紅細(xì)胞分布寬度、miR-130a與乙型肝炎肝硬化并發(fā)消化道出血及病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)性*

孫喜斌，張玉虹，左路廣，賈 倩，連晶晶，馮 博，高詠梅，張 斌

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北張家口 075000

肝硬化是慢性乙型肝炎(下稱(chēng)乙肝)患者發(fā)展的終末階段，而消化道出血(GB)則是乙肝肝硬化最兇險(xiǎn)的并發(fā)癥之一，具有起病急驟、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后不良等特點(diǎn)，若未予以及時(shí)有效地干預(yù)，短期內(nèi)大量出血會(huì)引發(fā)失血性休克，嚴(yán)重者甚至死亡[1-3]。目前臨床尚未完全明確乙肝肝硬化并發(fā)GB的病理機(jī)制，有相關(guān)研究認(rèn)為[4-5]，肝臟是造血的主要器官，以生成紅細(xì)胞為主，肝硬化后，肝臟正常結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致紅細(xì)胞系統(tǒng)異常，從而引發(fā)不同程度的貧血現(xiàn)象。紅細(xì)胞分布寬度(RDW)是評(píng)價(jià)外周血紅細(xì)胞體積異質(zhì)性的定量指標(biāo)[6]。另外，有研究表明[7]，微小RNA(miRNA)作為調(diào)控基因表達(dá)的重要因子，可能參與肝硬化并發(fā)上消化道出血的發(fā)生、發(fā)展。miR-130a屬miRNA的一種，具有抗病毒、抗感染等作用，高飛等[8]研究認(rèn)為，其可作為評(píng)估乙肝病毒相關(guān)肝臟衰竭的病情程度以及預(yù)后中提供數(shù)據(jù)支持，但關(guān)于其與RDW聯(lián)合對(duì)乙肝肝硬化并發(fā)GB的診斷價(jià)值臨床鮮少報(bào)道。因此，本研究嘗試分析RDW、miR-130a與乙肝肝硬化并發(fā)GB及其病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2020年9月本院204例乙肝肝硬化患者，根據(jù)有無(wú)GB分為GB組(n=71)與非GB組(n=133)。其中GB組女50例，男21例，年齡47～73歲，平均(58.74±5.20)歲；Child-Pugh分級(jí)：10例A級(jí)，18例B級(jí)，43例C級(jí)；非GB組：女101例，男32例，年齡48～75歲，平均(59.05±4.68)歲；Child-Pugh分級(jí)：20例A級(jí)，32例B級(jí)，81例C級(jí)。兩組基本資料(年齡、性別、Child-Pugh分級(jí))比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)GB組伴有嘔血和(或)黑便等臨床表現(xiàn)，并經(jīng)胃鏡檢查證實(shí)；(2)兩組均符合乙肝肝硬化相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并原發(fā)性血液系統(tǒng)疾病者；(2)近期有食管曲張靜脈套扎或門(mén)體分流及其他治療者；(3)近12周內(nèi)有抑酸類(lèi)藥物、抗菌藥物或非甾體消炎藥等服用史者；(4)合并肝癌或其他惡性腫瘤者；(5)合并心腦等其他重要臟器器質(zhì)性損害者；(6)精神行為失常者。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)經(jīng)審核評(píng)議通過(guò)，所有研究對(duì)象均知情，并簽訂同意書(shū)。

1.2方法 (1)空腹取8 mL靜脈血，通過(guò)XS-500i全自動(dòng)細(xì)胞分析儀測(cè)定RDW，嚴(yán)格按照日本美康公司提供的儀器說(shuō)明書(shū)操作；1 000×g離心12 min(離心半徑10 cm)，分離取血清，置于-20 ℃低溫保存。(2)肝功能指標(biāo)：采用BS-480全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)，嚴(yán)格按照深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司提供的儀器說(shuō)明書(shū)操作。(3)miR-130a表達(dá)：利用美國(guó)Ambion公司提供的mirVana miRNA分離試劑盒提取血清總RNA，使用美國(guó)Thermo Scientific公司提供的Nanodrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)獲取待測(cè)基因序列，并按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則以Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，以β-actin為內(nèi)參基因，上游引物為5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物為5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′；miR-130a上游引物：5′-AGT CTA TAC AAG GGC AAG CTC TC-3′；下游引物：5′-CCC AAT ACG ACC AAA TCC GTT-3′。反應(yīng)體系：上、下游引物各0.4 μL、超級(jí)酶混合物0.2 μL、去RNA水3.4 μL、RNA模板0.6 μL、RT-qPCR緩沖液5 μL。擴(kuò)增體系：93 ℃預(yù)變性5 min；93 ℃ 40 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。血清miR-130a相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt計(jì)算。

1.3乙肝肝硬化并發(fā)GB病情程度評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[10]頭暈，失血量<500 mL，收縮壓(SBP)基本正常、心率(HR)正常，血紅蛋白(Hb)未改變，休克指數(shù)(HR/SBP)=0.5為輕度；暈厥、口渴、少尿，500 mL≤失血量≤1 000 mL，SBP降低，HR>100 次/min，70 g/L≤Hb≤100 g/L，0.5<休克指數(shù)≤1.0為中度；失血量>1 000 mL，SBP<80 mm Hg，HR>120次/min，Hb<70 g/L，肢冷、少尿、意識(shí)模糊，休克指數(shù)>1.0為重度。

1.4觀察指標(biāo) (1)比較兩組肝功能指標(biāo)(AST、ALT、GGT)、RDW、miR-130a表達(dá)。(2)分析肝功能指標(biāo)與RDW、miR-130a表達(dá)相關(guān)性。(3)分析RDW、miR-130a單一及聯(lián)合對(duì)乙肝肝硬化并發(fā)GB的診斷效能。(4)比較GB組不同病情程度患者的臨床資料，包括性別、年齡、Child-Pugh分級(jí)、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內(nèi)徑、門(mén)靜脈內(nèi)徑及食管靜脈曲張，其中脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內(nèi)徑、門(mén)靜脈內(nèi)徑均采用彩色多普勒超聲診斷儀(購(gòu)自美康電子設(shè)備有限公司)測(cè)定；食管靜脈曲張予以胃鏡觀察。(5)比較GB組不同病情程度患者肝功能指標(biāo)(AST、ALT、GGT)、RDW、miR-130a表達(dá)。(6)分析乙肝肝硬化并發(fā)GB病情的影響因素。

2 結(jié) 果

2.1兩組肝功能指標(biāo)、RDW、miR-130a表達(dá) GB組AST、ALT、GGT、RDW水平均高于非GB組，miR-130a相對(duì)表達(dá)水平低于非GB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組肝功能指標(biāo)、RDW、miR-130a表達(dá)對(duì)比

2.2肝功能指標(biāo)與RDW、miR-130a表達(dá)相關(guān)性 GB組RDW與AST、ALT、GGT呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.701、0.673、0.558，P<0.05)，miR-130a表達(dá)與AST、ALT、GGT呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.730、-0.666、-0.629，P<0.05)。見(jiàn)圖1～6。

圖1 RDW與肝功能指標(biāo)AST相關(guān)性

2.3RDW、miR-130a表達(dá)對(duì)乙肝肝硬化并發(fā)GB的診斷效能 ROC曲線顯示，RDW、miR-130a表達(dá)聯(lián)合診斷乙肝肝硬化并發(fā)GB的AUC最大，為0.771，靈敏度、特異度分別為77.46%、68.42%。見(jiàn)表2，圖7。

圖7 ROC曲線

表2 RDW、miR-130a表達(dá)對(duì)乙肝肝硬化并發(fā)GB的診斷效能

圖2 miR-130a表達(dá)與肝功能指標(biāo)AST相關(guān)性

2.4GB組不同病情程度患者臨床資料 GB組不同病情程度患者年齡、Child-Pugh分級(jí)、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內(nèi)徑、門(mén)靜脈內(nèi)徑及食管靜脈曲張情況相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

圖3 RDW與肝功能指標(biāo)ALT相關(guān)性

圖4 miR-130a表達(dá)與肝功能指標(biāo)ALT相關(guān)性

圖5 RDW與肝功能指標(biāo)GGT相關(guān)性

2.5GB組不同病情程度患者肝功能指標(biāo)、RDW、miR-130a表達(dá) GB組不同病情程度患者肝功能指標(biāo)AST、ALT、GGT、RDW、miR-130a相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 GB組不同病情程度患者臨床資料對(duì)比[n(%)]

表4 GB組不同病情程度患者肝功能指標(biāo)、RDW、miR-130a表達(dá)對(duì)比

圖6 miR-130a表達(dá)與肝功能指標(biāo)GGT相關(guān)性

2.6乙肝肝硬化并發(fā)GB病情的影響因素 以乙肝肝硬化并發(fā)GB病情為因變量(賦值：輕度=1，中度=2，重度=3)，將表3、4中有差異因素納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，Child-Pugh分級(jí)、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內(nèi)徑、門(mén)靜脈內(nèi)徑及食管靜脈曲張、RDW、miR-130a均為乙肝肝硬化并發(fā)GB病情的影響因素(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 乙肝肝硬化并發(fā)GB病情影響因素

3 討 論

有研究報(bào)道[11]，肝硬化并發(fā)GB患者病死率可達(dá)15.00%～29.00%。因此，及早明確乙肝肝硬化并發(fā)GB病情程度，予以有效治療措施，對(duì)預(yù)后改善至關(guān)重要。

RDW是紅細(xì)胞體積檢測(cè)主要參數(shù)之一，與紅細(xì)胞玻片鏡檢本比較，在診斷缺鐵性貧血方面更具客觀性與準(zhǔn)確性[12-13]。本研究經(jīng)全自動(dòng)細(xì)胞分析儀檢測(cè)可知，RDW表達(dá)在乙肝肝硬化并發(fā)GB患者中過(guò)度上調(diào)，并與AST、ALT、GGT存在正相關(guān)關(guān)系。結(jié)合李海深等[14]、宋怡然等[15]研究考慮這可能歸因于一方面，乙肝肝硬化時(shí)，肝臟解毒功能損傷，不僅會(huì)加重肝損傷程度，分泌大量炎癥細(xì)胞，激活炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，影響紅細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)引起門(mén)靜脈高壓，誘導(dǎo)脾功能亢進(jìn)，破壞紅細(xì)胞正常功能，縮短紅細(xì)胞壽命，從而上調(diào)RDW；另一方面，肝硬化消化道出血所致急性或慢性失血，會(huì)引發(fā)失血性貧血，降低鐵水平，主要表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素貧血。由此推測(cè)，RDW可能在乙肝肝硬化并發(fā)GB發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。RDW有望成為乙肝肝硬化并發(fā)GB診斷的潛在指標(biāo)，有助于指導(dǎo)臨床診治。另外，秦嬌等[16]經(jīng)多變量分析發(fā)現(xiàn)，RDW是乙型肝炎病毒相關(guān)慢性與急性肝衰竭患者短期死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。LOU等[17]認(rèn)為，RDW在各類(lèi)乙肝患者中均顯著升高，并與疾病嚴(yán)重性存在正相關(guān)性。本研究通過(guò)多因素Logistic回歸分析顯示，RDW高水平是乙肝肝硬化并發(fā)GB病情程度的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與孫喜斌等[18]研究存在相似性，說(shuō)明RDW可反映乙肝肝硬化并發(fā)GB病情程度。

miR-130a屬miR-130家族之一，近年來(lái)有報(bào)道指出[19]，其不僅能控制淋巴細(xì)胞定向轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞趨化性，刺激中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)，還能在PI3K/Akt/PTEN/mTOR等耐藥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起中介作用。本研究經(jīng)分組對(duì)比研究提示，miR-130a在乙肝肝硬化并發(fā)GB患者中呈低表達(dá)，并隨病情程度加重出現(xiàn)下降趨勢(shì)，與霍續(xù)磊等[20]研究結(jié)果不一致，可能與二者研究對(duì)象不同有關(guān)。上述結(jié)果產(chǎn)生機(jī)制可能為乙肝肝硬化并發(fā)GB患者病理性免疫反應(yīng)激活，可造成miRNA-130a下降，促使淋巴細(xì)胞錨定融合血管內(nèi)壁，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞束縛病變靶細(xì)胞，釋放白細(xì)胞介素1、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子，最終形成惡性循環(huán)。另外，LI等[21]經(jīng)小鼠模型證明，miR-130a可活化α平滑肌肌動(dòng)蛋白，誘導(dǎo)內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，繼而在多種病因所致肝損傷或肝衰竭發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究經(jīng)Pearson線性相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-130a表達(dá)與AST、ALT、GGT存在負(fù)相關(guān)性。表明miR-130a表達(dá)下調(diào)可能加重肝功能損傷，主要與免疫炎性反應(yīng)加劇有關(guān)，但具體機(jī)制有待今后深入分析。然而miR-130a單一診斷乙肝肝硬化并發(fā)GB存在一定局限性，故本研究采取聯(lián)合診斷模式，結(jié)果顯示，RDW、miR-130a聯(lián)合診斷乙肝肝硬化并發(fā)GB的AUC高于上述指標(biāo)單一診斷，為0.771。進(jìn)一步證明了RDW、miR-130a聯(lián)合在乙肝肝硬化并發(fā)GB中的診斷價(jià)值。此外，陳煬森[22]研究指出，Child-Pugh分級(jí)為C級(jí)、食管胃底靜脈曲張是肝硬化并上消化出血死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；王柳青等[23]認(rèn)為，胃左靜脈內(nèi)徑、食管胃底靜脈曲張是肝硬化并發(fā)首次上消化道出血致命的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與本研究觀點(diǎn)具有相似性。故評(píng)估乙肝肝硬化并發(fā)GB病情程度的同時(shí)應(yīng)將Child-Pugh分級(jí)、脾臟厚度、腹水、胃左靜脈內(nèi)徑、門(mén)靜脈內(nèi)徑、食管靜脈曲張等因素納入考慮范圍內(nèi)，以減少數(shù)據(jù)偏移。

綜上所述，RDW、miR-130a與乙肝肝硬化并發(fā)GB患者肝功能存在良好線性關(guān)系，也是乙肝肝硬化并發(fā)GB病情的重要影響因素，二者聯(lián)合檢測(cè)可為臨床診斷乙肝肝硬化并發(fā)GB、評(píng)估病情程度、開(kāi)展個(gè)性化治療提供一種新途徑。