兩種前處理方法對(duì)血培養(yǎng)直接藥敏的影響

張灝旻，吳 晶，楊 俊，李 敏

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200127

血流感染(BSI)是臨床非常危重的感染類型，有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。近年來，隨著臨床上各種侵入性操作、免疫抑制劑、激素及大劑量廣譜抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，BSI發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)每年約有1 900萬人發(fā)生膿毒血癥[2]。依據(jù)我國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)，2012年我國(guó)血流感染分離菌株數(shù)較2011年增加了21.4%[3]。及時(shí)使用有效的抗菌藥物對(duì)于血流感染的預(yù)后是極其重要的[4-5]。如果能在感染后的1 h內(nèi)進(jìn)行正確治療，膿毒血癥的存活率為80.0%；每延遲1 h，死亡率增加7.0%[6]。因此快速、準(zhǔn)確地對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定并提供藥敏結(jié)果是正確進(jìn)行治療的基礎(chǔ)。

隨著以蛋白質(zhì)指紋圖譜為基礎(chǔ)的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的廣泛使用，病原體的鑒定可以在培養(yǎng)后幾分鐘內(nèi)完成。MALDI-TOF-MS技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、敏感等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。MALDI-TOF-MS也能夠用于對(duì)血培養(yǎng)陽性樣本進(jìn)行直接鑒定，一些自建方法與sepsityper 試劑盒的鑒定效果類似[9-11]，上海在2017年初也發(fā)布了相關(guān)的檢測(cè)規(guī)范[12]，極大地縮短了血培養(yǎng)檢測(cè)與鑒定的時(shí)間。但目前細(xì)菌藥敏試驗(yàn)方法仍為培養(yǎng)獲得菌落后采用儀器法或紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，一般需要至少48～72 h才能獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果，不能快速指導(dǎo)臨床準(zhǔn)確地選擇敏感抗菌藥物進(jìn)行抗感染治療[13]。本研究探索血培養(yǎng)陽性樣本采用BD分離膠促凝管進(jìn)行前處理分離出細(xì)菌或進(jìn)一步通過TSB肉湯增菌，隨后在自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀上進(jìn)行體外藥敏檢測(cè)，并將結(jié)果與現(xiàn)有常規(guī)藥敏自動(dòng)檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估兩種快速血培養(yǎng)陽性樣本體外藥敏前處理方法的作用，從而建立的報(bào)陽血培養(yǎng)直接體外藥敏試驗(yàn)的新方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 上海某三級(jí)教學(xué)醫(yī)院2017年9月至2018年5月采集的臨床血培養(yǎng)陽性樣本，共241例。剔除同一患者因雙側(cè)雙瓶采血產(chǎn)生的重復(fù)陽性樣本。241例患者中男138例(57.3%)，女103例(42.7%)；年齡27～94歲，>60歲者161例(66.8%)。

1.2儀器與試劑 陽性血培養(yǎng)菌種鑒定由Biotyper MALDI-TOF MS(德國(guó)布魯克公司)完成；體外藥敏試驗(yàn)由PhoenixTM M50 全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀及其配套的藥敏檢測(cè)卡NMIC-413、PMIC-92、SMIC/ID-2及相應(yīng)配套試劑(美國(guó)BD公司)完成。前處理使用分離膠促凝管購(gòu)自美國(guó)BD公司；TSB肉湯干粉購(gòu)自O(shè)xiod公司。

1.3方法

1.3.1分離膠離心管離心直接藥敏分析 從陽性血培養(yǎng)瓶抽取6 mL培養(yǎng)液至BD分離膠促凝管各樣本制備3管；離心2 000 r/min，30 min；用一次性無菌吸管小心吸取上清液并棄去，在分離膠表面會(huì)出現(xiàn)一層白色細(xì)菌沉淀，取第1管的細(xì)菌沉淀按照MALDI-TOF MS血培養(yǎng)直接鑒定的流程進(jìn)行操作，確定細(xì)菌菌種；取第2管，用無菌棉簽挑取分離膠促凝管中白色沉淀，按BD Phoenix M50標(biāo)準(zhǔn)操作流程配置菌懸液，選擇相應(yīng)藥敏板進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2分離膠離心管離心增菌后直接藥敏分析 前處理方法同上。取第3管，用1 μL一次性接種環(huán)挑取分離膠促凝管中白色沉淀至加有1 mL TSB(美國(guó)賽默飛世爾公司)的EP管中，置35 ℃搖床200 r/min，孵育2 h。按BD Phoenix M50標(biāo)準(zhǔn)操作流程配置菌懸液，選擇相應(yīng)藥敏板進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3傳統(tǒng)的培養(yǎng)、鑒定和藥敏試驗(yàn) 將報(bào)陽后的血培養(yǎng)轉(zhuǎn)種血瓊脂平板(上海伊華公司)，培養(yǎng)并形成單個(gè)菌落后，挑取單個(gè)菌落采用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定，在自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀(BD Phoenix M50)上進(jìn)行藥敏檢測(cè)，并作為標(biāo)準(zhǔn)方法。

1.4判定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)室與標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)2017版對(duì)藥敏結(jié)果進(jìn)行判定。(1)類別一致性(CA)：直接藥敏結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果完全一致；(2)非常重大錯(cuò)誤(VME)：直接藥敏結(jié)果為敏感(S)而標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為耐藥(R)；(3)重大錯(cuò)誤(ME)：直接藥敏結(jié)果為R而標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為S；(4)微小錯(cuò)誤(MIE)：直接藥敏結(jié)果為S或R而標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為中敏(I)或者直接藥敏結(jié)果為I而標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果為S或R。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)兩種前處理方法進(jìn)行直接藥敏檢測(cè)的正確性進(jìn)行分析，對(duì)不同種類抗菌藥物藥敏結(jié)果正確率主要應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，對(duì)于χ2檢驗(yàn)不適用的分析(統(tǒng)計(jì)個(gè)數(shù)小于5)采用費(fèi)希爾精密驗(yàn)證(Fisher′s exact test)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1分離膠離心后直接檢測(cè)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)鑒定的一致性 選取的241例中陽性血培養(yǎng)樣本中，分離膠離心后直接采用MALDI-TOF MS鑒定出革蘭陰性桿菌127例，革蘭陽性球菌114例；采用傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)種培養(yǎng)法鑒定出革蘭陰性桿菌127例，革蘭陽性球菌114例。兩種方法的鑒定結(jié)果，革蘭陰性菌各菌種鑒定符合率達(dá)100.0%，革蘭陽性球菌中肺炎鏈球菌鑒定符合率僅為50.0%，其余菌種鑒定符合率均在90.0%以上比較。見表1。

表1 分離膠離心直接鑒定與傳統(tǒng)法鑒定結(jié)果符合率

2.2革蘭陰性菌的分離膠離心后直接藥敏分析結(jié)果 共127例革蘭陰性菌血培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。將根據(jù)CLSI指南不需要報(bào)告的藥敏結(jié)果剔除后，所有的藥敏報(bào)告可提供22種常見抗菌藥物的藥敏結(jié)果(表2)。直接法及增菌法的藥敏結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)法相比所有抗菌藥物的CA均大于90.0%。其中在8種抗菌藥物中兩種方法的藥敏結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)法的結(jié)果完全一致。直接法在美羅培南的檢測(cè)中也與標(biāo)準(zhǔn)法一致。兩種方法在環(huán)丙沙星、亞胺培南、妥布霉素及復(fù)方磺胺甲噁唑上均出現(xiàn)了1～2例VME，這些錯(cuò)誤全部發(fā)生在克雷伯菌屬中。此外，直接法在哌拉西林-他唑巴坦中有一個(gè)來自大腸埃希菌的VME。在阿莫西林-克拉維酸、頭孢吡肟、厄他培南和復(fù)方磺胺甲噁唑中直接法出現(xiàn)了1～2例的ME；與直接法相比，增菌法除了在上述的4種抗菌藥物中有ME，在米諾環(huán)素上也存在1個(gè)來自埃希菌屬的ME。在MIE方面，直接法的發(fā)生率略高于增菌法的發(fā)生率，分別為30例和24例。兩種方法在阿莫西林-克拉維酸、氨芐西林-舒巴坦、頭孢西丁、環(huán)丙沙星、亞胺培南、米諾環(huán)素上的錯(cuò)誤發(fā)生率相同。增菌法在頭孢吡肟和美羅培南中出現(xiàn)了1例錯(cuò)誤而直接法在厄他培南、復(fù)方磺胺甲噁唑有錯(cuò)誤出現(xiàn)。在所有被檢測(cè)的抗菌藥物中，用兩種方法檢測(cè)米諾環(huán)素的錯(cuò)誤率最高，替加環(huán)素次之，這些錯(cuò)誤主要為MIE，大部分來自克雷伯菌屬。米諾環(huán)素在臨床上不作為治療克雷伯菌血流感染的一線用藥，替加環(huán)素因血藥濃度低需要與其他抗菌藥物聯(lián)合才能達(dá)到治療效果，所以在克雷伯菌屬直接藥敏結(jié)果中可以刪除米諾環(huán)素和替加環(huán)素結(jié)果，同時(shí)根據(jù)臨床需要加做以替加環(huán)素為基礎(chǔ)的聯(lián)合藥敏實(shí)試驗(yàn)以補(bǔ)充直接藥敏結(jié)果。

表2 革蘭陰性菌兩種直接藥敏檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)藥敏方法檢測(cè)結(jié)果的比較分析[n=127,n(%)]

2.3革蘭陽性球菌的分離膠離心后直接藥敏分析結(jié)果

2.3.1104例革蘭陽性球菌(非鏈球菌)血培養(yǎng)陽性標(biāo)樣本 用PMIC-92藥敏卡進(jìn)行評(píng)估，在剔除不需要報(bào)告的藥敏結(jié)果后，對(duì)20種常見抗菌藥物進(jìn)行了藥敏結(jié)果分析(表3)。兩種方法在50.0%的抗菌藥物上與標(biāo)準(zhǔn)方法保持了100.0%的CA；富集增菌法更是在除利福平外的其他全部抗菌藥物的檢測(cè)中沒有出現(xiàn)VME；直接法在諾氟沙星、青霉素 G、利福平、四環(huán)素及復(fù)方磺胺甲噁唑中出現(xiàn)3例VME；其中青霉素 G的錯(cuò)誤來自腸球菌，復(fù)方磺胺甲噁唑來自金色葡萄球菌，其他全部來自凝固酶陰性葡萄球菌。兩種方法在克林霉素中出現(xiàn)了1.9% 的VME，來自金色葡萄球菌及凝固酶陰性葡萄球菌。富集增菌法在利奈唑胺和高濃度莫匹羅星中出現(xiàn)1.0%VME而直接法在替考拉寧中也有1.0%ME。直接法在MIE的發(fā)生率要高于富集增菌法，在米諾環(huán)素及莫西沙星檢測(cè)中的差異最為明顯，主要由腸球菌屬造成；提示該兩種抗菌藥物結(jié)果在腸球菌中不可靠，需要復(fù)測(cè)。兩種方法在諾氟沙星的檢測(cè)中都出現(xiàn)了較多的MIE，諾氟沙星臨床很少用于血流感染的治療，可以考慮刪除。此外，兩種方法在萬古霉素中發(fā)生的1例MIE，經(jīng)復(fù)核后確定為離心過程中污染導(dǎo)致。

表3 革蘭陽性球菌(非鏈球菌)兩種直接藥敏檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)藥敏方法檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

2.3.210例鏈球菌屬血培養(yǎng)陽性樣本使用SMIC/ID-2藥敏卡進(jìn)行評(píng)估 此板條覆蓋了阿莫西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、氯霉素、克林霉素、紅霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、美羅培南、莫西沙星、青霉素G、替考拉寧和四環(huán)素共13種抗菌藥物。與標(biāo)準(zhǔn)方法相比直接法和增菌法均表現(xiàn)良好，沒有出現(xiàn)任何錯(cuò)誤，CA為100.0%。

2.4藥敏結(jié)果CA分析 綜上所述，直接法與增菌法在不同菌株的一些抗菌藥物藥敏分析結(jié)果上有所差異。為了確定兩種方法對(duì)菌株的所有藥敏結(jié)果是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，現(xiàn)根據(jù)不同藥敏板歸類就CA、VME、ME及MIE進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩種方法在革蘭陰性菌和革蘭陽性球菌中的CA、VME、ME和MIE比例相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表4 兩種直接藥敏檢測(cè)方法與標(biāo)準(zhǔn)藥敏方法檢測(cè)結(jié)果的一致性分析[n(%)]

3 討 論

血培養(yǎng)是臨床診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，隨著MALDI-TOF MS在陽性血培養(yǎng)直接鑒定中的廣泛應(yīng)用，臨床已能夠在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得陽性血培養(yǎng)病原體鑒定結(jié)果，但傳統(tǒng)的體外藥敏試驗(yàn)仍無法提供快速準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果。臨床醫(yī)生在獲得準(zhǔn)確的體外藥敏結(jié)果以前，仍然被迫采取經(jīng)驗(yàn)性治療，不僅無法準(zhǔn)確地進(jìn)行病因治療，而且因非敏感抗菌藥物的治療增加住院時(shí)間和費(fèi)用，給個(gè)人及社會(huì)造成負(fù)擔(dān)，還可能誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生。因此臨床診療血流感染的關(guān)鍵不僅在于病原體的快速鑒定，快速準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果更是臨床迫切需要的。

近期新出現(xiàn)的自動(dòng)化全藥敏板條，為快速地進(jìn)行藥敏檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。通過前處理獲得標(biāo)準(zhǔn)濃度的菌懸液，在自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，不僅可以實(shí)現(xiàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化而且藥敏結(jié)果可以通過實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)自動(dòng)傳送到醫(yī)生工作站。單純藥敏板條結(jié)合目前已經(jīng)成熟的血培養(yǎng)直接萃取鑒定技術(shù)，快速準(zhǔn)確地提供血培養(yǎng)直接鑒定藥敏報(bào)告，幫助醫(yī)生盡早確定正確的治療方案[14-19]。

目前臨床微生物室的血培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)，不論是儀器MIC法還是手工K-B法，均需要轉(zhuǎn)種后獲得純菌落，制備標(biāo)準(zhǔn)濃度的菌懸液，再進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，需要2～3個(gè)工作日，無法滿足臨床對(duì)血流感染及時(shí)準(zhǔn)確治療的需求。歐洲臨床微生物和感染病學(xué)會(huì)藥敏委員會(huì)(EUCAST)在2019年發(fā)布了血培養(yǎng)快速藥敏實(shí)驗(yàn)折點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室將陽性血培養(yǎng)液直接涂布在MH瓊脂平板上，再貼上藥敏紙片經(jīng)孵育后通過抑菌圈的直徑來判斷直接藥敏的結(jié)果有了標(biāo)準(zhǔn)。但該折點(diǎn)僅覆蓋大腸埃希菌(8種抗菌藥物)、肺炎克雷伯菌(8種抗菌藥物)、銅綠假單胞菌(7種抗菌藥物)、鮑曼不動(dòng)桿菌(8種抗菌藥物)、金黃色葡萄球菌(4種抗菌藥物)、糞腸球菌(5種抗菌藥物)、屎腸球菌(5種抗菌藥物)和肺炎鏈球菌(5種抗菌藥物)，并不能覆蓋國(guó)內(nèi)血流感染的病原體，抗菌藥物組合也很難滿足臨床需要。

本研究中探究?jī)煞N血培養(yǎng)陽性樣本前處理方法直接藥敏試驗(yàn)的可行性，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不同的是[20]，本研究中采用兩種血培養(yǎng)陽性樣本直接萃取鑒定，通過樣本前處理結(jié)合單純藥敏板完成藥敏檢測(cè)，避免了使用復(fù)合板條所造成的鑒定結(jié)果不可靠和成功率低的問題。兩種前處理直接藥敏結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法類別一致性均>95.00%，完全符合臨床微生物對(duì)體外藥敏試驗(yàn)的要求。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種方法結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而直接沉淀法與增菌法相比操作簡(jiǎn)單無需繁瑣的增菌過程，能夠避免增菌過程中的污染可能，這種簡(jiǎn)單的前處理方法與標(biāo)準(zhǔn)方法類別一致性>95.00%。

綜上所述，直接沉淀法可作為微生物實(shí)驗(yàn)室血培養(yǎng)樣本傳統(tǒng)紙片法的一種方便又可靠的替代方法。