石竹葉斑病病原鑒定

李 番，任毓忠，焦瑞蓮，孫 璘，李國英

(新疆綠洲農業病蟲害治理與植保資源利用自治區高校重點實驗室/石河子大學農學院，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意義】石竹(DianthuschinensisL.)。屬多年生草本，自然花期5～9月，適應性廣，喜光照充足、干燥、通風和排水良好的土壤。我國共有石竹屬植物16種，其中8個為新疆特有種[1]。石竹具有很高的藥用價值和經濟價值[2]，石竹花色豐富，花形優美[3]。隨著種植面積的不斷增加，給病害的傳播和擴散提供了有利條件。【前人究進展】石竹病害有30多種[4,5,6]，國內已發生的病害有：黑斑病(A.dianthi)、銹病(Uromycesdianthi)、白粉病(Erysiphebuhrii)、灰斑病(Heterosporiumechinulatum)、枯萎病(Fusariumoxysporum)、根腐疫病(Phytopathoraspp)、病毒病和黃化植原體病等。其中，葉斑病是最常見且危害嚴重的病害之一，引起石竹葉斑病的病原主要有兩類，鏈格孢屬(A.dianthi和A.tenuissima)和匍柄霉屬(Stemphylium)。【本研究切入點】新疆關于石竹病害鮮有報道。2018年5月新疆石河子市區種植的石竹花上出現一種病害，植株葉片、莖稈和花柄上出現中間白邊緣紫紅色斑點，造成植株葉片干枯，甚至整株干枯死亡。該病害的病原尚不明確，難以防治。研究鑒定石竹葉斑病病原。【擬解決的關鍵問題】研究引起石竹病害的病原菌進行形態學觀察和分子生物學特性，分析其致病菌，為該病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

2018年6月，在石河子市區種植的石竹上，采集表現明顯葉斑病癥狀的葉子及植株帶回實驗室內，按照常規組織分離法[7]對病樣進行分離，分離時采用PDA培養基，將分離后獲得菌株進行單胞純化，依據菌落形態特征選取8個菌株作為代表性菌株，供致病性測定和病原鑒定，分別編號為XJ-A、XJ-B、XJ-C至XJ-H，用PDA斜面4℃保存備用。

1.2 方 法

1.2.1 致病性鑒定

致病性鑒定選用的健康石竹幼苗購于石河子市苗木基地。致病性鑒定采用菌絲塊貼接法和噴霧法2種方法。

1.2.1.1 菌絲塊貼接法

將供試菌株于PDA培養基上進行活化培養7～8 d，用直徑為5 mm無菌打孔器打取菌落邊緣菌餅，將菌絲面貼于已經消毒的健康石竹葉上，每一菌株接種10片葉子，以無菌PDA培養基作為空白對照；

1.2.1.2 噴霧法接種

刮取在培養基上已大量產孢的菌落表層，雙層紗布過濾后，用無菌水配置成1×106cfu/mL的孢子懸浮液進行噴霧接種，以無菌水作為空白對照，設置重復3次。接種后用透明塑料薄膜分別罩住接種后的植株為其保濕，3 d后揭掉塑料薄膜，連續觀察接種植株的發病情況，對發病植株組織再進行組織分離。

1.2.2 病原菌鑒定

1.2.2.1 病菌培養特性(1)病菌在不同培養基上的生長情況

選用馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)、馬鈴薯蔗糖培養基(PSA)、水瓊脂(WA)、玉米粉瓊脂培養基(CMA)和石竹葉培養基，石竹葉培養基參考胡翠鳳等[8]的制作方法。將PDA上活化的XJ-H菌株，按照致病性鑒定相同方法打取菌餅，挑取菌餅分別接于5種培養基中央，28℃恒溫培養，采用張建寧[9]的方法每天測量菌落直徑，共測量7 d，計算菌落的日生長量并觀察菌株在不同培養基上的生長狀況，每個處理設置3次重復。

(2)病菌形態特征

選用5種培養基及不同的培養條件，誘發病菌分生孢子的產生。具體方法如下：將接有XJ-H菌餅的不同培養基平板置28℃恒溫黑暗培養，待菌落布滿整個培養皿后，采用丁成等[10]刺激鏈格孢產生孢子的方法，將菌落表面的菌絲刮除，并用紫外燈照射30 min，將平板分別置于18℃完全黑暗和光暗交替(光照∶黑暗=1∶1)的培養箱中，低溫培養7 d，鏡檢觀察不同培養基及不同光照處理的平板上是否產生分生孢子，并對分生孢子梗、分生孢子的形狀、顏色進行觀察和測量(至少測量50個)，每個處理設置3次重復，參考《中國真菌志》鑒定病原菌。

1.2.2.2 分子生物學鑒定

刮取PDA平板上28℃恒溫培養7 d的菌絲，利用真菌DNA提取試劑盒進行菌株基因組DNA的提取，-20℃保存備用。選用以下3組引物進行PCR擴增，包括rDNA-ITS區域引物ITS1/ITS4、β-微管蛋白基因引物β-tubulin 2a/β-tubulin 2b，以及組蛋白3基因引物H3-1a/H3-1b。PCR擴增條件參照岳永亮[11]和劉威等[12]的方法進行，PCR擴增后產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，將PCR產物委托上海生工生物工程股份有限公司進行序列測定。將所測得序列經過校準后在NCBI的GenBank數據庫進行Blast比對，并下載已登錄的相似序列進行同源性分析，利用MEGA5.22軟件采用鄰接法(NJ)，進行多基因系統發育樹的構建。表1

表1 PCR擴增的引物Table 1 Primers for PCR amplification

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及代表菌株的選擇

從采集的病樣中分離了31個鏈格孢屬菌株，依據菌落形態特征選取8個作為代表性菌株，供致病性測定和病原鑒定，分別編號為XJ-A、XJ-B、XJ-C至XJ-H。

2.2 病害癥狀

病害田間癥狀主要以危害葉片為主，也感染花朵和莖稈，通常近地面下部葉片最先發病，然后向上擴展，發病初期病斑呈圓形或橢圓形，大多病斑呈紫紅色至紫黑色，部分病斑褐色(圖1A)；中后期病斑中央顏色逐漸變為淡褐色，病斑逐漸擴大連接成片，葉子逐漸發黃萎蔫，最后整片葉子發白為枯稻草色(圖1B)，潮濕時葉片上產生深灰色菌絲和分生孢子。侵染莖稈后，維管束被破壞，侵染部位以上便萎蔫枯死，花蕾上病斑多發生在花柄上，導致整個花蕾枯死(圖1C)。圖1

注：A:感病初期葉片癥狀；B:感病中后期葉片癥狀；C:花蕾枯死癥狀Note:A:Early leaf symptoms;B:Middle and Late leaf symptoms;C:Dead bud symptoms圖1 石竹葉斑病田間癥狀Fig.1 Symptoms of leaf spot on the in Dianthus chinensis field

2.3 致病性鑒定

研究表明，無論是菌絲塊貼接法，還是孢子懸浮液噴霧接種，8個代表菌株均能在接種3 d后葉片上出現癥狀，7 d后有明顯的紫褐色病斑出現，病斑初期為黑褐色，周圍有黃色暈圈，10～15 d病斑逐漸擴展為大病斑(圖2A)，后整片葉子枯死呈稻草黃色(圖2B)，與大田癥狀一致，對照植株表現正常(圖2C)，從接種后發病的病斑上再次分離、純化，得到相同病原菌，所選擇的代表菌株為石竹葉斑病的致病菌。圖2

注：A:接種植物癥狀；B:葉片枯死癥狀；C:健康植株Note:A:Symptoms of inoculated plants;B:Dead leave symptoms;C:Healthy plant圖2 致病性測定Fig.2 Results of pathogenicity test

2.4 病原菌鑒定

2.4.1 病菌培養特性

研究表明，病原菌在上述5種培養基上都可生長，在石竹葉培養基上生長最快，其次是在PDA培養基、PSA培養基與CMA培養基，在WA培養基上生長最慢。病原菌在石竹葉培養基上，初期菌落為白色，后為灰色且呈輪紋狀；在PSA與PDA培養基上菌落形態相似，菌落為圓形，初期正面為灰綠色，后期菌落顏色逐漸加深，呈墨綠色，菌落上菌絲轉為灰白色，PDA培養基上菌落菌絲較PSA邊緣菌絲濃密匍匐生長；在CMA培養基上，初期菌落為淺墨綠色，后逐漸轉為黑綠色，菌落中央凸起為臺狀，菌絲濃密；WA上病原菌落生長緩慢，有向周圍生長的白色菌絲。表2，圖3

表2 不同培養基上菌落生長速率及產孢Table 2 Colonies growth rate and sporulation in different culture media

注：a～e:分別為菌株在PDA、PSA、CMA、石竹葉和WA培養基上的菌落形態Note:a-e:Colony on the medium of PDA,PSA,CMA,Dianthus chinensis leaf and WA respectively圖3 不同培養基上的培養特性Fig.3 Colony of isolation in different culture media

2.4.2 病菌形態特征

供試的XJ-H菌株在刮除菌絲和紫外照射30 min刺激處理后，分別置于不同光照條件下18℃低溫培養，在石竹葉、PDA、CMA和WA培養基上完全黑暗和光暗交替條件下培養均未產生分生孢子，在PSA培養基黑暗培養也未產生分生孢子，只有用PSA培養基刮除菌絲+紫外照射30 min且18℃光暗交替(光∶暗=1∶1)培養，才有大量分生孢子的產生，且分生孢子都能萌發。

菌株的分生孢子梗單生或者簇生，褐色(圖4D)；分生孢子褐色、2～7個串生(圖4C)，未完全成熟時分生孢子為柱形，老熟的分生孢子倒梨形或長倒棍棒形，分生孢子大小為17.25～80.37 μm×10.85～18.17 μm，有4～9個橫隔，0～6個縱隔或斜隔，橫隔處略溢縮，且顏色較深(圖4A,B)。喙淺褐色，喙端稍膨大，喙大小為12.37～38.94 μm×2.51～5.60 μm。圖4

注:A:PSA上分生孢子形態;B:發病葉片上分生孢子形態;C:串生分生孢子;D:分生孢子梗Note:A:Conidial on PSA;B:Conidial on infected leaves;C:Conidia chains;D:Conidiophores圖4 石竹葉斑病病原菌形態學特征Fig.4 Morphology of in Dianthus chinensis leaf spot

2.4.3 分子生物學鑒定

研究表明，利用rDNA-ITS區、組蛋白3、β-微管蛋白基因的引物對供試菌株進行PCR擴增，獲得長度分別為571、490和346 bp長度的DNA片段，利用NCBI進行Blast同源性比對，供試的8個菌株ITS區序列與A.nobili(登錄號：LC4405931)和A.dianthi(登錄號：AY154702)序列同源性99.65%～100%；β-tubuliny序列與A.nobilis(登錄號：JQ672017)的同源性達99.42%～99.96%；組蛋白3序列與最接近的細極鏈格孢(登錄號：KF996967)序列同源性僅為82.83%～86.94%。而細極鏈格孢菌的ITS區序列和β-tubuliny序列與待測菌株的同源性分別為95.28%和97.12%。由于在GenBank中沒有查詢到關于石竹鏈格孢菌的組蛋白3序列信息，將ITS區序列與β-tubuliny序列進行拼接，選擇引起石竹枯萎病的鐮孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.dianthi)作為外群序列，供試的8個菌株均與A.nobilis和A.dianthi聚為同一組。圖5，圖6

注:A:引物ITS1/ITS4；B：引物β-tubulin2a/β-tubulin 2b；C:引物H3-1a/H3-1b.M DNA Mark；CK：陰性對照；泳道1～8：分別為供試菌株XJ-A～XJ-HNote:A:primer ITS1/ITS4;B:primer β-tubulin2a/β-tubulin2b;C:primer:H3-1a/H3-1b;M Molecular size marker，CK:Negative control;Lane:Test strain XJ-A～XJ-H圖5 供試菌株 rDNA-ITS,β-tubuliny和組蛋白3基因PCR擴增Fig.5 rDNA-ITS,tub2 and H3 gene PCR amplification of A. dianthi

圖6 基于ITS和β-tubuliny序列組合的系統發育樹Fig.6 Phylogenetic relationships of Alternaria dianthi based on sequence ITS-tub2

3 討 論

試驗供試的XJ-H病菌的培養特性與形態特征與胡翠鳳等[13]報道的香石竹葉斑病菌形態相似，鑒定為Alternariadianthi。引起石河子地區石竹葉斑病的病原為石竹鏈格孢菌A.dianthi，經查閱資料A.dianthi與2002年已更名為A.nobilis[14]。

鏈格孢屬真菌廣泛分布于自然界中，不僅可以危害植物，有時也會對人類造成感染，引起甲癬等疾病[15]。鏈格孢屬中大孢子鏈格孢常侵染植物，引起植株葉斑病。石竹鏈格孢A.dianthi為鏈格孢屬中大孢子之一，據報道引起石竹病害的鏈格孢屬病原菌共24種，名稱沿用至今的有12種，包括A.nobilis(dianthi)、A.vaccariae、A.juxtiseptata、A.subeliptica、A.diagostic等[16]，以上鏈格孢屬真菌在生物學特征上也極為相似，只能通過觀察菌體的生長和分隔模式等細節進行分類和鑒定，這就讓分類變得更加復雜。利用真菌rDNA-ITS區及多種基因序列的比對和同源性分析已在植物病害病原的鑒定中普遍使用，研究將病菌形態特征的觀察與多基因測序分析相結合，使得鑒定結果更加可靠。

試驗過程中發現，一般田間采集的植物發病葉片都可觀察到大量的分生孢子，但在PDA培養基上A.dianthi幾乎不產生分生孢子，試驗應用PSA培養基+刮除菌絲，同時結合紫外線照射和低溫(18℃)光暗交替培養的方法，使A.dianthi產生大量分生孢子，且孢子大多數都能正常發芽，表明了傷害脅迫處理、紫外照射和變溫培養等方法能成功誘導該病菌產孢[17]。另外，試驗中也發現，發病葉片上收集的分生孢子與誘發培養的在形態上存在一定的差異，這可能與病菌生長的營養條件和環境條件差異相關。據報道，田間病殘體和帶病植株是初侵染的主要來源，病害隨帶病幼苗調運進行遠距離傳播，田間分生孢子主要借風雨傳播和侵染，并且葉斑病常發生于近地面植物葉片，在新抽出的葉子中較少[18]。在病害的控制上，可通過清潔田園中植株病殘體、輪作、早期藥劑防治、植物檢疫，對于發病較輕的植株可摘去基部葉片等措施進行病害的防控。

與A.dianthi發病癥狀相似的有Heterosporiumechinulatum[19]，2種病害的相同點是2種病害均可以感染石竹屬植物，形成葉斑。不同點A.dianthi可引起石竹屬植物葉斑病，潛伏期3 d左右，溫度達到15～25℃時被感染植株出現癥狀；Heterosporiumechinulatum僅寄生石竹屬中部分植物，潛伏期1周左右，出現感病癥狀的溫度低于A.dianthi。2種病害通常不易區分，因此，除借助分子學手段，田間可通過病害發生的時間和溫度等來輔助病害種類的診斷。鐮刀菌引起的萎蔫病也是石竹上的破壞性病害[20]，發病時間相近，因此，在病害防治時因注意通防統治，避免病害發生連續不斷，造成經濟損失。

4 結 論

供試菌株均有致病性。將供試菌株ITS區與β-tubulin序列進行比對分析，其序列與A.nobilis序列的同源性均高達99%以上，ITS-β-tubulin建立的多基因聯合系統發育樹顯示，8個致病菌株與A.dianthi和A.nobilis聚在1個組，A.dianthi和A.nobilis為同種異名。結合形態學觀察與ITS-β-tubulin建立的多基因聯合系統發育樹分析，引起石河子地區石竹葉斑病的主要病原為Alternariadianthi(nobilis)。