亞洲玉米螟的抗藥性監測及雙酰胺類藥劑抗性靶標分子檢測

支昊宇，王智慧，王興仔，丁新華，賈尊尊，郭文超，姜衛華

(1.南京農業大學植物保護學院，南京 210095；2.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；3.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)屬鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是世界性的玉米害蟲。該蟲可造成玉米10%～30%產量損失，嚴重時則達到50%以上，對玉米產量和質量產生了嚴重影響[1]。2014年新疆玉米種植面積為89.07×104hm2(1 366萬畝)左右，占其糧食種植總面積的41.02%，亞洲玉米螟(以下簡稱玉米螟)也是新疆玉米生產上發生最重、危害最大的害蟲之一[2]。化學控制是防治該蟲的主要方式之一，但隨著殺蟲劑頻繁施用，玉米螟會產生抗性問題[3-5]。雙酰胺類藥劑作用靶標為魚尼丁受體(Ryanodine receptor，RyR)，包括氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺等，因其對鱗翅目高效，與其他常用藥劑無交互抗性。氯蟲苯甲酰胺等的該類藥劑逐步推廣用于玉米螟的田間防治[2,6]，有關抗性機制的研究有助于為該蟲的抗性治理提供技術儲備和指導。【前人研究進展】近年來，小菜蛾(Plutellaxylostella)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、二化螟(Chilosuppressalis)、煙粉虱(Bemisiatabaci)等重要農業害蟲對氯蟲苯甲酰胺和(或)溴氰蟲酰胺已產生了不同程度的抗性[7-10]。魚尼丁受體基因突變和表達量的變化是害蟲對雙酰胺類殺蟲劑產生抗性的重要機制。Troczka等[11]研究發現，對氯蟲苯甲酰胺具200多倍抗性的泰國和菲律賓小菜蛾田間種群魚尼丁受體TM1和TM2跨膜區之間發生點突變，高度保守的第4 946位甘氨酸(GGG)突變為谷氨酸(GAA)，推測G4946E突變可能引起小菜蛾抗藥性的產生。Guo等[12]在國內的抗性小菜蛾種群中證實了該突變的存在，又發現云南通海小菜蛾田間種群的魚尼丁受體基因存在3個新的突變位點，分別是第1 338位的谷氨酸突變為纈氨酸(E1338D)，第4 594位谷氨酰胺突變為亮氨酸(Q4594L)和第4 790位的異亮氨酸突變為甲硫氨酸(I4790M)，分析抗性遺傳連鎖及魚尼丁受體與藥劑的結合動力學，這幾個突變可通過不同組合參與小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性形成[13]。定量PCR分析發現對氯蟲苯甲酰胺產生16.8倍抗性的小菜蛾和室內連續篩選的甜菜夜蛾抗氯蟲苯甲酰胺高抗品系(105.6倍)1、2 和4齡幼蟲的魚尼丁受體mRNA表達量都顯著高于敏感品系，RyR的表達量變化與氯蟲苯甲酰胺誘導有關[14-15]。【本研究切入點】新疆地區近年來玉米螟的危害嚴重，目前有關玉米螟對雙酰胺藥劑的抗性研究尚無相關報道。研究玉米螟田間種群對常用藥劑的抗性動態。【擬解決的關鍵問題】測定新疆不同玉米螟田間種群對包含雙酰胺類藥劑氯蟲苯甲酰胺、溴氰蟲酰胺等常用藥劑的抗性水平，分析新疆不同田間種群魚尼丁受體基因表達量和分子序列的差異，研究新疆玉米螟對雙酰胺類藥劑的靶標抗性分子機制，為指導田間合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試蟲源

在2018、2019年3～4月分別于新疆伊寧市、疏勒縣、烏魯木齊市、昌吉市采集玉米螟越冬期老熟幼蟲，轉至室內利用人工飼料飼養。敏感種群(JZ-S)由河南省濟源白云實業有限公司(焦作)2018年12月贈送，室內自2015年不接觸藥劑飼養至今。養蟲室條件為溫度(26±1)℃，相對濕度60%，光暗時間為16 h/8 h，抗性測定以3齡幼蟲為試蟲；收集各種群3齡幼蟲，保存在-80℃度冰箱中，用于定量PCR測定以及突變檢測。表1

表1 亞洲玉米螟來源及寄主Table 1 Sampling sites and host crop for Ostriniafurnacalis

1.1.2 供試藥劑

20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑(Chlorantraniliprole，美國杜邦公司)；10%溴氰蟲酰胺可分散油懸浮劑(Cyantraniliprole,美國杜邦公司)；22%噻蟲嗪·高效氯氟氰菊酯(阿立卡，Arica)微囊懸浮劑(先正達(蘇州)作物保護有限公司)；6%阿維菌素·氯蟲苯甲酰胺(亮泰，Langat)懸浮劑(先正達(蘇州)作物保護有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 毒力測定

利用人工飼料浸藥法測定抗性，利用清水將各制劑按梯度稀釋為不同濃度的藥液，將人工飼料(2 cm×2 cm)在不同濃度的藥液中浸漬10s，取出晾干后放入培養皿(直徑9 cm)中，每皿接入玉米螟3齡幼蟲10頭，以浸泡清水的飼料作為對照。每個處理重復3次。處理72 h后分別檢查玉米螟的死亡情況，以毛筆輕觸蟲體不能正常活動為死亡標準。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

按照Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)將玉米螟3齡幼蟲單頭提取總RNA，然后按照Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)說明書合成cDNA，將產物保存于-20℃。

1.2.3 實時熒光定量PCR分析

根據Genebank上玉米螟魚尼丁受體基因的序列(登錄號KC355370)，設計一對特異性引物OfRyF和OfRyR，同時以β-actin作為內參基因[16]。定量PCR反應在熒光定量7500型PCR 儀(美國ABI 公司)進行。按照ChamQTMSYBR?qPCR Master Mix熒光定量試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司)進行反應，用稀釋5倍的cDNA為模板，反應體系(20 μL)：2.5×Real Master Mix(SYBR Green)10 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，去RNA酶ddH2O 7 μL；反應程序：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 35 s，40個循環。陰性對照以去RNA酶ddH2O為模板，每個處理重復4次。利用特異性引物分別對目的基因和β-actin進行熒光定量PCR測定，以稀釋度的負對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標建立熒光定量PCR標準曲線。

1.2.4 玉米螟魚尼丁受體基因突變檢測

參照小菜蛾魚尼丁受體(PxRyR)的突變位點E1338D、Q4594L和I4790E[13]，用GENEDOC軟件比對得到對應于PxRyR突變位點的OfRyR位點分別為1 424、4 583和4 782，用Primer 5設計引物，由金斯瑞生物技術有限公司合成。突變檢測PCR反應體系25 μL，包括2×TaqMaster Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)2.5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，去RNA酶ddH2O 9.5 μL。反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，根據不同引物Tm值退火30 s，72℃延伸30 s，循環數為35，最后72℃延伸10 min。反應在PCR擴增儀T100(美國BIO-RAD公司)進行。PCR產物由上海杰李公司測序。表2

表2 玉米螟魚尼丁受體基因引物設計Table 2 Design of primers for OfRyR

1.3 數據處理

死亡率和校正死亡率的計算使用Abbott公式，采用機率值分析法計算毒力回歸曲線、LD50值、相關系數及95%置信限，抗性倍數(RR)=測試種群的LC50/相對敏感種群(或敏感種群)的LC50，抗藥性水平參照以下標準：RR低于3.0倍為敏感；3.0～5.0倍為敏感性下降；5.0～10.0倍為低水平抗性；10.0～40.0倍為中等水平抗性；40.0～160.0倍為高水平抗性；高于160.0倍為極高水平抗性[17]。

采用2-ΔΔCt方法[18]計算魚尼丁受體基因相對表達量，利用SPSS 18.0 軟件對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Tukey進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 新疆玉米螟種群的抗性監測

研究表明，2018年所有測試種群中烏魯木齊種群對氯蟲苯甲酰胺和阿立卡最為敏感(LC50分別為0.341 6和2.092 2 μg/mL)，與烏魯木齊種群相比：疏勒種群對氯蟲苯甲酰胺為敏感性較低，抗性倍數(RR)為3.67倍，其它種群保持敏感；在所有測試的藥劑中，各玉米螟田間種群對阿立卡的敏感性普遍較低，疏勒縣、伊寧市和澤普縣玉米螟對阿立卡都為中等水平抗性，RR分別為20.17、14.10和10.97倍。所有測試種群中疏勒種群對溴氰蟲酰胺和亮泰的敏感性最高(LC50分別為0.191 2和0.041 4 μg/mL)，伊寧市、烏魯木齊市種群對溴氰蟲酰胺的抗性倍數分別為15.26、3.53倍，為中等水平抗性和敏感性降低，澤普種群表現敏感；伊寧市和澤普縣種群對亮泰為敏感性降低和中等水平抗性，其抗性倍數分別為4.38和13.48倍，烏魯木齊市種群保持敏感(RR2.15倍)。

2019年與敏感種群JZ-S相比，各田間種群對阿立卡都保持敏感，而對溴氰蟲酰胺都產生了不同水平的抗性，其中疏勒種群為敏感性降低，烏魯木齊和伊寧種群都發展了低到高水平抗性，昌吉種群達到極高水平抗性，抗性倍數分別為3.61、8.14、96.49和1 429.34 倍。表3

表3 新疆不同地區玉米螟對常用殺蟲劑的抗性水平Table 3 Resistance to commonly used insecticide of Ostriniafurnacalis populations in Xinjiang using artificial diet-dipping method

2.2 新疆不同玉米螟種群魚尼丁受體表達量

研究表明，2018年采集的玉米螟各種群的魚尼丁受體基因OfRyR相對表達量之間無顯著差異(圖1A)；而2019年各種群的OfRyR表達量之間有明顯差異，其中昌吉種群(CJ)OfRyR的表達量最高，伊寧種群(YN2)的表達量次之，都顯著高于敏感種群JZ-S,表達量分別是JZ-S的4.04和3.85倍；烏魯木齊(UQ)和疏勒(SL2)種群的表達量最低，且與JZ-S無顯著差異(圖1B)。圖1

注：圖中數據為平均數±標準誤，不同的字母表示差異顯著(P<0.05)Note:Data are mean±SE.Different letters indicate significant difference at P<0.05 level圖1 2018和2019年新疆玉米螟不同種群的魚尼丁受體表達量Fig.1 Relative expression of ryanodine receptor in different populations of Ostriniafurnacalis from Xinjiang in 2018(A)and 2019(B)

2.3 新疆不同玉米螟種群魚尼丁受體基因突變檢測

研究表明，測試種群OfRyR的第1 339、4 534、4 733及4 890位點(分別對應于小菜蛾PxRyR的E1338D、Q4594L、I4790M和G4946E突變位點)都未檢測到氨基酸替換。圖2

3 討 論

害蟲抗藥性監測是指導田間殺蟲劑正確合理使用的基礎，其既可篩選有效的替代藥劑，也為抗性機理的研究與分析提供理論依據[19]。2018年抗性監測結果顯示，烏魯木齊種群除了對溴氰蟲酰胺敏感性降低(RR為3.53倍)，對其它測試殺蟲劑均為敏感，疏勒種群對氯蟲苯甲酰胺的敏感性下降(RR為4.00倍)；伊寧種群對溴氰蟲酰胺和阿立卡產生中等抗性，對亮泰為敏感性降低(RR分別為15.26、14.10和4.38倍)；疏勒種群對阿立卡達到中等水平抗性(RR為20.17倍)；澤普種群對阿立卡和亮泰都產生中等水平抗性，抗性倍數分別為10.97和13.48倍。2019年新疆4個地區的玉米螟抗性測定結果顯示，伊寧、昌吉種群已對溴氰蟲酰胺產生了高至極高水平的抗性，抗性倍數最高達1 429倍。害蟲對常用殺蟲劑敏感性下降、產生抗性的速度和幅度與藥劑的持續選擇壓力有關。通過玉米螟采集地施藥情況調查發現，烏魯木齊地區主要以生物防治為主，對多數藥劑表現較高的敏感性，而疏勒、澤普種群防治以雙酰胺類或雙酰胺類復配劑為主，伊寧、昌吉地區防治玉米螟則以雙酰胺類藥劑氯蟲苯甲酰胺、四氯蟲酰胺、擬除蟲菊酯類藥劑為主，由于這些地區使用雙酰胺類藥劑的頻次較高，較高選擇壓造成當地玉米螟對氯蟲苯甲酰胺及其復配劑以及溴氰蟲酰胺敏感性降低至產生高水平抗性。研究表明，番茄斑潛蠅、斜紋夜蛾、小菜蛾和二化螟對溴氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺存在明顯的交互抗性[10,20-22]。研究調查發現，各地區防治玉米螟施用溴氰蟲酰胺較少，則當地種群對該藥劑的高水平抗性是否源于氯蟲苯甲酰胺或者其他藥劑的交互抗性有待調查確定。由此可以看出，如何減緩新疆玉米螟對雙酰胺類藥劑尤其是溴氰蟲酰胺的抗性已成為亟需解決的問題，在今后的的玉米螟防治中注意合理用藥，盡量避免在高齡或成蟲期用藥，輪換使用作用機制不同的殺蟲劑，并開展相關的持續的抗性監測及治理工作。

在連續2年監測玉米螟對常用殺蟲劑的抗性水平時，發現新疆玉米螟對雙酰胺類殺蟲劑及其復配劑都有不同程度的抗性，且其致死中濃度也存在較大的波動性，玉米螟對常用殺蟲劑的田間抗性是復雜且是不穩定的。研究發現，室內選育的玫瑰色卷蛾抗氯蟲苯甲酰胺品系抗性不穩定，停止篩選5代后敏感性就恢復到選育前的水平[23]；對氯蟲苯甲酰胺具極高水平抗性的田間小菜蛾種群(2 040倍)在室內不接觸藥劑飼養7代其抗性降低至25倍[9]。通過輪換藥劑使用、減低殺蟲劑使用頻次等科學合理的治理策略，是能夠延緩玉米螟對雙酰胺類藥劑的抗性發展并延長殺蟲劑的使用壽命。

許多研究已經證實，靶標抗性是害蟲對雙酰胺類藥劑產生抗性的重要機制，其中魚尼丁受體基因表達量的變化是抗性機制之一，研究表明，害蟲抗性種群的魚尼丁受體基因表達量顯著升高。孫麗娜等[14]研究發現，對氯蟲苯甲酰胺具中等水平抗性的小菜蛾種群魚尼丁受體mRNA表達量相對于敏感品系顯著提高(5.79倍)；鄧放等[24]研究發現，氯蟲苯甲酰胺可誘導菜青蟲魚尼丁受體mRNA的表達水平，抗性菜青蟲種群(36.3倍)魚尼丁受體mRNA的表達量是敏感種群的6.32倍；王少麗等[15]用氯蟲苯甲酰胺連續篩選甜菜夜蛾31代，得到105.6倍的抗性品系，定量PCR結果表明，抗性品系1、2和4齡幼蟲的魚尼丁受體基因表達量顯著增加，分別為敏感種群的5.99、2.79和2.14倍，一方面表明魚尼丁受體表達量的變化與甜菜夜蛾抗性形成有關，另一方面也說明甜菜夜蛾抗藥性的形成可能主要表現在幼蟲階段；Jouraku等[25]通過RNA測序比較發現對氟蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺具極高水平抗性的日本熊本縣小菜蛾種群RyR的表達量是敏感品系的11.5～22.2倍。定量PCR分析結果表明，2018年新疆玉米螟不同種群的魚尼丁受體基因的表達量之間無顯著差異，測試的4個種群中僅伊寧種群對溴氰蟲酰胺具中水平抗性，烏魯木齊種群對溴氰蟲酰胺及疏勒種群對氯蟲苯甲酰胺都為敏感性降低；而在2019年各田間種群RyR的表達量均高于敏感種群，其中對溴氰蟲酰胺產生極高水平抗性的昌吉種群RyR表達量最高，其次是具高水平抗性的伊寧種群，對溴氰蟲酰胺低抗和敏感性降低的烏魯木齊和疏勒種群的RyR表達量最低，且昌吉和伊寧種群RyR的表達量與敏感種群相比差異顯著，可以看出各種群RyR表達量與其對溴氰蟲酰胺的抗性水平有一定的正相關性。

害蟲對雙酰胺藥劑抗性的另一個重要的靶標機制即魚尼丁受體產生單點突變，目前相關研究已取得不少進展，其中多數為小菜蛾的報道。Troczka等[11]通過魚尼丁受體序列比對首次發現泰國和菲律賓對氯蟲苯甲酰胺產生高水平抗性的小菜蛾田間種群存在G4946E突變；G4946E位點位于RyR基因羧基末端的第4跨膜區與第4和第5跨膜區的胞外連接環之間，在已知的所有昆蟲魚尼丁受體中高度保守，該突變削弱了氟蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的結合力，這一突變是導致小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺產生高水平抗性的重要原因，隨即有不少相關后續報道。Guo等[12-13]通過檢測發現，我國廣東小菜蛾田間氯蟲苯甲酰胺高抗種群也存在G4946E突變，相關性分析發現該突變頻率與種群對氯蟲苯甲酰胺的抗性倍數之間呈明顯的正相關(R2=0.82，P=0.000 3)，對云南氯蟲苯甲酰胺高抗(2 128倍)小菜蛾田間種群進行檢測發現魚尼丁受體基因新的3個突變(E1338D、Q4594L和I4790M)，且通過連鎖關系分析表明，這4個突變通過不同的組合共同導致了小菜蛾對氯蟲苯甲酰胺的抗性；Yao等[26]同樣也發現在對氯蟲苯甲酰胺和氟蟲雙酰胺分別產生了77.6和42.6倍抗性的浙江余姚二化螟田間種群魚尼丁受體中存在G4910E突變；而Lu等[27]檢測發現我國東部和中部地區8個二化螟種群RyR存在G4946E，突變頻率達15%～56.7%，但相關性分析發現G4946E突變頻率與二化螟種群對氯蟲苯甲酰胺的抗性水平之間沒有顯著相關性，推測還可能存在其他突變與G4946E共同承擔抗性的產生；Jouraku等[25]發現在2個對氟蟲酰胺、氯蟲苯甲酰胺和溴氰蟲酰胺高抗的小菜蛾抗性種群RyR中存在G4946和I4790K，功能驗證表明，I4790K是小菜蛾對溴氰蟲酰胺產生抗性的主要因素。突變檢測結果顯示2019年采集的新疆玉米螟抗性種群RyR都不存在E1339D、Q4534L、I4733M和G4890E突變。可見不同蟲種、不同背景下的雙酰胺類藥劑抗性機制是有差異的。由于不同田間種群間存在地理隔離及用藥歷史背景的差異，可能會由于其他藥劑抗性導致的突變或者還存在其他未知的突變引起雙酰胺類藥劑抗性，因此，還需大量采集田間玉米螟，檢測抗性種群RyR表達量的變化及其中已報道的點突變、突變頻率，同時關注是否有新的突變形成，這將有助于揭示玉米螟對雙酰胺類殺蟲藥劑的抗性演化。

4 結 論

新疆玉米螟對雙酰胺類藥劑的敏感性顯著降低，其中2018年測定顯示具有對氯蟲苯甲酰胺低敏感性、對阿立卡、亮泰及溴氰蟲酰胺產生中等水平抗性的田間種群，2019年采集的昌吉和伊寧種群對溴氰蟲酰胺已達高水平抗性，魚尼丁受體表達量的增加以及E1424D突變是抗性產生的重要機制。