白楊黃素通過調控氧化應激反應保護脂多糖介導的炎癥環境中人牙周膜干細胞成骨分化能力

夏 冰 洪 滔

根尖周炎是一類發生于根尖周組織的炎癥性疾病，主要是由于病原菌及相關代謝產物與宿主免疫系統相互作用而導致[1-2]。人牙周膜干細胞（hPDLSCs）是一組來源于牙周膜的間充質干細胞，具有分化為成骨細胞、成纖維細胞和牙齒成牙骨質細胞的多能性[3-4]。根尖周炎時，牙周優勢菌脂多糖（LPS）對根尖周軟硬組織造成不同程度的破壞，降低hPDLSCs 的成骨分化能力[5]，然而其相關機制有待進一步研究。同時，研究發現活性氧（ROS）與骨代謝紊亂性疾病密切相關[6]。黃酮類小分子白楊黃素，化學名為5，7-二羥基黃酮，具有顯著的抗病毒、抗過敏、抗腫瘤的作用[7]。研究證實，白楊黃素能夠促進成骨細胞系MC3T3-E1 成骨分化相關基因的表達[8]。然而關于白楊黃素對炎癥微環境下牙周膜干細胞的成骨分化的影響鮮有報道。P.g LPS 是革蘭陰性細菌牙齦卟啉單胞菌細胞壁中具有特殊結構的脂質成分，為牙周病重要毒力因子，使牙周膜干細胞成骨能力降低[9]。本實驗采用P.g LPS 模擬hPDLSCs 炎癥氧化應激環境，通過檢測ROS、抗氧化及成骨因子mRNA 表達水平，探討白楊黃素對炎癥環境狀態下hPDLSCs 成骨分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床根尖周炎組織樣本 選擇2017 年8 月—2017 年12 月就診于浙江省中西醫結合醫院牙體牙髓門診的患者，其無全身系統性疾病，3 個月內未服用抗生素及抗氧化劑，反復進行完善的根管治療后病變未愈合，且牙周探診深度＜3mm，無牙根縱裂，欲行根尖手術的單根牙20 顆。

1.2 主要試劑儀器 牙齦卟啉單胞菌脂多糖（P.g LPS，批號SMB00610，Sigma，美國）；α-MEM 培養基（批號12492-013，Gbico 公司，美國）；Ⅰ型膠原酶（批號17100-017，Invitrogen 公司，美國）、Dispase 酶（批號354235，HyClone 公司，美國）；白楊黃素（純度：≥98%，批號480-40-01，上海西格生物科技有限公司）、MTT 試劑盒（ALP，批號CGD-1，Sigma 公司，美國）；堿性磷酸酶活性測試試劑盒（批號A059-2，南京建成生物工程研究所）；Trizol（批號15596-026，Invitrogen 公司，美國）；PrimeScriptTM RT 試劑盒（批號RR036A，TaKaRa，日本）；SYBR-Green Real time PCR MIX（批號RR820A，TaKaRa，日本）；酶標分析儀（1681130A，Bio-Rad，美國）；倒置顯微鏡（IX73 熒光，Olympus 公司，日本）；實時熒光定量PCR 儀（QuantStudio 7 Flex，賽默飛，美國）。

1.3 分離和培養hPDLSCs 征得患者知情同意，取根中1/3 牙周膜組織，加入3g/L 的Ⅰ型膠原酶和4g/L的Dispase 酶，37℃消化1h。終止消化，將分離的細胞平鋪于6 孔板中，加入含10%胎牛血清的α-MEM培養液2mL，37℃、體積分數5%CO2孵箱中，靜置培養。每3 天換液1 次，棄去未貼壁的細胞。待細胞鋪滿6 孔板底80%后，傳代，實驗均取第4～7 代細胞進行后續實驗。

1.4 成脂誘導 將1×105個hPDLSCs 接種在6 孔培養皿中，次日換成脂誘導液（100nmol/L 地塞米松、10mg/L 胰島素、0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、50mmol/L 吲哚美辛、α-MEM 培養基）進行誘導，每3 天換液1 次。21 天后進行油紅染色，倒置顯微鏡下觀察是否有脂滴形成。

1.5 成骨誘導 將1×105個hPDLSCs 以成骨誘導液（含50mg/L 抗壞血酸、1μmol/L 地塞米松、3mmol/L β甘油磷酸鈉）培養。每3 天換液1 次。連續誘導21 天后進行茜素紅染色，觀察礦化結節形成。

1.6 流式細胞術鑒定hPDLSCs 表面標記物 取第4代hPDLSCs，細胞密度調至2×109/L；將細胞分裝于EP 管中，加入相應的抗體2μL，室溫避光孵育1h，離心棄上清后冷PBS 洗3 次，用500μL 含10%胎牛血清的PBS 重懸，4℃避光保存。用流式細胞儀檢測Stro-1、CD146、CD29、CD105、CD34、CD45 表面標記物的表達情況。

1.7 MTT 檢測不同濃度P.g LPS 及白楊黃素對hPDLSCs 增殖活力的影響 將第4 代hPDLSCs，以3×103個/孔接種于96 孔板，常規培養條件下培養24h 后，對照組細胞用α-MEM 培養基培養，P.g LPS組分別加入1、10、100、1000ng/mL P.g LPS 的α-MEM 培養基繼續培養24、48、72、96h。此外，白楊黃素對hPDLSCs 增殖活力的影響，細胞以3×103個/孔的密度接種于96 孔板24h 后，用白楊黃素（0.1、0.4、1.6、6.25、25、50、100μmol/L）分別作用細胞48、96h。各組到達實驗時間節點后，加入MTT，孵育4h 后加入DMSO 溶解結晶，并室溫下振蕩15min，于酶標儀檢測OD 值，取5 孔平均值進行分析。

1.8 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS 及抗氧化應激因子表達的影響 將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6 孔板常規培養至貼壁。貼壁后，將常規培養液置換為成骨誘導液，將細胞分為成骨誘導組及1000ng/mL P.g LPS+成骨誘導組。誘導培養24、48、72、96h 后，取細胞培養液按ROS 檢測試劑盒的使用說明檢測ROS 的含量。收集細胞，提取RNA，q-PCR 檢測錳超氧化物歧化酶（MnSOD），銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）和過氧化氫酶（CAT）mRNA表達。在此研究基礎上，將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6 孔板常規培養至貼壁。將常規培養液更換為成骨誘導液，將細胞分為成骨誘導組：10% FBS 的成骨誘導液普通條件培養；P.g LPS+成骨誘導液組：1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養組；白楊黃素+成骨誘導液+P.g LPS 組：25μmol/L 白楊黃素+1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養液，作用72h 后，再次檢測白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS 及抗氧化應激因子表達。

1.9 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ALP 活性及成骨分化因子表達的影響 將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6 孔板常規培養至貼壁。將細胞分為三組，分別為常規10% FBS 的α-MEM 培養液培養組；10% FBS 的成骨誘導液培養組；1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養組。分別于第3、7、14 天按ALP 活性檢測試劑盒的使用說明檢測ALP 活性。收集細胞，提取細胞總RNA，q-PCR 檢測細胞Runt 相關轉錄因子2（RUNX2）、鋒指結構轉錄因子（OSX）、ALP 和骨鈣素（OCN mRNA）表達。在此研究基礎上，將第4 代細胞按1×105個/孔接種于6孔板常規培養至貼壁。將常規培養液更換為成骨誘導液，將細胞分為成骨誘導組：10% FBS 的成骨誘導液普通條件培養；P.g LPS+成骨誘導液組：1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養組；白楊黃素+成骨誘導液+P.g LPS 組：25μmol/L 白楊黃素+1000ng/mL P.g LPS 的10% FBS 的成骨誘導液培養液，作用72h 后，再次檢測白楊黃素對P.g LPS介導hPDLSCs 的ALP 活性及成骨分化因子表達。

1.10 q-PCR 以Trizol 試劑提取P.g LPS 或白楊黃素處理細胞總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA 反轉錄成互補脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA），然后按試劑說明書進行PCR 擴增，反應在實時熒光定量PCR 儀上進行。PCR 反應條件為預變性95℃，0.5min，1 個循環；變性95℃，0.05s，退火60℃，34s，延伸95℃，0.15s，共40 個循環，終延伸60℃，1min。之后采用2-ΔΔCt法計算目的基因MnSOD、Cu/ZnSOD、CAT、RUNX2、OSX、ALP、OCN 相 對 表 達量，各基因引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 實時熒光定量PCR 引物序列

1.11 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行統計分析，數據采用均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用兩個獨立樣本的LSD-t 檢驗，多組間樣本比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行統計分析；P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞術檢測hPDLSCs 采用酶解組織消化培養的原代細胞，3～7 天即有細胞由組織周圍爬出。進一步以有限稀釋法獲得較為純化的hPDLSCs。該細胞呈紡錘型，旋渦狀生長。成脂誘導21 天，發現紅色脂滴（見圖1A）。成骨誘導21 天后，茜素紅染色hPDLSCs 形成紅色礦化結節（見圖1B）。流式細胞儀結果顯示，第4 代hPDLSCs 表面抗原Stro-1、CD146、CD29、CD105 均為陽性，CD34、CD45 均為陰性（見圖1C）。

圖1 分離和鑒定牙周膜干細胞

2.2 P.g LPS 對hPDLSCs 增殖能力的影響 MTT 結果顯示，與對照組比較，1000ng/mL P.g LPS 在作用72、96h 后，hPDLSCs 增殖能力隨之減弱（P 均＜0.05）。因此，本研究選用1000ng/mL P.g LPS 作用hPDLSCs 進行后續實驗。見表2。

表2 P.g LPS 對hPDLSCs 增殖能力的影響（OD 值，±s）

表2 P.g LPS 對hPDLSCs 增殖能力的影響（OD 值，±s）

注：對照組為PBS 處理24h；P.g LPS A 組為1ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS B 組為10ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS C 組為100ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS D 組為1000ng/mL P.g LPS 分別處理24、48、72、96h；P.g LPS為牙齦卟啉單胞菌脂多糖；hPDLSCs 為人牙周膜干細胞；OD 為光密度；與對照組同期比較，aP＜0.05；與同組作用24h 時比較，bP＜0.05

2.3 白楊黃素對hPDLSCs 活力的影響 與白楊黃素對照組比較，50 和100μmol/L 的白楊黃素處理hPDLSCs 48、96h 后顯著降低hPDLSCs 增殖活性（P均＜0.05）；因此，本研究選用25μmol/L 的白楊黃素處理hPDLSCs 進行后續實驗，見表3。

表3 白楊黃素對hPDLSCs 細胞活力的影響（%，±s）

表3 白楊黃素對hPDLSCs 細胞活力的影響（%，±s）

注：白楊黃素對照組為PBS 分別處理48、96h；白楊黃素A 組為0.1μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素B 組為0.4μmol/L白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素C 組為1.6μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素D 組為6.25μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素E 組為25μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素F 組為50μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；白楊黃素G 組為100μmol/L 白楊黃素分別處理48、96h；與白楊黃素對照組比較，aP＜0.05

2.4 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 氧化應激的影響 ROS 含量檢測結果顯示，與成骨誘導液培養細胞比較，P.g LPS 作用的細胞ROS 含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；MnSOD、Cu/ZnSOD和CAT mRNA 表達水平在72、96h 明顯降低（P＜0.05），見表4。

表4 P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT mRNA 表達的影響（±s）

表4 P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT mRNA 表達的影響（±s）

注：ROS 為活性氧；MnSOD 為錳超氧化物歧化酶；Cu/ZnSOD 為銅鋅超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化氫酶；與成骨誘導液組同期比較，aP＜0.05

此外，P.g LPS+成骨誘導液+白楊黃素組與P.g LPS+成骨誘導液組比較，白楊黃素顯著逆轉氧化應激因子的表達（P 均＜0.05）。見表5。

表5 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT 表達的影響（±s）

表5 白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs 的ROS、MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT 表達的影響（±s）

注：ROS 為活性氧；MnSOD 為錳超氧化物歧化酶；Cu/ZnSOD 為銅鋅超氧化物歧化酶；CAT 為過氧化氫酶；與成骨誘導液組比較，aP＜0.05；與P.g LPS+成骨誘導液組比較，bP＜0.05

2.5 白楊黃素對P.g LPS 介導的hPDLSCs 成骨分化的影響 在成骨誘導液作用hPDLSCs 第7、14 天，ALP mRNA 檢測結果顯示，成骨誘導液組ALP 含量顯著高于α-MEM 培養液組（P＜0.05）；與成骨誘導液組比較，P.g LPS+成骨誘導液組ALP mRNA 顯著降低（P＜0.05）。PCR 結果顯示，與α-MEM 培養液組比較，3、7、14 天成骨誘導液組RUNX2、OSX、OCN 和ALP 活性表達水平顯著升高（P 均＜0.05）；P.g LPS+成骨誘導液組RUNX2、OSX、OCN 和ALP 活性表達水平顯著低于成骨誘導液組（P 均＜0.05）。見表6。

表6 P.g LPS 介導hPDLSCs 對成骨分化基因表達水平的影響（±s）

表6 P.g LPS 介導hPDLSCs 對成骨分化基因表達水平的影響（±s）

注：RUNX2 為Runt 相關轉錄因子2；OSX 為鋅指結構轉錄因子；ALP 為堿性磷酸酯酶；OCN 為骨鈣素；與α-MEM 培養液組比較，aP＜0.05；與成骨誘導液組比較，bP＜0.05

與P.g LPS+成骨誘導液組比較，P.g LPS+成骨誘導液+白楊黃素組RUNX2 和OSX mRNA 表達顯著升高（P 均＜0.05），OCN 和ALP mRNA 表達水平，雖呈現一定的升高趨勢但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表7。

表7 白楊黃素對P.g LPS 介導的hPDLSCs 細胞RUNX2、OSX、OCN、ALP mRNA 表達水平的影響（±s）

表7 白楊黃素對P.g LPS 介導的hPDLSCs 細胞RUNX2、OSX、OCN、ALP mRNA 表達水平的影響（±s）

注：RUNX2 為Runt 相關轉錄因子2；OSX 為鋅指結構轉錄因子；ALP 為堿性磷酸酯酶；OCN 為骨鈣素；與成骨誘導液組比較，aP＜0.05；與P.g LPS+成骨誘導液組比較，bP＜0.05

3 討論

根尖周炎是口腔中常見的炎癥性骨疾病。研究顯示，根尖周炎發病過程中牙槽骨的損傷程度與ROS 水平密切相關[10]。ROS 是細胞呼吸代謝過程中產生的一類含有超氧離子化學物的總稱，化學性質活潑。在細菌感染過程中，宿主細胞會產生大量ROS，在機體細胞信號傳導、組織代謝以及炎癥性疾病的組織損傷過程中發揮著關鍵作用[11]。一方面O2-、H2O2和NO 等超氧離子的產生能夠調控宿主體內的免疫細胞識別、消滅病原菌，成為宿主抵抗病原菌感染的關鍵分子；另一方面它們通過直接氧化病損區正常組織細胞內的蛋白質、DNA、RNA 及細胞膜內的脂質成分從而破壞細胞結構、抑制線粒體功能等途徑間接激活細胞內的凋亡信號通路，導致細胞凋亡，從而造成病損區的組織氧化損傷[12]。隨著根尖周炎病程的發展，效應細胞內線粒體功能出現紊亂，導致機體應激性地上調效應細胞內ROS 的水平，對牙周軟硬組織造成嚴重破壞[13-14]。研究表明，患者通過牙周基礎治療有效改善牙周狀況的同時，患者血漿中ROS 水平將會顯著下降[15]，進一步提示ROS 與根尖周炎病損區的骨組織損傷密切相關。因此，我們推測在根尖周炎疾病的發生發展過程中ROS 是重要的炎癥介質，有效清除過量的ROS 在根尖周炎的損傷修復中可能發揮了重要作用。

hPDLSCs 為牙周組織中的成體干細胞，其在外界刺激或疾病狀態下，通過不斷增殖分化維護牙周組織穩態及骨再生修復。在本研究中，應用P.g LPS處理hPDLSCs，發現1000ng/mL 的P.g LPS 作用hPDLSCs 72 和96h 后均顯著降低細胞增殖活性；另一方面，隨著作用時間增長，P.g LPS 顯著增加hPDLSCs 的ROS 含量水平，及顯著地降低MnSOD、Cu/ZnSOD、CAT、RUNX2、OSX、OCN 和ALP mRNA表達水平。此外，MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT 被認為是機體清除ROS 的重要調節酶[16]。RUNX2 是骨形成的核心基因，是間充質干細胞成骨分化的重要指標[17]。OSX 與成骨細胞分化和骨形成相關的特異性轉錄因子，只在發育的骨組織中特異性表達[18]。OCN 為存在于骨組織中豐富的非膠原蛋白，是骨代謝及骨細胞活性的特異性指標，其表達量反映骨形成的速率[19]。ALP 是參與骨等礦化組織代謝以及再生的特異性酶[19]。上述結果表明P.g LPS 作用hPDLSCs 引起ROS的增加，可能是導致hPDLSCs 成骨分化能力降低，促進骨組織損傷的重要原因之一。

筆者前期研究發現，白楊黃素能夠顯著促進成骨細胞系MC3T3-E1 細胞的成骨向分化過程[8]。此外，本實驗結果表明，白楊黃素顯著降低P.g LPS 介導的hPDLSCs 細胞ROS 含量，并增強MnSOD、Cu/ZnSOD 和CAT mRNA 表達水平。同時，白楊黃素對成骨基因RUNX2、OSX、OCN 和ALP 表達具有明顯的促進作用，說明白楊黃素可能通過干預ROS 的產生促進hPDLSCs 的成骨分化潛能，但白楊黃素具體作用機制尚有待進一步實驗驗證。

綜上所述，白楊黃素對P.g LPS 介導hPDLSCs的ROS 產生具有一定的抑制作用，并且促進hPDLSCs 的成骨分化因子表達水平，從而改善根尖周炎病情。提示白楊黃素可能作為根尖周炎的治療用藥；然而，在炎癥環境下，其增強hPDLSCs 成骨分化能力具體的分子機制仍有待進一步闡明。