核呼吸因子1多態(tài)性與心力衰竭病人療效及預(yù)后的關(guān)系

包艷春，關(guān)秀軍，王小娟，胡亞丹

心力衰竭是一種由多種原因?qū)е滦呐K收縮功能和(或)舒張功能障礙的復(fù)雜臨床綜合征，我國(guó)35～74歲人群患病率約為0.9%[1]。心力衰竭治療已由以往的強(qiáng)心利尿轉(zhuǎn)變?yōu)橐宰钄嘟桓猩窠?jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素系統(tǒng)為主的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活為主，病人病死率、再次住院率居高不下。有研究認(rèn)為，遺傳變異是導(dǎo)致藥物反應(yīng)個(gè)體差異的重要原因[2]。心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)及功能穩(wěn)定對(duì)維持正常的心臟結(jié)構(gòu)及功能具有重要的作用，在心肌缺血、衰老及心力衰竭病人中均觀察到不同程度的線粒體損傷。相關(guān)研究表明，心力衰竭、心肌病等病理情況下，核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1，NRF-1)在維持線粒體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[3]。NRF-1高表達(dá)有助于心肌細(xì)胞存活，具有增強(qiáng)細(xì)胞呼吸能力和代謝水平，減輕或預(yù)防心力衰竭的發(fā)生。上述研究說明NRF-1表達(dá)在防治心力衰竭中的重要作用。NRF-1基因多態(tài)性直接影響NRF-1基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)。目前，關(guān)于NRF-1基因多態(tài)性與慢性心力衰竭的關(guān)系及藥物干預(yù)后療效研究較少。本研究旨在探討NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與慢性射血分?jǐn)?shù)降低心力衰竭病人藥物干預(yù)療效的關(guān)系，以期為臨床治療慢性心力衰竭提供有效、可靠的治療方案并闡明藥物干預(yù)的部分作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步有效降低心力衰竭再住院率及其他不良事件發(fā)生率提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年3月—2017年6月我院住院并接受治療的射血分?jǐn)?shù)降低心力衰竭(HFrEF)病人136例，均符合《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南2014》[4]制定的慢性心力衰竭診斷標(biāo)準(zhǔn)，且左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<40%。其中男82例，女54例，年齡60～73(66.32±5.96)歲；原發(fā)性疾病：擴(kuò)張型心肌病21例，缺血性心臟病87例，高血壓性心臟病22例，肺源性心臟病6例；紐約心臟病協(xié)會(huì)(NYHA)心功能分級(jí)：Ⅱ級(jí)63例，Ⅲ級(jí)51例，Ⅳ級(jí)22例。所有病人均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡>60歲；NYHA分級(jí)為Ⅰ～Ⅲ級(jí)；入院時(shí)肌酐(Cr)為133～451 μmol/L；LVEF<40%；血壓≥110/60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)不穩(wěn)定；伴有甲狀腺功能亢進(jìn)性心臟病、心源性休克、肺動(dòng)脈重度高血壓、惡性腫瘤、已確定的遺傳性或原發(fā)性血管性水腫；采用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素治療、惡性心律失常；嚴(yán)重肝腎功能不全；血壓<110/60 mmHg，血清鉀>5.4 mmol/L；治療過程中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)或嚴(yán)重并發(fā)癥需要特殊處理。

1.3 治療方法 采用常規(guī)抗心力衰竭治療，包括休息、限鹽、限水。藥物治療：利尿劑托拉塞米，依據(jù)病人尿量調(diào)整劑量；螺內(nèi)酯20 mg，每日1次；依那普利片2.5 mg，每日1次(咳嗽病人更換為厄貝沙坦37.5 mg，每日1次)。心力衰竭癥狀好轉(zhuǎn)后盡早加用琥珀酸美托洛爾緩釋片11.875 mg，每日1次，同時(shí)根據(jù)病人心率、血壓等指標(biāo)變化及時(shí)調(diào)整藥物劑量。治療時(shí)間為6個(gè)月。

1.4 觀察指標(biāo) ①收集病人一般資料，包括年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史(定義為吸煙支數(shù)每日1支以上，且至少連續(xù)吸煙3個(gè)月)、心率、血壓。②生化指標(biāo)：病人入院后抽取肘靜脈血13 mL，其中部分用于生化指標(biāo)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)。采用美國(guó)羅氏公司生產(chǎn)的cobas8000全自動(dòng)化免疫系統(tǒng)測(cè)定肝功能、腎功能；N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP，熒光素增強(qiáng)免疫化學(xué)發(fā)光法，試劑盒購(gòu)自南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(PPARγC1α，酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司)。③心臟彩超：病人入院2 d內(nèi)完成心臟彩超檢查，采用HP5500型彩色多普勒超聲診斷儀，采用雙腔Simpson法測(cè)量LVEF、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWT)。6個(gè)月后再次抽取病人肘靜脈血檢測(cè)上述生化指標(biāo)，復(fù)查心臟彩超。

1.5 基因檢測(cè)方法

1.5.1 NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性 將抽取到的病人血樣標(biāo)本5 mL置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的EP管中，采用常規(guī)酚-氯仿法提取外周血樣本中基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度法確定DNA的濃度及純度(純度為A260/A280≥1.8)并保存于-80 ℃冰箱中備用，采用PCR-RFLP技術(shù)常規(guī)擴(kuò)增外周血基因組DNA，按照Oligo 6軟件設(shè)計(jì)方案，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。NRF-1基因+141 G/T正向引物序列：5′-CGCTAGCTGGCTACGCGTACTACCG-3′，反向引物序列：5′-GTGCCGTAGCTAGCTACGATCGGC-3′。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中含有5 μL的PCR緩沖液，正向及反向引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA聚合酶0.25 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4.0 μL，剩余加入雙蒸水。NRF-1基因+141 G/T擴(kuò)增反應(yīng)：反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性2min，之后按照94℃30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s順序進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后以62 ℃延伸4 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為256 bp。所有樣本均在ABI-7500 fast RT-PCR電泳儀上進(jìn)行，確定擴(kuò)增樣品是否擴(kuò)增成功。NRF-1基因+141 G/T多態(tài)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bsp EI消化。酶切反應(yīng)后，在含2%瓊脂糖凝膠電泳上電泳，確定酶切產(chǎn)物。隨機(jī)選取PCR產(chǎn)物，確定酶切反應(yīng)效率。

1.5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NRF-1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A基因(mitochondrial transcription factor A mRNA，TFAM mRNA) 將抽取到的肘靜脈血3 mL采用Qiagen血液基因組RNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作提取病人RNA，利用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增(對(duì)照基因?yàn)镚APDH)，獲取TFAM特異性擴(kuò)增曲線和溶解曲線。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成。NRF-1正向引物序列：5′-CGTACGTAGCTACGATCACCA-3′，反向引物序列：5′-AGCTGTCAGCTAGTACGTTACC-3′；TFAM正向引物序列：5′-GCGTGCGCGGCTCGATCGATCAGCTT-3′，反向引物序列：5′-GTCTACGCGTAGCTAGCTAGCATCAAC-3′；GAPDH正向引物序列：5′-TAGCGTAGCTGGGCTACACGTACATC-3′，反向引物序列：5′-CGCTAGCTGGATCAGACAGGTAACTAA-3′。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中含有5 μL的PCR緩沖液，正向及反向引物各0.5 μL，5 U/L Taq DNA聚合酶0.25 μL，2.5 mmol/L的dNTPs 4.0 μL，其余加入雙蒸水。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 s，94 ℃變性20 s、63 ℃ 15 s退火、72 ℃延伸20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用目的基因Ct值與對(duì)照基因Ct值的比值作為TFAM mRNA表達(dá)水平。

1.6 隨訪 所有病人出院后1個(gè)月門診隨訪1次，之后每3個(gè)月經(jīng)門診或電話隨訪1次，至少隨訪2年。記錄所有病人隨訪期間心血管事件發(fā)生情況，包括心源性死亡(指心源性猝死及充血性心力衰竭引起的死亡)、心臟移植或惡性心律失常及慢性心力衰竭再住院情況。

1.7 臨床療效評(píng)定 顯效：治療后心力衰竭癥狀基本得到控制或心功能改善2級(jí)以上；有效：治療后心功能改善1級(jí)但未達(dá)到2級(jí)；無效：治療后心功能無明顯改善；惡化：治療后心功能進(jìn)一步加重?？傆行?(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1 NRF-1基因+141 G/T基因擴(kuò)增結(jié)果 基因檢測(cè)顯示，GG型為1條電泳條帶(128 bp)，GT為3條電泳條帶(128 bp、107 bp、21 bp)，TT為2條電泳條帶(107 bp、21 bp)。詳見圖1。

圖1 NRF-1基因+141 G/T基因擴(kuò)增電泳圖及基因測(cè)序圖(A為基因電泳圖，通道1與通道4為GG基因型，通道2為GT基因型，通道3與通道5為TT基因型；B為GG基因型測(cè)序；C為GT基因型測(cè)序；D為TT基因型測(cè)序)

2.2 NRF-1基因+141 G/T基因型頻率分布及不同基因型臨床資料比較 136例病人中，GG基因型57例(41.91%)，GT基因型55例(40.44%)，TT基因型24例(17.65%)。3種基因型病人年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、血壓比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 不同基因型臨床資料比較

2.3 不同基因型臨床療效比較 3種基因型總有效率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=19.929，P<0.001)，GG、GT基因型總有效率均高于TT基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。詳見表2。

表2 不同基因型臨床療效比較 單位：例(%)

2.4 3種基因型治療前后相關(guān)生化指標(biāo)比較 治療后，3種基因型心率、LVEF、LVEDD、NT-proBNP、估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)及PPARγC1α均優(yōu)于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；GG、GT基因型LVEF、LVEDD、NT-proBNP、eGFR、PPARγC1α優(yōu)于TT基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表3 3種基因型治療前后相關(guān)生化指標(biāo)比較(±s)

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NRF-1 mRNA、TFAM mRNA表達(dá)情況 RT-PCR檢測(cè)顯示，治療后，各基因型組NRF-1 mRNA、TFAM mRNA差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；治療后，GG、GT基因型與TT基因型NRF-1 mRNA、TFAM mRNA比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2、表4。

圖2 RT-PCR檢測(cè)NRF-1 mRNA、TFAM mRNA表達(dá)情況(1為各基因型治療前；2為各基因型治療后)

表4 治療前后3種基因型NRF-1及TFAM mRNA表達(dá)比較(±s)

2.6 不同基因型心血管事件發(fā)生率比較 136例病人隨訪2年，心血管事件總發(fā)生率為25.74%(35/136)。GG、GT及TT型2年內(nèi)心血管事件發(fā)生率分別為19.30%、23.64%和45.83%。Kalplan-Meier法分析顯示，3種基因型累積心血管事件發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Logrankχ2=6.706，P=0.035)。詳見圖3。

圖3 Kalplan-Meier法分析3種基因型2年內(nèi)心血管事件累積發(fā)生情況

2.7 預(yù)后影響因素分析 將預(yù)后是否出現(xiàn)心血管事件(是=1，否=0)為因變量，以相關(guān)特征因素及生化指標(biāo)為自變量，采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析。結(jié)果顯示，TT基因型、NT-proBNP、LVEDD為預(yù)后的危險(xiǎn)因素；NRF-1、TFAM及PPARγC1α、LVEF為預(yù)后的保護(hù)因素。詳見表5。

表5 心力衰竭病人心血管事件預(yù)后影響因素的Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析

3 討 論

心力衰竭的主要病理機(jī)制為心肌缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞受損，心肌細(xì)胞壞死是導(dǎo)致心室重構(gòu)的重要原因。有研究顯示，心肌細(xì)胞能量代謝功能障礙在心力衰竭發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[5]。心肌細(xì)胞功能的主要細(xì)胞器是線粒體。NRF-1是由細(xì)胞色素C激活表達(dá)的，在細(xì)胞核、線粒體相互作用中發(fā)揮著重要作用[6]。NRF-1可調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及線粒體氧化呼吸[7]，且NRF-1高表達(dá)對(duì)減輕、預(yù)防心力衰竭的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。腦鈉肽(BNP)和NT-proBNP對(duì)心力衰竭及短期內(nèi)心血管不良事件有診斷價(jià)值，本研究從另一方面部分闡述了NRF-1基因及其多態(tài)性與心力衰竭治療后的臨床療效關(guān)系及遠(yuǎn)期心血管事件發(fā)生情況的關(guān)系，探討心力衰竭治療是否與心肌細(xì)胞線粒體能量代謝有關(guān)，為今后臨床采取合理有效的治療有效提供方法，同時(shí)為進(jìn)一步研發(fā)有效的治療藥物提供一定的理論依據(jù)。

NRF-1為轉(zhuǎn)錄激活線粒體中相關(guān)基因啟動(dòng)子的核轉(zhuǎn)錄因子，定位于7號(hào)染色體3區(qū)2帶，由503個(gè)氨基酸組成。有研究顯示，NRF-1基因多態(tài)性與冠心病、2型糖尿病發(fā)病存在一定的相關(guān)性[8-9]，不同基因型對(duì)冠心病、糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展存在差異。目前NRF-1基因多態(tài)性是否與心力衰竭療效及預(yù)后有關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與藥物治療后療效及遠(yuǎn)期心血管事件發(fā)生均存在一定的相關(guān)性，提示NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與心力衰竭療效及預(yù)后可能存在一定聯(lián)系，值得進(jìn)一步研究。缺氧條件下，NRF-1高表達(dá)有助于細(xì)胞存活，NRF-1基因具有改善細(xì)胞缺氧狀態(tài)、提高細(xì)胞活力的作用[3]；體外刺激心肌細(xì)胞NRF-1表達(dá)上調(diào)，可增加線粒體氧化磷酸化蛋白表達(dá)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，NRF-1可強(qiáng)烈誘導(dǎo)PPARγC1α表達(dá)，形成共激活因子，作用于TFAM啟動(dòng)基因，直接調(diào)控線粒體轉(zhuǎn)錄與復(fù)制[11]。本研究結(jié)果顯示，GG、GT基因型病人NRF-1 mRNA、TFAM mRNA表達(dá)水平高于TT基因型，表明不同基因型NRF-1存在能量代謝基因表達(dá)差異，可能是導(dǎo)致心肌細(xì)胞能量代謝功能障礙的重要原因及藥物干預(yù)預(yù)后差異的關(guān)鍵因素。

交感腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)(SAS)及腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在人體中發(fā)揮著重要的作用，其激活后過表達(dá)是導(dǎo)致心室重構(gòu)及慢性心力衰竭的重要原因[12]。盡管血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑及β受體阻滯劑阻斷了SAS和RAS過度激活，仍有部分病人未從藥物干預(yù)中獲益[13]。分子研究顯示，多數(shù)抗心力衰竭藥物與特定靶蛋白結(jié)合發(fā)揮著生物學(xué)作用，編碼這些藥物作用靶位的基因多表現(xiàn)為多態(tài)性，基因多態(tài)性影響藥物治療敏感性[14]。有研究顯示，RAS過度激活導(dǎo)致血管緊張素Ⅱ高表達(dá)，進(jìn)而引起線粒體損傷，導(dǎo)致NRF-1、TFAM基因表達(dá)下調(diào)[15]；β腎上腺素受體興奮導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制線粒體NRF-1表達(dá)有關(guān)[16]。上述研究表明，NRF-1可能為血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或β受體阻滯劑的潛在作用靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，NRF-1基因+141 G/T不同基因型表現(xiàn)不同臨床療效。GG、GT基因型病人經(jīng)藥物后總有效率明顯高于TT基因型，且LVEF、PPARγC1α、eGFR水平高于TT基因型，NT-proBNP水平低于TT基因型，提示NRF-1基因+141 G/T中TT基因型病人經(jīng)藥物治療后效果較差，其可能與NT-proBNP水平降低不明顯有關(guān)，值得進(jìn)一步研究，同時(shí)結(jié)果表明不同基因型對(duì)藥物治療的敏感性存在差異。

本研究進(jìn)一步明確NRF-1基因+141 G/T不同基因型與心血管事件發(fā)生率的關(guān)系，以期為臨床采取合理有效的治療方案提供依據(jù)。結(jié)果顯示，GG、GT基因型心血管事件發(fā)生率低于TT基因型，經(jīng)Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析顯示，TT基因型為預(yù)后獨(dú)立危險(xiǎn)因素。雖然本研究闡明了慢性心力衰竭預(yù)后與NRF-1、TFAM及PPARγC1α的關(guān)系，但未進(jìn)一步明確NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與心力衰竭作用及藥物干預(yù)機(jī)制及對(duì)心肌細(xì)胞及心肌細(xì)胞線粒體功能的影響，需進(jìn)一步行體外研究或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討相關(guān)作用機(jī)制，進(jìn)而闡明藥物的作用效果。

綜上所述，NRF-1基因+141 G/T多態(tài)性與慢性心力衰竭病人療效有關(guān)，與2年內(nèi)心血管事件發(fā)生情況有一定的相關(guān)性，其作用可能與藥物干預(yù)后提高NRF-1、TFAM基因及PPARγC1α表達(dá)有關(guān)。