辣椒外切多聚半乳糖醛酸酶基因家族的生物信息學分析

馬正寶 劉銘 杜澤光 祈樂 魏兵強

摘要：利用生物信息學分析方法對辣椒Exo-PG基因家族成員的數量、分子特征、亞細胞定位、基因結構、順式作用元件及系統進化進行分析，以明確辣椒Exo-PG基因家族成員。結果表明，辣椒Exo-PG基因家族有49個成員，不均勻分布于13條染色體上，并分為3個亞族;辣椒Exo-PG基因家族成員編碼的蛋白酸堿性各占一半，且均定位于細胞外;該家族成員在啟動子序列中含有激素響應元件、低溫響應元件、厭氧誘導元件等多種順式作用元件。

關鍵詞：辣椒;外切多聚半乳糖醛酸酶;基因家族;生物信息學

中圖分類號：S641.3 ? ? ? 文獻標志碼：A ? ? ? 文章編號：1001-1463（2021）10-0011-08

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.10.004

Bioinformatics Analysis of Exo-polygalacturonase Gene Family in Pepper

MA Zengbao， LIU Ming， DU Zeguang， QI Le， WEI Bingqiang

（College of Horticulture， Gansu Agriculture University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to identify the Exo-PG gene family members in pepper， the number， molecular characteristics， subcellular localization， gene structure， cis acting elements and phylogeny of Exo-PG gene family members in pepper were analyzed by bioinformatics. The results showed that pepper contains 49 Exo- PG ?gene family members， which were distributed unevenly on 13 chromosomes and divided into three subgroups. The Exo- PG gene family members in pepper encode half of the proteins with acid-base properties， and all of them are located extracell. There are many cis-acting elements in the promoter sequence of the family members， such as hormone response element， low temperature response element， anaerobic induction element and so on.

Key words：Pepper; Exo-polygalacturonase; Gene family; Bioinformatics

辣椒（Capsicum annuum L.）原產中南美洲，約于16世紀后期傳入我國。它是重要的蔬菜及調味品，我國栽植面積在200萬hm2以上，并且呈逐年增大的趨勢，對保障我國蔬菜周年供應有著重要作用[1 ]。因此，保障辣椒的產量、品質與周年供應成為重大民生問題。

果膠或果膠物質普遍存在于初生細胞壁和幼小植物組織的中層[2 ]，是細胞維持一定形態結構的重要物質。在花粉發育過程中，包被花粉母細胞、四分體的初生細胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和糖蛋白等組成。花粉內壁是成熟花粉壁的組成部分，其主要成分與初生細胞壁相似。通常情況下，多糖代謝密切參與這些壁的形成和降解，從而參與花粉壁的正常發育[3 ]。在植物體內，廣泛分布于果膠代謝相關的酶，根據其作用底物的不同，可以分為3 種類型，即斷裂多聚半乳糖醛酸中α-1，4-糖苷鍵的解聚酶（PG）、對高甲酯化果膠發揮脫甲酯作用的果膠酯酶以及降解不溶性果膠類物質的原果膠酶[4 ]，目前應用最為廣泛的PG是解聚酶的一種。已有研究表明，PG基因家族的多個成員特異地存在于花粉中，它們可能在花粉成熟和花粉管伸長中發揮重要的作用[5 ]。 PG基因是一大基因家族，目前仍不明確在辣椒中有多少PG家族成員在花粉發育中起作用。根據對底物的酶促作用模式，多聚半乳糖醛酸酶分為兩類，即隨機切割型（內切多聚半乳糖醛酸酶）和末端切割型（外切多聚半乳糖醛酸酶），外切 PG 從多聚半乳糖醛酸鏈的非還原末端逐個水解， 內切 PG 則可從分子中間隨機裂解多聚半乳糖醛酸[6 ]。我們在辣椒全基因組范圍內鑒定和篩選出辣椒外切多聚半乳糖醛酸酶（Exo-PG）基因家族成員，并利用生物信息學方法分析了基因結構，以預測蛋白質理化性質及啟動子區域的順式作用元件，旨在為全面鑒定和認識辣椒Exo-PG基因家族，為后續研究辣椒Exo-PG基因家族成員的生物學功能奠定基礎。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 數據來源

在擬南芥綜合數據庫TAIR（https：//www. arabidopsis.org）上進行搜索關鍵詞“exo-polygalacturonase”，獲取并下載擬南芥exo-poly-

galacturonase基因的蛋白序列。

1.2 ? 方法

1.2.1 ? 辣椒CaExo-PG基因家族鑒定 ? 以下載的擬南芥exo-polygalacturonase基因蛋白序列作為搜索序列，在茄科基因網站（https：//solgenomics.net /tools/blast）進行blastp比對，獲取辣椒的exo-polygalacturonase基因家族蛋白候選序列[7 ]。將候選序列提交至Pfam（http：//pfam.xfam.org/）和SMART進行結構域驗證[8 ]，最終確定CaExo-PG基因家族成員。利用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析CaExo-PG家族成員的蛋白質序列長度、分子量及等電點等理化性質[9 ]。利用Euk- mPLoc 2.0（http：//www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）進行亞細胞定位分析[10 ]。

1.2.2 ? 進化樹、染色體定位和保守基序分析 ? 利用 MEGA-X構建辣椒系統進化樹，構建方法為最大法（Maximum Likelihood，ML）。將Bootstrap 的重復次數設置為1 000，剩余設置選擇默認選項[11 ]。染色體定位分析用MapChart軟件進行。通過MEME網站對CaExo-PG蛋白的氨基酸序列中的保守基序進行分析，參數設置為模體基序長度最小為15 aa、最大為150 aa，保守序列數目最大為6，其他均采用默認參數。

1.2.3 ? 基因結構和啟動子順式作用元件 ? 通過GSDS網站（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）分析辣椒CaExo-PG基因的內含子-外顯子結構及數目[12 ]。利用TBtool工具提取CaExo-PG編碼序列（coding sequence，CDS）的起始密碼子上游2000 bp序列作為啟動子序列，并通過PlantCARE數據庫進行啟動子順式作用元件分析[13 - 14 ]。

2 ? 結果與分析

2.1 ? 辣椒CaExo-PG基因家族的獲取和鑒定

利用生物信息學的方法，從辣椒‘zunla-1全基因組中共鑒定到 49個 CaExo-PG家族成員（表1），根據在染色體的位置，將其名為CaExo-PG1～CaExo-PG49。該基因家族所有成員編碼的蛋白質均含有一個“Glyco hydro 28”結構域，氨基酸數的變化范圍在106～598個，分子量變化范圍在11 415.82～63 472.85，其中CaExo-PG31基因編碼的蛋白質分子量最大，CaExo-PG2最小。等電點介于4.73～9.80，其中有24個成員蛋白質呈堿性，25個成員蛋白質呈酸性。通過亞細胞定位分析，發現該基因家族成員編碼的蛋白質均定位于細胞外。

2.2 ? 辣椒CaExo-PG基因家族

2.2.1 ? 辣椒CaExo-PG基因家族進化樹分析

為了解辣椒Exo-PG基因家族和擬南芥（ATexo）之間的同源關系，構建辣椒、擬南芥 Exo-PG基因家族系統進化樹（圖1）。辣椒CaExo-PG基因家族可分為三個亞家族（Group1、Group2和Group3）。其中第一亞家族有成員21個;第二亞家族有成員19個，第三亞家族有成員9個，ATexo-PG1與CaExo-PG47位于同一亞家族，且具有較高的同源性，說明這兩個基因具有相似的生理學功能。

2.2.2 ? 染色體定位分析 ? 對辣椒CaExo-PG基因家族成員進行染色體定位分析，結果顯示，49個基因分散于辣椒的所有染色體上（圖2）。其中2號、4號、6號、7號、8號、11號染色體上有2個基因;1號染色體上有4個基因;5號、9號、12號、0號染色體上有6個基因;3號染色體上有7個基因。其中0號染色體最長，3號、9號、12號染色體出現基因簇且都分布于染色體上端，3號染色體分布的基因最多。大多數染色體上有2個基因。

2.2.3 ? 保守基序分析 ? 對辣椒CaExo-PG基因家族的蛋白質保守基序進行分析（圖3），共獲得6個保守基序（Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6），其中CaExo- PG24和CaExo-PG25沒有保守基序。絕大多數基因中有Motif1、Motif5分布，說明Motif1與Motif5在該家族基因中發揮重要的作用。Motif2、Motif3、Motif4、Motif6也廣泛分布于該基因家族。

2.3 ? 基因結構和啟動子順式作用元件分析

2.3.1 ? 基因結構 ? 通過GSDS網站分析辣椒CaExo-PG基因的內含子-外顯子結構及數目（圖4）。從基因內含子數目分析，該基因家族成員的內含子數目為1～13個之間，大多數成員具有3～5個內含子，其中CaExo- PG10具有的內含子數目最多，數量為13個。從基因的長度進行分析，CaExo-PG4的長度最長，大于12 kb，CaExo-PG2長度最短，小于1 kb。有3個成員（CaExo-PG12、CaExo-PG35、CaExo-PG9）含有非翻譯區。

2.3.2 ? 啟動子順式作用元件分析 ? 利用PlantCARE數據庫分析了啟動子區域的順式作用元件（圖5）。CaExo-PG家族基因的啟動子順式作用元件可以分為9大類，分別為auxin（生長素）、defense and stress（防御與脅迫）、gibberellin（赤霉素）、low-temperature（低溫響應）、salicylic acid（水楊酸）、anaerobic induction（厭氧誘導）、MeJA（茉莉酸甲酯）、meristem expression（分生組織表達）、endosperm expression（胚乳表達）。其中CaExo-PG9只有厭氧誘導響應元件，CaExo- PG29只有水楊酸響應元件。多數基因含有水楊酸、茉莉酸甲酯和分生組織表達的作用元件。

3 ? 結論與討論

本研究從辣椒全基因組范圍內共鑒定出 49個CaExo-PG 基因，分散排布在辣椒的全部染色體上，其中大多數染色體上有2個基因，3號、5號、9號、12號染色體上端有明顯的基因簇出現。該基因家族的蛋白質分子量為11 415.82～63 472.85，差異較大;等電點介于4.73～9.80，其中有24個基因編碼的蛋白質呈酸性，25個基因編碼的蛋白質呈堿性;亞細胞定位分析發現該基因家族蛋白全定位于細胞外，說明在細胞外發揮重要功能。

利用1個擬南芥和49個辣椒CaExo-PG蛋白序列構建系統進化樹，根據進化樹結果將辣椒CaExo-PG家族成員分為3個亞家族，分別為第一亞家族（Group1）、第二亞家族（Group2）及第三亞家族（Group3）。對CaExo- PG基因家族進行了蛋白保守結構域分析，發現多數蛋白具有Motif1、Motif5，說明Motif1、Motif5在該家族基因中發揮重要功能。結合進化樹分析發現，同一亞族的基因基本含有相似的保守基序。對CaExo-PG基因結構分析，大多數基因具有3～5個內含子，CaExo-PG10含有內含子最多（13個）;在該家族成員中，有3個成員含有非翻譯區，其中基因CaExo-PG12非翻譯區長度最短，CaExo-PG35長度次之，CaExo-PG9最長。

研究發現，多數辣椒CaExo-PG基因含有激素和逆境響應相關順式調控元件（水楊酸、茉莉酸甲酯和分生組織表達），其中CaExo-PG9只有厭氧誘導、CaExo-PG29只有水楊酸響應。基因CaExo-PG4和CaExo-PG49只含有2個作用元件，即水楊酸響應和厭氧誘導;基因CaExo-PG21和基因CaExo-PG43含有作用元件最多，有7個。

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（本文責編：楊 ? ?杰）

收稿日期：2021 - 06 - 15

基金項目：甘肅農業大學省級大學生創新創業訓練計劃項目（S202010733089）;甘肅農業大學科研訓練計劃（SRTP）項目（202012012）。

作者簡介：馬正寶（1998 — ），男，甘肅蘭州人，碩士在讀，研究方向為蔬菜學。Email：2372128737@qq.com。

通信作者：魏兵強（1980 — ），男，甘肅天水人，副研究員，博士，主要從事蔬菜遺傳與分子育種。聯系電話：（0931）7632155。Email：bqwei@gsau.edu.cn。

執 ?筆 ?人：劉 ? 銘。