湖州地區獻血人群隱匿性乙型肝炎病毒感染的血清學特征及分子機制研究

莫艷萍 施旭斌 費靜嫻 楊海英

全球約有3 億人感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），我國為HBV 高流行區，HBV 感染率約占33%[1]。雖隨乙肝疫苗接種的普及，HBV 母嬰傳播減少，人群乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）攜帶率降低，但一般人群HBsAg 陽性率仍高達7.1%[2]。以往常將血清HBsAg 陽性作為判定是否感染HBV 的依據。自首例報道HBsAg 陰性供血者血液引起HBV 感染以來，血清HBsAg 轉陰代表HBV 清除的觀點受到質疑。后續較多報道均提出隱匿性HBV 感染（Occult HBV infection，OBI）現象存在，且OBI 被認為是導致輸血傳播HBV 的關鍵原因，此類患者除血清轉換前的窗口期外，機體均存在HBV DNA，但HBsAg 無法檢出感染，常表現為陰性，乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，抗-HBc）呈陽性或陰性[3-4]。研究發現，OBI 與獻血者HBV 再激活及受血者輸血感染HBV 有關，獻血人員隱匿性HBV 感染可能為HBV 傳播潛在傳染源[5]。調查發現，OBI 在不同地區、不同人群中流行存在區別，病毒基因型分布存在地域特點[6]。發生OBI 分子學機制可能與小S基因變異有關[7]。本研究分析浙江省湖州地區獻血人群OBI 數據，以了解當地無償獻血人群中OBI 血清學特點及分子生物學特征，報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2018 年1 月—2019 年9 月浙江省湖州市中心血站無償獻血者獻血標本，均符合獻血者健康檢查要求（GB18467-2011）中相關規定[8]。全部樣本經HBsAg 與丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）初篩合格后，采集肘靜脈血標本7mL，抗凝后保存。OBI 確認標準：HBsAg 陰性，核酸檢測（NAT）陽性，補充鑒別試驗HBsAg 陰性，HBV-DNA 陽性；血液標本乙肝表面標志物1 種或多種跟蹤、回溯時無明顯改變；乙肝血清表面標志物全陰，追蹤回溯仍全陰[9]。共獲得30 份HBsAg 陰性而NAT 陽性標本，作為OBI 組。并收集30 份HBsAg初、復檢均陽性而NAT 陽性標本作為陽性對照組。

1.2 主要試劑與儀器 HBsAg 診斷試劑盒[酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），初篩：上海科華生物工程股份有限公司（2016716），復篩：美國雅培公司（YS02190B）]，乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）、乙型肝炎e 抗原（hepatitis B E antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗體（hepatitis B E antibody，抗-HBe）、抗-HBc 檢測試劑盒[初篩：電化學發光法，瑞士羅氏公司（182213、150464、044258、179963）；復篩：ELISA 法，美國雅培公司（J05475、J04829、J05675、J12475）]，ALT 檢測試劑盒[初篩：上海科華生物工程股份有限公司（150494），復篩：澳斯邦生物工程有限公司（J26471）]，HBV 病毒DNA 提取試劑盒（購自瑞士羅氏公司，K00918），HBV 病毒載量定量測定試劑盒（購自大連寶生物工程有限公司，152513），TaKaRa Taq/TaKaRa LA Taq（均購自大連寶生生物工程有限公司），Expand High Fidelity PCR system（瑞士羅氏公司），病毒核酸擴增檢測（nucleic acid amplification test，NAT）篩查試劑盒[初篩：上海浩源生物科技有限公司（181365）；復篩：瑞士羅氏公司（K00918）]；諾華TIGRIS 全自動NAT 儀（購自美國諾華公司），Xantus-200型全自動加樣儀（購自瑞士Sias 公司），Microlab FAME 全自動酶免分析系統（購自瑞士Hamilton 公司），cobas e411型電化學發光檢測儀（購自美國羅氏公司），ABI 9700型巢式（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀（購自德國ABI 公司），電泳儀（北京六一儀器廠）；引物設計及合成由上海生工生物工程有限公司完成。

1.3 方 法

1.3.1 血清學檢測 全部血樣均由浙江省湖州市中心血站收集，采用ELISA 法進行HBsAg 檢測，所有血樣均采用國產與進口雙試劑初篩與復篩，所有血源性篩查試劑盒均為國家制定權威機構批檢合格，嚴格按試劑盒使用說明操作，判讀結果。采用化學發光法檢測抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc，抗-HBc復篩采用ELISA 法，初篩、復篩結果均陽性判定為抗-HBc 陽性。

1.3.2 NAT 檢測 排除血清學檢查不合格樣本，采用諾華TIGRIS 全自動NAT 檢測系統對獻血者標本進行三聯熒光病毒單人份NAT 檢測，對ELISA 陰性但NAT 陽性的反應性標本補充做核酸鑒別試驗，鑒別試驗結果為HBV DNA 陽性，最終判定為HBsAg陰性，HBV DNA 陽性。

1.3.3 HBV 病毒提取及定量檢測 參照HBV基因提取試劑盒提取OBI樣本HBV DNA 核酸，取200μL HBsAg 陰性/HBV DNA 陽性標本，并選擇HBsAg 陽性、HBV DNA 雙陽性標本作為陽性對照，提取450μL DNA 抽提液+4μL 內標溶液自離心管內，HBV 質控樣品購自北京康徹思坦生物技術有限公司，振蕩混勻，瞬時離心，100℃溫浴10min，冷卻5min，13800g 離心5min，取上清液20μL 加入PCR反應孔，上PCR 儀進行HBV-DNA 定量分析，反應體系：模板DNA 5μL+上下游引物各1.5μL+DNA Mix 12.5μL+探針0.4μL+雙蒸水補足至25μL，PCR擴增反應條件：95℃ 10min，95℃ 30s，55℃ 60s，42個循環。

1.3.4 HBV S 區基因擴增與測序 preSS 區基因半巢式PCR 擴增，未擴增成功樣本繼續行S 區巢式PCR 擴增（引物見表1），preSS 區擴增體系（第1輪）：LA 10×Buffer 2μL+dNTP 0.8μL+上下游引物各0.4μL+LA Taq 0.2μL+超純水11.2μL+模板5μL，反應條件：94℃4min，94℃30s，58℃30s，72℃3min，34 個循環，72℃10min。第2 輪反應體系：LA 10×Buffer 2μL+dNTP 0.8μL+上下游引物各0.4 μL+LA Taq 0.2μL+超純水14.2μL+模板2μL，反應條件：94℃ 4min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 3min，24 個循環，72℃10min。S 區擴增體系（第1 輪）：10×NH4 Buffer 2μL+50mM MgCl2 1μL+dNTP 0.25μL+上下游引物各2μL+BioTaq 0.5μL+超純水2.25μL+模板10μL，反應體系（第1 輪）：10×NH4 Buffer 2μL+50mM MgCl2 1μL+dNTP 0.25μL+上下游引物各2μL+BioTaq 0.25μL+超純水7.5μL+模板5μL，反應條 件：95℃ 2min，94℃ 20s，55℃ 30s，72℃ 45s，38個循環，72℃10min，擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳，陽性條帶切膠回收，回收產物送檢測序。

表1 引物序列

1.3.5 OBI樣品基因分型 登錄NCBI 網站genotyping 頁面對測序獲得序列進行HBV基因分型，采用MEGA 5.2 軟件對OBI 組與陽性對照組核苷酸、氨基酸序列進行比對。

1.4 統計學方法 應用SPSS 20.0 軟件分析數據，計量數據用均數±標準差（±s）表示，組間t 檢驗，多組比較方差分析，計數數據率（%）表示，組間率比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率分析，雙側P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 湖州市無償獻血標本OBI 檢出情況、一般資料及血清學特點 2018 年1 月—2019 年9 月浙江省湖州市中心血站共采集無償獻血標本109560 份，其中HBsAg 初、復篩均陰性而NAT 陽性標本共檢出30 份，檢出率為0.027%（30/109560）。OBI 血清學模式：抗-HBc（+）/抗-HBs（-）12 例（40.00%），抗-HBs（+）/抗-HBc（+）8 例（26.67%），抗-HBs（+）/抗-HBc（-）3 例（10.00%），抗-HBc（-）/抗-HBs（-）7 例（23.33%），不同血清學模式OBI 患者年齡、性別、ALT、獻血次數等資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 浙江省湖州市OBI 無償獻血者一般資料與血清學特點

2.2 湖州市無償獻血者OBI 血樣本血清學特點30 份OBI 標本HBV-DNA 病毒載量區間為8～1751（中位數268.33）IU/mL，ALT 范圍為10～36（中位數18.13）U/L，見表3。

表3 浙江省湖州市無償獻血者OBI 血樣本血清學篩查結果

2.3 湖州市無償獻血者OBI 血樣本分子生物學檢測結果 30 份OBI 無償獻血樣本中29 份（96.67%）標本S 區擴增成功，2 份（6.67%）全基因型擴增成功，23 份（76.67%）BCP/PC 擴增成功，S 區、BCP/PC兩個片段均擴增成功22 份（73.33%）；基因型分型：B型23 例（76.67%），C型5 例（16.67%），未明確分型2例（6.67%）；血清型：adw 共24 例（80.00%），adr 共5例（16.67%），ayr 共1 例（3.33%），見表4。

表4 浙江省湖州市OBI 無償獻血者樣本分子生物學檢測結果

2.4 OBI 組與陽性對照組HBV基因型分布比較OBI 組與陽性對照組HBV基因型均以B基因型占優勢，兩組基因型分布比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

表5 OBI 組與陽性對照組HBV基因型分布比較[例（%）]

2.5 OBI 組與陽性對照組S 區序列結果比較 采用MEGA 5.2 軟件將獲得OBI 組獲得序列與陽性對照組序列進行同源性比對，序列范圍為NT241～685，片段長度445bp，翻譯為氨基酸序列33～177AA，兩組小S 區基因HBsAg 主要親水結構域氨基酸突變情況（見表6）。OBI 組29 例擴增、測序成功，小S 區18例（62.07%）均伴不同程度氨基酸突變，2 例（6.90%）OBI 提前形成終止密碼子；陽性對照組小S區10 例（33.33%）出現氨基酸突變，變異位點與OBI不相同，1 例（3.33%）提前形成終止密碼子，OBI 組S區突變率高于陽性對照組（χ2=4.883，P=0.027）。

表6 OBI 組與陽性對照組S 區序列結果對比[例（%）]

3 討論

國內相關統計報道，無償獻血人員OBI 發生率為0.7%～10.6%[10]。本文共收集浙江省湖州市中心血站無償獻血標本109560 份，OBI 檢出30 份，檢出率為0.027%，較上述統計結果偏低，考慮可能與地域差別及OBI 界定區別有關，上述調查HBsAg 檢測均使用國產試劑盒，可能出現HBsAg 假陰性結果。且可能僅檢測HBV 病毒X 區基因組，導致假陽性率增加。而本研究中均使用兩種試劑盒對HBV 感染情況進行初篩、復篩，可減少假陽性出現可能，并通過ELISA 法、化學發光法檢測血清標志物，可提高HBsAg 檢測敏感度與特異度。

前期研究發現，血清學模式中抗-HBc 陽性患者有更高的OBI 檢出率，尤其單獨抗-HBc 陽性者[11]。本次調查顯示，湖州市中心血站檢出30 份隱匿性HBV 感染血標本中抗-HBc（+）/抗-HBs（-）12 例，占40.00%，抗-HBs（+）/抗-HBc（+）8 例，占26.67%，其ALT 均處于正常范圍，HBV-DNA 病毒載量較低，支撐上述研究結果，說明抗-HBc 陽性獻血者HBV 隱匿性感染風險較高，常呈現ALT 正常，HBV-DNA 病毒載量較低的特點。但本研究此項結果與Zhang 等[7]報道的HBV 低流行地區OBI 抗-HBc 陽性率較低的結論存在差別，可能與不同地域HBV 流行性特點存在區別有關，但仍提示抗-HBc 陽性獻血者體內HBV DNA 存在風險較大，需引起重視。且本研究發現，不同血清組OBI 患者年齡、性別、ALT、HBVDNA 病毒載量及獻血情況等資料均無明顯差別，考慮可能與本組OBI 獻血前均已完成ALT、HBsAg 初步篩查有關。在基因型分布方面，本研究OBI 組主要以B型為主，與陽性對照組基因型分布類似，支撐葉賢林等[12]研究提出南方地區HBV基因型主要為B型的結論。血清學分型方面，OBI 均以adw型為主，ayr 相對少見，與呂瑩等[13]調查結果一致。

目前對OBI 發生的機制尚未完全闡明。有研究認為，S 區基因突變所致氨基酸變異與OBI 發生密切相關[14]。本研究發現，OBI 組S 區基因變異所引起氨基酸改變共18 例，占62.07%，高于陽性對照組，支持上述結果。說明OBI 發生與HBV DNA S 區基因位點突變有關。S 蛋白含2 個親水區，系HBsAg 重要表面抗原位點，引起保護性免疫反應的作用。該基因第二個親水區含HBsAg 抗原決定簇“α”決定簇基因，同時也是乙肝疫苗關鍵保護性表位及乙肝免疫球蛋白關鍵靶點，對維持HBsAg 抗原性有重要作用，影響乙肝疫苗、乙肝免疫球蛋白藥效及效力，可保護機體免受病毒感染[15]。單個或多個氨基酸變異均可改變其抗原性，導致氨基酸突變，HBV 野毒株無法產生中和性抗體，造成HBsAg 亞型改變，引起OBI。此類患者變異后，HBsAg 血清濃度低或抗原性改變，通常難以檢出，導致機體單純呈抗-HBs 陽性或抗-HBc 和抗-HBs 同時陽性。

近年研究顯示，OBI 親水區存在較多典型突變位點，包括G145R、P120T、G119R 等[16]。其中G145R為常見突變位點，與S 區變異所致免疫逃逸有密切關聯，直接影響HBsAg 免疫測試試劑反應性。本研究發現，OBI 組S 區變異中G145R 出現頻率較高，支持以上結論，說明此位點突變可能對HBsAg 試劑檢測能力產生影響，導致HBsAg 陰性結果，影響HBV感染判斷。此外，本研究也顯示，無償獻血人群OBI存在多個常見突變位點，包括P105R、S114A、S31N、1150F 等，考慮上述位點氨基酸改變可造成HBsAg活性變化，影響HBV 病毒復制、分泌，干擾HBV 感染能力，說明OBI 發生的機制可能與多基因綜合改變有關。

綜上所述，浙江省湖州市獻血人員中OBI 檢出率為0.027%，抗-HBc 陽性患者OBI 感染率較高，HBV基因型分布以B型為主；HBV S 區基因變異，尤其是HBsAg“α”決定簇氨基酸改變可能為OBI 感染的重要分子學機制，可作為OBI 分子研究的新方向。同時還需注意由于OBI 的存在對輸血安全造成較大隱患，因此，有必要將ELISA 法、NAT 檢測引入血液篩檢體系，以確保輸血安全。但由于本研究所收集OBI 病例數較少，后續將收集更多樣本以進一步補充完善該結論。