是膿毒癥患者常見的并發癥，心肌損傷也是誘導多個器官衰竭的關鍵因素[10]。研究顯示，膿毒癥心肌細胞釋放大量的炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α，這些炎癥因子可以加重炎癥反應，促進炎癥損傷，另一方面還可以激活細胞凋亡，促進心肌細胞損傷[11]。本研究表明，LPS誘導的體外膿毒癥心肌細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α增多，而上調SLC8A1-AS1能夠減弱LPS對心肌細胞的上述作用，這說明SLC8A1-AS1具有抑制體外膿毒癥炎癥因子釋放的作用。

lncRNA發揮作用的機制較為復雜，目前尚未完全闡明，其可以通過作用于下游基因或信號通路的轉導而發揮多重生物學功能[12]。NF-κB作用復雜，具有多向轉錄調節作用，在哺乳動物體內廣泛存在，參與免疫反應、腫瘤生長、炎癥反應、細胞凋亡等多個過程[13]。NF-κB家族龐大，其中p65是NF-κB信號發揮作用的關鍵亞單位[14]。研究報道，NF-κB過度激活加重心肌細胞損傷，而抑制NF-κB信號能夠減弱心肌損傷[15]。本研究結果顯示，上調SLC8A1-AS1能夠降低體外膿毒癥心肌細胞模型中p65蛋白表達，而NF-κB信號激活劑逆轉了上調SLC8A1-AS1對體外膿毒癥心肌細胞炎癥因子釋放的作用，上調SLC8A1-AS1通過NF-κB信號發揮作用。

綜上，SLC8A1-AS1在膿毒癥心肌細胞損傷中可能發揮保護作用，上調SLC8A1-AS1抑制體外膿毒癥心肌細胞炎癥因子釋放，這與下調NF-κB信號有關。目前尚未分析SLC8A1-AS1通過何種靶向機制影響NF-κB信號發揮作用，在以后研究中會對這部分內容進行探討。本研究為靶向基因治療膿毒癥心肌損傷提供了思路，為研究SLC8A1-AS1在心臟疾病中的作用奠定了基礎。