基于網絡藥理學探討當歸補血湯治療化療所致心肌損傷的機制

劉蘭椿，劉 超，毛啟遠，王 階

化療是治療腫瘤的常用手段，但臨床化療藥物存在較大的毒副作用，其中以嚴重的心臟毒性常見，若病變發生在心肌，病人預后極差，死亡率達48%[1]?；熀蟪霈F的心臟毒性臨床表現多樣，輕者無癥狀，僅出現缺血性心電圖改變，重者發生心肌壞死、致死性充血性心力衰竭[2]?，F階段常用的化療藥物中引起心肌損傷的有柔紅霉素、阿霉素及表阿霉素等，但關于化療藥物造成的心肌損傷機制尚不明確，雖有氧化應激學說、鈣超載及能量代謝障礙學說，但針對兩種假說研發的西藥右丙亞胺、磷酸肌酸等存在對化療病人的總體無進展生存期影響不大、遠期生存率無明顯差異的問題[3-4]，導致臨床許多惡性腫瘤病人最終死于嚴重的心血管并發癥，而非腫瘤本身，故發生機制與防治手段是目前心血管專家與腫瘤專家共同面臨的難題。

化療藥物的副作用屬于藥毒范疇，從中醫學分析，藥毒是強烈的致病因素，藥毒致病最易傷人正氣，病情復雜而兇險，病程漫長且頑固難治[5]。當歸補血湯是補氣生血的經典名方，始載于《內外傷辨惑論》，由黃芪、當歸按5∶1組成。方中重用黃芪益氣托毒，為君藥；當歸養血和營，為臣藥；當歸補血湯具有補氣養血托毒之功效，臨床應用以氣血虛弱、陽氣浮越、脈洪大而虛、重按無力為辨證要點，有研究顯示，當歸補血湯具有保護缺血心肌、促進血管生成等作用[6]。當歸補血湯具有免疫調節作用，可增強機體細胞免疫和體液免疫，恢復化療引起的免疫功能低下[7]。盡管藥理學證明當歸補血湯具有抗腫瘤和保護心血管的作用，但具體機制尚不明確。本研究基于網絡藥理學探討當歸補血湯治療化療所致心肌損傷的可能作用機制。

1 資料與方法

1.1 篩選有效成分及靶基因 檢索中藥系統藥理學技術平臺(TCMSP)數據庫[8]得到當歸補血湯中“當歸”“黃芪”的“ingredients”活性成分，之后基于文獻報道納入生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.05的有效成分，此時貼近當歸-黃芪藥對的藥理學和藥代動力學特征[9]。最終納入“related targets”中相應靶點，并根據Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/)查詢靶點蛋白對應的基因名稱。

1.2 獲取當歸補血湯治療心肌損傷的靶基因 在人類基因數據庫(GeneCards)、人類孟德爾遺傳數據庫(OMIM)、治療靶點數據庫(TTD)、藥物數據庫(DrugBank)中檢索心肌損傷的關鍵詞“myocardial injury”，下載疾病基因文件，之后將當歸、黃芪靶基因分別與疾病基因進行映射，與疾病基因取并集，得到當歸補血湯組方干預心肌損傷的可能靶基因，并繪制Venn圖。

1.3 構建藥物-成分-靶點-疾病網絡 將當歸補血湯治療心肌損傷的靶基因與OB≥30%和DL≥0.05篩選出的當歸補血湯活性成分映射，創建包含“疾病-靶點”“藥物-靶點”“藥物-成分”的“network”文件及描述節點類型的“type”文件，將兩個文件導入CytoScape 3.7.2軟件繪制活性成分-靶點-疾病交互網絡圖。網絡中的節點(node)代表當歸、黃芪活性成分、關鍵靶基因及心肌損傷疾病；邊(edge)代表上述節點之間的相互作用關系。

1.4 構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡 利用STRING整合預測PPI，可視化展示PPI網絡功能[10]。選擇“multiple proteins”輸入關鍵靶基因，對“Homo sapiens”進行檢索，選擇高等置信度為0.950，下載PPI關系圖及tsv文件，并篩選居前30位核心基因。

1.5 靶基因基因本體(GO)及京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析 在R軟件(Version 3.6.1)安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運行，將當歸補血湯治療心肌損傷的關鍵靶基因轉換成entrezID。之后在R軟件安裝“clusterProfiler”和“DOSE”包，根據已轉換的entrezID，以P<0.05，Q<0.05進行關鍵靶基因GO與KEGG功能富集分析，并將結果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

2 結 果

2.1 當歸補血湯有效成分及靶基因 在TCMSP數據庫中檢索當歸、黃芪兩味藥的所有有效成分(截至2020年1月)，結果顯示當歸活性成分共125個、黃芪活性成分共87個。根據OB≥30%和DL≥0.05篩選出當歸活性成分27個、黃芪活性成分32個，共59個活性成分。選擇“related targets”獲得當歸靶點272個、黃芪靶點435個，藥物靶點共707個。

2.2 治療心肌損傷的相關基因 通過GeneCards、OMIM、TTD、DrugBank獲得2 943個心肌損傷相關基因，與272個當歸、435個黃芪的靶基因去重后進行映射，共得到157個當歸補血湯治療心肌損傷的靶基因(與綠色相交部分)，其中得到黃芪治療心肌損傷的可能靶基因154個，當歸治療心肌損傷的可能靶基因40個。詳見圖1。

圖1 當歸補血湯治療心肌損傷相關靶基因Venn圖

2.3 藥物-成分-靶點-疾病網絡構建 將157個心肌損傷治療相關靶基因分別與27個當歸活性成分、32個黃芪活性成分進行映射，建立當歸補血湯活性成分與靶基因的聯系，同時得到治療心肌損傷的24個當歸成分、23個黃芪成分，共涉及有效成分47個，詳見表1。將包含“疾病-靶點”“藥物-靶點”“藥物-成分”的“network”文件和描述節點類型的“type”文件導入到CytoScape 3.7.2中，建立“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，紫色三角代表當歸的24個有效成分，紅色箭頭代表黃芪的23個有效成分，黃色橢圓代表154個相關靶基因。詳見圖2。

表1 當歸補血湯治療心肌損傷的活性成分及OB、DL

圖2 藥物-成分-靶點-疾病網絡(紫色三角代表當歸有效成分，紅色箭頭代表黃芪有效成分，黃色橢圓代表靶基因)

2.4 PPI網絡構建 將關鍵靶基因輸入到STRING中，選擇高等置信度0.950，下載PPI及tsv文件，得到109個基因的PPI網絡，根據R語言的計算結果，其中轉錄因子AP-1(JUN)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(Akt1)、白細胞介素6(IL6)、核轉錄因子(NF)-κB p65亞基(RELA)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)居前5位。詳見圖3、圖4。

圖3 PPI核心基因

圖4 中藥-疾病關鍵靶點(degree值，居前30位)

2.5 關鍵靶基因GO功能富集 通過關鍵靶基因，共富集124個生物學過程和功能，根據校正后P值進行排序，選擇前30個進行條形圖展示，詳見圖5。當歸補血湯有效成分主要參與腎上腺素受體活性、類固醇激素受體活性、G蛋白偶聯的胺受體活性、核受體活性、轉錄因子活性、兒茶酚胺結合、細胞因子受體結合、細胞因子活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合、DNA結合轉錄激活劑活性、磷酸酶結合、激酶調節活性、血紅素結合、蛋白磷酸酶結合等生物過程，進而發揮對心肌損傷的治療作用。

圖5 關鍵靶基因GO功能富集分析

2.6 關鍵靶基因KEGG功能富集 對關鍵靶基因與KEGG進行映射，共富集163條通路，根據校正后P值進行排序，選擇前30個進行氣泡圖展示，詳見圖6。當歸補血湯有效成分主要參與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、MAPK、白細胞介素17、腫瘤壞死因子(TNF)、缺氧誘導因子1(HIF-1)等相關信號通路。其中PI3K/Akt信號通路作為自噬關鍵通路在心肌損傷中起到重要作用。

圖6 關鍵靶基因KEGG功能富集分析

3 討 論

化療易對心肌造成損傷，藥毒傷陰耗氣，導致心氣虛，出現乏力、呼吸困難等癥狀。心臟的正常搏動主要依賴于心氣。心氣作為實現心臟功能的推動力，也是精氣化生的能量、血液運行的動力?！端貑枴て饺藲庀笳摗酚涊d：“心臟血脈之氣也”，心氣充盛，心臟才能進行正常的舒縮活動，以此保持正常的心力、心率和心律，血液才能在脈內正常運行。王冰注《素問·五臟生成篇》記載：“氣行血乃流”?；熀笃谛臍馓撍o力動血，心血不行，心血漸虛，無血液的濡養作用，心臟乃至全身的功能受到影響，最終導致氣血兩虛，易出現胸悶、心悸。

本研究結果顯示，當歸補血湯發揮治療作用的成分包括藁本內酯、β-谷甾醇、阿魏酸、黃芪總黃酮(astraisoflavanin)、槲皮素等。單藥研究顯示，黃芪總黃酮可增加損傷心肌的血流灌注，減輕心肌損傷[11]。當歸揮發油能提高PC12細胞存活率，減少受損細胞酸性自噬泡數量，抑制自噬相關蛋白自噬關鍵分子酵母Atg6同系物(Beclin-1)、自噬相關基因5(Atg5)、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3B)-Ⅱ表達[12]，其中苯酞類藁本內酯(ligustilide)可改善微循環、舒張血管、抗心肌缺血[13]。當歸植物的不同部位含有不同含量的阿魏酸(ferulic acid)，以尾部中含量最高，阿魏酸鈉是傳統活血化瘀中藥當歸和川芎提取物中主要活性成分阿魏酸的鈉鹽，具有活血、補血、抗炎等多種功效[14]。當歸補血湯可促進衰老大鼠血管生成，增加缺血心肌微血管密度，保護損傷心肌，激活PI3K，引起下游Akt進一步表達，信號轉至核內，進而引起心肌血管內皮生長因子mRNA表達[15]。

相關研究顯示，PI3K/Akt介導的自噬上調被認為是蒽環類藥物導致心肌細胞損傷的重要機制之一[16]。有研究顯示，自噬涉及心肌肥厚、心肌疾病和缺血性心臟病等重要心肌病理學變化[17]。自噬的發生包括3個階段：①自噬成核階段，即胞漿形成自噬前體膜樣結構，也稱為吞噬泡(phagophore)；②吞噬泡包裹正常或異常細胞器，形成環狀結構的自噬小體(autophagosome)；③自噬小體形成后將其內容物運輸至溶酶體內，與溶酶體融合形成自噬溶酶體(autolysosome)。哺乳動物細胞內LC3B總量通常不會有較大波動，一般僅出現LC3B-Ⅰ與LC3B-Ⅱ轉換，或由自噬溶酶體導致的LC3B-Ⅱ清除，這些現象均間接反映了細胞自噬流狀態[18]。這兩種情況在免疫印跡法檢測中得到類似結果，但代表了不同的生物學終點。有研究表明，阿霉素作用于H9c2細胞導致自噬蛋白LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ升高，P62表達降低，誘發心臟毒性反應[19]。有研究顯示，阿霉素注射后造成心肌纖維排列紊亂及肌漿空泡化，p-Akt與p-細胞外信號調節激酶(ERK)1/2蛋白水平降低，導致自噬激活、心臟收縮功能下降[20]。當歸補血湯治療心肌損傷的網絡藥理學預測發現，Akt1為PPI網絡的核心基因之一，核心基因的GO基本生物學過程及KEGG通路富集顯示，PI3K/Akt通路是當歸補血湯干預心臟損傷的關鍵通路。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學方法，構建當歸補血湯治療心肌損傷的藥物-成分-靶點-疾病網絡，篩選可能發揮作用的關鍵基因，并進行通路富集，推測當歸補血湯治療心肌損傷可能與PI3K/Akt通路調控的心肌細胞自噬密切相關。