檢測牛奶中雜質的表面增強拉曼光譜基底研究進展

陳 霜，李 丹，于海燕，陳 臣，陳 彬，田懷香

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

發展中國家的人們生活水平的提高以及他們對健康的追求導致了全球牛奶消費量的快速增長，與此同時，牛奶的質量和安全也越來越受到消費者和生產者的關注。在生鮮乳諸多安全質量問題中，摻假對消費者的身心健康有巨大傷害，對行業發展的影響最為惡劣。總地來說生鮮乳中常見的摻假物質包括三聚氰胺、尿素和雙氰胺等，這些物質常被用來人為地提高牛奶加水稀釋后的含氮量；甲醛、過氧化氫、苯甲酸、重鉻酸和水楊酸等物質被用來延長產品的保質期[1?3]。此外，牛奶中化學殘留物質還包括磺基吡啶、四環素、青霉素G 以及福美雙和雙酚A[4?7]等。

在過去的十年里，已經提出了多種分析方法，用于快速篩查或選擇性地確定牛奶的質量。液相色譜、氣相色譜與質譜聯用用于高選擇性的測定[8]，近紅外、中紅外、紫外-可見光譜和同步熒光光譜法在內的光譜技術也已被用于檢測牛奶的質量，這些方法所涉及的樣品前處理較復雜、成本高、耗時長，無法滿足現場樣品高通量的快速篩查要求[8?9]。

Fleischmann、Van Duyne 和Creighton 三個研究組在十九世紀七十年代中后期率先發現吡啶分子吸附在粗糙的銀電極表面時，可以使拉曼散射光譜的強度得到很大地增強，他們確認了粗糙金屬表面上出現的拉曼信號明顯增強的現象，并不是因為增加了吸附分子的量而引起增強的，而是由于拉曼散射效率本身的極大提高，現在稱之為表面增強拉曼光譜(Surface Enhanced Raman Spectroscopy)效應，簡稱SERS[10?12]。SERS 技術在檢測過程中只需將制備好的基底材料與待測樣品混合進行拉曼信號采集，因其不需要長時間的樣品預處理、可實現快速痕量無損檢測、不受樣品中水的干擾以及設備便攜等優點而成為一種新型的快速檢測技術[13]。在web of science中以“SERS”和“milk”為關鍵詞檢索，2010～2019 年SERS 技術應用于牛奶檢測的出版物數量呈快速增長趨勢（如圖1 所示），這表明了SERS 技術在全球乳制品檢測中的重要性。因此，本文對納米SERS 基底進行了全面的綜述，為SERS 技術在牛奶快速檢測領域的研究提供參考。

圖1 近十年SERS 應用于牛奶檢測的出版物數量Fig.1 Number of publications on SERS detection of milk in the past decades

1 抗菌劑殘留的檢測基底

粘菌素和青霉素是兩種高效抗菌劑，被廣泛用于預防和治療奶牛乳房炎，這些抗生素會少量殘留于患病奶牛所生產的牛奶中，并通過食物鏈進入人體，可導致嚴重的過敏反應和細菌耐藥性。因此，監控牛奶中殘留的抗生素，對保障食品安全具有重要意義。SERS 技術能否高效地檢測出低含量的抗菌劑殘留，關鍵是制備出優異的SERS 活性基底，既要有很高的靈敏度，又要有良好的穩定性和重復性。

閆磊等[14]建立了一種檢測牛奶中的粘菌素的競爭性免疫分析系統，該系統由5,5-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)標記的AuNPs 與抗粘菌素單克隆抗體(mAb)結合成SERS 探針，當樣本中粘菌素濃度越高時，越少的捕獲抗原會與SERS 納米探針結合，SERS 信號從而降低。該體系的檢出限為0.10 μg/mL，回收率為88.1%～112.7%。因此，這種基于SERS的競爭性免疫傳感系統在牛奶中粘菌素的快速監測中具有廣闊的應用前景。

Chen 等[15]實現了以Ag NPs 為基底材料，對實際牛奶樣品中的青霉素G 殘留的檢測，檢出限為2.54×10?9mol/L(相當于0.85 μg/kg)，低于歐盟標準規定可檢出的最大濃度(4 μg/kg)。該方法有望在食品安全領域為動物源食品中β-內酰胺類抗生素殘留的檢測提供參考。李海閩等[16]以銀溶膠為SERS 活性基底，建立了牛奶中阿莫西林含量的SERS 檢測方法。在最佳檢測條件下，阿莫西林標準溶液的濃度與1055 cm?1處拉曼特征峰的SERS 信號強度在1～1000 μg/mL 范圍內有良好的線性關系，方法的檢出限可達到1 μg/mL，回收率為84.51%～93.62%，相對標準偏差（RSD）為5.16%。

Moreno 等[17]用多壁碳納米管(MWCNTs)包裹金納米粒子(AuNPs)制備了MWCNTs-AuNPs 基底，實現了牛奶樣品中磺基吡啶的定性和定量，LOQ為8.8 ng/ mL，增強因子為4394 倍。提出的基底制備簡單、可重復使用，樣品不需要任何預濃縮步驟，只需一臺便攜式拉曼光譜儀即可，但這種基底不能廣泛用于其他物質的檢測而有一定的局限性。Li 等[18]報道了一種以磁鐵礦膠體納米晶簇-聚甲基丙烯酸(MCNCs-PMAA)的磁性納米球(MNs)與適配體結合作為捕捉探針，以Au/PATP/SiO2(APS)與核酸適配體cDNA 結合為信號探針的SERS 傳感器，實現了牛奶中四環素的快速檢測。該適配傳感器具有良好的檢測性能，LOD 為0.001 ng/mL，靈敏度高，對一般共存干擾具有良好的選擇性（表1）。

表1 檢測牛奶中殘留化學物質的SERS 基底Table 1 SERS substrates for detection of residual chemicals in milk

紙質SERS 基底的制備為拉曼光譜在食品安全領域的快速檢測提供了新的解決方案，紙質增強基底拉曼光譜法可成功實現牛奶中的抗生素、微生物的檢測。Marques 等[19]采用一步熱蒸發在紙基材料上鍍一層AgNPs 做SERS 增強基底，檢測時將兩微升摻有四環素的牛奶滴在這個納米等離子體平臺上并干燥，檢測限低至0.1 ppm。研究表明，這種紙基平臺非常穩定，保質期可達幾個月，可一步定性和定量牛奶中的四環素，而不需要任何樣品的預處理，是潛在的現場監測四環素和其他抗生素殘留的有效工具。

上海師范大學資源化學教育部重點實驗室[20]采用兩步法制備了可重復的三維ZnO/Ag@Au 襯底（如圖2 所示），建立了一種靈敏度高的檢測抗生素的方法。靶樣品與ZnO/Ag@Au 復合材料巨大的表面積之間的強相互作用促進電荷轉移，從而產生了良好的化學增強效應，該方法用于牛奶中抗生素磺基吡啶的測定，檢出限可達1×10?9mol/L。

圖2 三維復合材料ZnO/Ag@Au 制備原理及其在牛奶中磺基吡啶的測定Fig.2 Schematic diagram for the fabrication of 3D hornlike ZnO/Ag@Au composite materials and their SERS application of determination of sulfapyridine in milk

2 三聚氰胺的檢測基底

三聚氰胺是一種價格低廉、含氮量高的水溶性化合物，在化學工業中廣泛用于合成三聚氰胺樹脂。然而，三聚氰胺有時被非法添加到乳制品中冒充蛋白質含量。雖然三聚氰胺本身毒性很低，但攝入超過安全限量的三聚氰胺會導致急性腎功能衰竭、膀胱癌，甚至死亡。

2.1 金屬溶膠基底

金屬溶膠基底是一種制備簡單、增強效果明顯且應用比較廣泛的SERS 基底。馮彥婷等[21]以金屬鈦板作為SERS 襯底材料，采用50 nm 銀納米顆粒作為基底，通過便攜式拉曼光譜儀采集樣品的SERS信號。在質量濃度0.2～10 mg/L的范圍內，SERS 強度隨著牛奶中三聚氰胺濃度的增大而增強，線性相關系數R2=0.998，檢測限為0.08 mg/L。Kaleem 等[22]報道了用納米金球包埋整體偶聯物（GNS@GEMS）快速檢測牛奶中微量三聚氰胺的方法（如圖3 所示），檢測限為0.11 mg/L，定量限為0.38 mg/L，檢測三聚氰胺的時間為10 min。Xu 等[23]利用銀離子導體RbAg4I5薄膜，在外加電流強度分別為1 μA 和7 μA的條件下，采用真空熱蒸發法制備了高表面粗糙度銀納米片作為SERS 底物，將其用于液態奶中三聚氰胺的檢測。在任何情況下只需醋酸預處理即可檢測出液態奶中三聚氰胺，最低檢測濃度為10?9mol/L。

圖3 納米金球包埋整體偶聯物（GNS@GEMS）的制備圖Fig.3 Preparation of nano-gold spheres embedded integral conjugate (GNS@GEMS)

2.2 三維基底

三維SERS 襯底具有良好的SERS 性能，是當前 SERS 基底研究的熱點和難點。三維結構具有特殊光學性質和大的比表面積。特殊的三維網狀結構有利于分子吸附，此外還促進了有效光散射的次數。在肖海波等[24]的研究中，利用包覆Au NPs的納米纖維素（NFC）實現了三維柔性SERS 基底的簡易合成。將合成的SERS 底物用于液態奶中三聚氰胺的檢測，能夠定量測定牛奶中的三聚氰胺，并獲得了滿意的檢測限（1 ppm）和回收率，檢測過程可在15 min內完成。NFC/AuNP 底物具有較好的均勻性，可以用于食品安全的SERS 分析，但仍需要進一步研究不同類型的材料性能，提高基底和SERS 方法的靈敏度。Li 等[25]采用一種簡單、低成本的方法制備了三維AgNPs@MoS2/聚甲基丙烯酸甲酯錐形等離子體結構SERS 基底。該襯底的EF 達到了5.89×109，檢出限為10?6mol/L。Zhao 等[26]也制備了一種MoS2/AuNPs-AgNPs/PMMA 三維錐體基底（如圖4 所示），用于檢測液態奶中的三聚氰胺分子，檢出限可達10?9mol/L。他們制備的底物具有良好的痕量分子檢測能力，為進一步的應用奠定了基礎，顯示了其在原位檢測方面的巨大潛力。

圖4 合成MoS2/AuNPs-AgNPs/P-PMMA SERS 襯底的工藝示意圖Fig.4 Schematic illustration of the process for the synthesis of flexible MoS2/AuNPs-AgNPs/P-PMMA SERS substrates

李俊梅等[27]研究了在MoS2膜上原位合成AuNPs-AgNPs 納米顆粒，制備了一種基于異質交叉分布的金屬結構與MoS2雜化的三維金字塔SERS活性襯底。用AuNPs-AgNPs/MoS2/P-Si 雜化SERS襯底檢測液態奶中三聚氰胺的LOD 值為10?11mol/L，該襯底具有良好的均勻性和重現性，展現了最佳的表面增強拉曼散射性能。研究結果證實，基于雙金屬核殼納米顆粒的SERS 襯底具有快速、同時檢測牛奶等復雜食品基質中其他有害化學物質殘留的潛力。

除了金屬的SERS 增強效應明顯外，半導體材料在增強SERS 信號方面也很有應用價值[28?30]。Lu 等[31]以不銹鋼纖維為固相載體，用水熱法在其表面合成ZnO 納米棒，再通過離子濺射將 Au NPs 修飾到ZnO 納米棒上，形成 Au-ZnO 納米棒復合基底，增強因子為5.3×105。西安交通大學的Huang 等[32]報道了一種獨特的基于AgNPs 修飾的ZnO/Si 異質結構納米陣列的SERS 檢測三維納米結構。將所制備的底物用于羅丹明6G(R6G)的檢測，檢測下限為10?16mol/L，增強因子高達8.7×107，三聚氰胺的檢測限低于10?9mol/L。在Wang 等[33]的研究中，采用多步連續沉積法將夾有3 nm SiO2層的三維的AuNPs 組裝到TiO2Ns 上，由于形成了超細等離子體帶隙和半導體/金屬界面，從而形成了大量的熱點，三聚氰胺的檢出限為0.9 mg/L（表2）。

表2 檢測牛奶中三聚氰胺的SERS 基底Table 2 Conventional SERS substrates for detection of melamine in milk

這些研究表明基于半導體材料ZnO、Si、TiO2和重金屬的三維納米基底SERS 方法的靈敏度高、檢測能力強，在食品安全和生物醫學分析中具有廣闊的應用前景。

2.3 柔性基底

近年來，由于大多數SERS 基底制備工藝非常復雜，基片本身缺乏靈活性、生態友好性和經濟性[38?39]，使SERS的發展受到了限制。因此，開發可以克服上述缺點的新型SERS 基底在食品安全和環境應用中的分析檢測已經十分必要[40?41]。

SERS 基底的性能取決于SERS 活性襯底的材料和納米結構的選擇，與硅片和金屬膜等光滑的表面載體相比，紙張中的天然褶皺和纖維結構有利于金屬納米顆粒的均勻分布和SERS 熱點的形成[42?43]。最近，基于纖維素的紙質襯底因其獨特的一系列優點(例如，100%可回收、柔性和低成本)而被開發用于多種光譜檢測。紙質增強基底可應用于牛奶基質中痕量三聚氰胺的分析，Mekonnen 等[44]將Ag@SiO2納米立方體負載到小型化濾紙上，建立了一種簡單、廉價、靈敏的紙雜化等離子體SERS 基底，檢測限0.17 mg/L。與剛性襯底相比，這種改進的顆粒間距和均勻性使得SERS 活性更高、更可靠，并且能夠以較低的成本和較短的時間檢測牛奶中的三聚氰胺。

濾紙的親水性促進了金屬納米材料的均勻分布，同時也可能使樣品溶液容易吸收到紙中并隨機擴散到大片區域[41,45]，導致紙基基底的SERS 信號變弱，靈敏度和重現性變差。于是，研究者們受自然界中的荷葉的啟發，開發出了超疏水表面基底[46?47]，并將其成功地應用于SERS 技術中。Wu 等[48]以涂蠟的硅片作為疏水表面，使水相中AuNPs 與目標分析物的混合體（AuNPs-Analyte）聚集和濃縮。干燥后，在基底上的AuNPs-Analyte 層上滴鑄另一層AuNPs，從而引入更多的熱點進一步增強拉曼信號，形成AuNPs-Analyte/AuNPs 雙層結構。該傳感器對牛奶中三聚氰胺的檢測表現出較高的重現性、靈敏度和回收率，檢測限在亞納摩爾濃度水平，說明該SERS傳感平臺在食品安全檢測具有良好的應用前景。Han 等[49]先用十六烯基丁二酸酐對纖維素紙進行改性，以生成能夠濃縮三聚氰胺(和其他疏水分析物)的疏水頂層，從而防止含水的樣品在紙張上擴散。隨后將AgNPs 載入到疏水紙張上，以形成大規模的SERS 傳感陣列。將該陣列應用于牛奶中三聚氰胺的檢測，檢出限為0.27 mg/L。Zhang 等[50]采用類似的方法，使AgNPs 吸附在NaCl 處理過的普通實驗室濾紙上，再用疏水劑處理紙基表面，制備了一種接觸角接近150°的疏水性紙基SERS 基底（如圖5 所示）。首次實現了直接液滴SERS 檢測牛奶中的三聚氰胺，檢測限可達0.65 ppm。這兩種方法制備的基底都綜合了易于生產、重現性好和靈敏度高的優點，是理想的表面增強拉曼光譜檢測基底。

圖5 疏水性紙基SERS 平臺制作與分析過程示意圖Fig.5 Schematic illustration of the fabrication and analysis process for hydrophobic paper-based SERS platform

目前SERS 襯底的制備方法(如電化學粗糙電極、基于光刻的微細加工襯底、膠體自組裝等)往往復雜且耗時。印刷、噴霧等方法是實現大規模有序功能圖案或陣列的高通量、簡便性和高性價比的有力候選者。這是一種根據需要將制備好的等離子體納米墨水（如銀納米球、金納米球、金納米棒等）通過打印機、鋼筆、畫刷、噴霧瓶等手段將墨水噴在紙上或柔性襯底上的方法。Wu 等[51]通過在塑料PET(聚對苯二甲酸乙二醇酯)基板上絲網印刷AgNPs 制備了低成本、高靈敏度性和可重復的SERS 基板。利用印刷后的銀基底作為SERS 平臺，無需預處理，即可在鮮奶中檢測出三聚氰胺，這將加速牛奶摻假快速在線檢測的應用。他們的絲網印刷方法突出了大規模印刷的優勢，用于制造功能明確的納米結構，其應用遠遠超出SERS 傳感領域。Creedon 等[52]報道了一種透明SERS 襯底的制備，該襯底是用鋁片和玻璃載體做模板，在熱塑性聚偏氟乙烯聚合物表面制備納米結構，得到柔性透明的聚合物基體，然后在其上沉積一層銀（30 nm）。該傳感器具有快速、定量和高靈敏度的特點，例如采用滴干法檢測牛奶中三聚氰胺，總分析時間小于10 min，實驗測得檢出限為0.1 ppm。作者還將此方法與質譜進行了對比實驗，結果表明，其檢測限接近質譜方法的檢測限，而又不用復雜的預處理過程，因此這些底物提供了現場快速檢測樣品的可能性。柔性基底快速檢測牛奶中三聚氰胺的應用見（表3）。

表3 檢測牛奶中三聚氰胺的柔性SERS 基底Table 3 Novel flexible SERS substrates for detection of melamine in milk

然而，由于這些柔性SERS 基底的標準還沒有被系統的研究和報道，要實現大規模生產仍然是困難和復雜的。只有基底的標準、重復性被很好的確認，這些平臺才能從實驗室發展到真正的產品。

3 其他物質的檢測基底

雙金屬核殼納米顆粒(Au@AgNPs)是最近提出的拉曼增強基底之一，因為它們同時具有AuNPs 和AgNPs的增強效果，并且制備簡單、穩定性高和光學性能優異。Hussain 等[55]用120 μL 半胱胺鹽酸鹽(0.1 nM)成功地接枝了直徑為28 nm的金核、殼厚為5 nm的銀殼，制備了一種半胱胺功能化核殼納米顆粒(Au@Ag-CysNPs)。用所建立的方法檢測液態奶樣品中的硫氰酸鈉和苯甲酸防腐劑殘留，LOD 為0.03 mg/L 和 9.8 mg/L，LOQ 為 0.039 mg/L 和10.2 mg/L。作者在另一項研究中還制備了金核直徑為28 nm，銀殼厚度為8 nm的 Au@AgNPs 納米顆粒，同時快速檢測標準溶液和液態奶樣品中的福美雙（殺蟲劑）和雙氰胺，LOD 分別為0.21 ppm 和14.88 ppm，LOQ 分別為0.24 ppm 和15.1 ppm。調節pH，然后離心是這兩項研究中唯一的樣品預處理步驟[28]。宋移歡等[56]以納米膠體金為SERS 基底建立牛乳中樂果、西維因、甲拌磷、倍硫磷4 種農藥殘留的快速檢測方法，單個樣品在5 min 內即可完成檢測，4 種農藥在0.1～10 μg/m L的質量濃度范圍內，與相應的特征峰強度呈良好的線性關系，樣品加標平均回收率為72.7%～108.1%，相對標準偏差為1.0%～13.3%。方法簡便快速、準確度好、結果可靠,適用于牛乳樣品中農藥殘留的初步篩查和鑒定。

Ilhan 等[57]建立了一種基于SERS的大腸桿菌快速檢測和鑒定方法，即紙基側向流動免疫分析（LFIA）系統，實現了從牛奶樣品中磁富集細菌與快速SERS 檢測的結合，LOD=0.52 cfu/mL，LOQ=1.57 cfu/mL。建立的方法可用于大腸桿菌的快速、可靠、靈敏和選擇性的檢測，總分析時間小于60 min，由于其在臨床診斷、食品工業或法醫學中的應用潛力，引起了廣泛關注。

4 結語

SERS 技術作為一種新興的快速檢測方法，因可以提供物質的指紋圖譜和操作簡單、對樣品檢測無損且不受水干擾、高靈敏度等優點，在牛奶中雜質的檢測中有著巨大的應用潛力。所報道的SERS 基底在牛奶檢測的應用中，所檢測的物質以三聚氰胺、抗生素、農藥為主，而甲醛、過氧化氫、重鉻酸和水楊酸等摻假物質還未見報道，但這些物質如果被添加到牛奶中也會對牛奶消費者的健康帶來威脅，因此應當將SERS 技術的研究更加廣泛的引入牛奶中其他類型摻假物和有害物質的檢測中。

從現有的文獻報道可知SERS 技術的研究現狀為：SERS 基底的重現性和穩定性比較差，利用SERS 技術進行食品現場快速檢測的推廣較難大范圍進行，目前研究比較多的SERS 基底材料是貴金屬或貴金屬和其它材料的復合物，這些材料成本較高，導致貴金屬基底的應用受到一些局限；柔性紙基和疏水性SERS 基底是表面增強拉曼光譜研究的一個新熱點，但這種基底的研究還處于實驗室階段，并且較常規基底所實現的檢測限來說新型基底的檢測限高，因此新型基底需要突破檢測不靈敏度、難以實際應用的問題。綜上所述，牛奶檢測的SERS 基底的研究趨勢主要有三個方面：首先是對SERS 基底材料成本較高問題，可開發更多的磁性、半導體材料的增強基底，將新型材料制備的基底推廣到更多物質的快速檢測中；其次是針對SERS 基底穩定性差的問題，可開發一種具有穩定基質（如聚合物、介孔二氧化硅、過渡金屬材料）的材料以保護納米顆粒的活性，提高基底的穩定性；最后，對于紙基和疏水性SERS 基底靈敏度低的問題，研究者們可將紙基SERS 基底中所用到的材料紙進行改性或用高分子材料代替；相信隨著科學技術的發展，SERS 技術一定能實現高效、便捷、靈敏地檢測待測樣品。