4種抗生素用于干木耳組織分離方法的評價

陳艷琦，呂艷聰，賈培松，張芳芳，田 龍，宋 冰，李 玉

(1.吉林農業大學食藥用菌教育部工程研究中心，長春 130118；2.新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；3.嘉興市經濟菌物新種質資源創制重點實驗室，浙江嘉興 314000)

0 引 言

【研究意義】黑木耳(AuriculariaheimuerF.Wu et al.)和毛木耳(AuriculariacorneaEhrenb)[1]在我國栽培歷史悠久，野生種質資源廣泛分布在全國各地。木耳是一種市場廣闊的木腐食藥用菌[2]，作為特色農產品干木耳已躋身我國出口蔬菜排名前10位[3]，隨著產業規模的逐漸擴大，木耳已成為世界上第三重要的栽培食用菌[4]。篩選出4種抗生素用于干木耳組織分離方法，為木耳類膠質菌種質資源的收集提供簡便的操作方法和重要的參考依據。【前人研究進展】木耳類真菌菌種獲得的方法主要有3種：孢子分離法、基物分離法(也叫菇木分離法、耳木分離法、寄主分離法)以及組織分離法。1960年之前以孢子分離法為主，如銀耳栽培使用孢子做菌種[5]。對銀耳有伴生菌[6]、木耳為異宗結合擔子菌研究發現，不同孢子攜帶的遺傳物質不同，而后孢子分離法主要用于獲得單胞菌株作為進行遺傳育種的重要研究材料[7,8]。在1980～1990年間認為基物分離法成活率高、操作簡單，因此，使用較多，在消毒方法上可使用升汞浸泡消毒[9,10]和火焰灼燒表面消毒[11]，也可直接取中心菇木或菌袋中心小塊進行分離[12]。1980年開始逐漸探索應用的組織分離法包括：原基分離、鮮耳片分離、干耳片泡發后分離和干耳片分離。原基分離法是通過環境調節使種瓶(袋)產生原基或幼小子實體，在無菌環境下打破種瓶(袋)取新鮮組織的小塊培養的方法[13,14]。鮮耳分離法是通過選取朵大新鮮的耳片，在無菌條件下使用無菌水進行反復沖洗或浸泡，再使用剪刀、小刀剪成小塊培養的方法[10]，也可使用鏈霉素溶液浸泡后培養[15]，或以酒精、升汞等消毒處理后撕開，取菌肉小塊膠質培養[16]。干耳片萌發能力被發現后，開始使用自然曬干或低溫烘干的干耳片進行組織分離。消毒方法有：使用甲醛、高錳酸鉀等消毒藥劑熏蒸干耳后取小塊培養[17,18]；酒精擦拭干耳，取小塊于火焰外焰快速穿梭2～3次后培養[19]；將干耳取小塊浸泡于含有青霉素、鏈霉素的酒精溶液中分離[20]。隨著抗生素在組織分離研究方面的應用，添加一定劑量青霉素、鏈霉素于試管[21]、平板[22]中以提高菌種分離成功率的方法逐漸引用到木耳類真菌組織分離中。【本研究切入點】干耳分離法是木耳菌種收集的快速高效方法，但目前存在使用的抗生素單一、方法不明確、缺乏組織分離前耳片干制方法研究的問題，對木耳不同結構的萌發能力缺乏研究。研究并篩選出4種抗生素的使用方法及用于木耳的干制條件。【擬解決的關鍵問題】通過設置4種抗生素的不同使用條件，4種常用抗生素酒精溶液的配制方法及處理時間，研究高溫處理干耳片對萌發活性的影響和高溫處理適宜時間篩選，為高效收集木耳菌種資源提供理論依據和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 木耳

采自吉林農業大學菌菜基地耳片完整、無病蟲害發生的栽培玉木耳、毛木耳(毛木耳781)、黑木耳(黑山)子實體；用于驗證篩選條件的野生及栽培子實體11份，其中毛木耳4份、玉木耳3份、黑木耳4份。表1

表1 驗證篩選條件的樣品信息Table 1 Information of sample

1.1.2 試劑和儀器

注射用青霉素鈉160萬單位/瓶、注射用硫酸鏈霉素100萬單位/瓶、注射用頭孢曲松鈉1 g/瓶、硫酸慶大霉素注射液2 mL/瓶、葡萄糖、瓊脂粉、75%醫用酒精。福瑞特770C果蔬烘干機、LEICA M165 連續變倍實體顯微鏡及成像系統。

1.2 方 法

1.2.1 消毒劑配制

消毒劑1：使用一次性滅菌注射器抽取75%酒精4 mL，注入青霉素藥瓶并反復抽取使充分混勻，分別抽取0.5、1、1.5和2 mL注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成約3、6、9和12 mg/mL的試劑。消毒劑2：使用一次性滅菌注射器抽取無菌水5 mL，注入鏈霉素藥瓶并反復抽取使充分混勻，分別抽取1、2、3和4 mL注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成5、10、15和20 mg/mL的試劑。消毒劑3：使用一次性滅菌注射器抽取無菌水5 mL，注入頭孢曲松鈉并反復抽取使充分混勻，分別抽取1、2、3和4 mL注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成5、10、15和20 mg/mL的試劑。消毒劑4：使用一次性滅菌注射器抽取0.5、1、1.5和2 mL的慶大霉素注入平板中，加入酒精定容至40 mL，配制成0.5、1、1.5和2 mg/mL的試劑。

1.2.2 組織分離

將自然曬干的樣品1，于超凈工作臺內用滅過菌的鑷子掰取0.3～0.6 cm2大小組織塊，置于配好的4種消毒劑中，分別浸泡1、3和 5 min，使用鑷子取出并迅速通過酒精燈火焰外焰2～3次，轉入裝有PDA培養基的培養皿中，每個平板放置2個組織塊，5次重復。圖1

圖1 干耳片組織分離操作步驟示意Fig.1 Tissue isolation schematic diagram of dry fruiting bodies

1.2.3 污染率、萌發率統計

組織分離后置于25℃恒溫培養箱中避光培養。72 h后觀察組織塊污染及萌發情況，記錄污染率、萌發率及污染類型。

1.2.4 烘干溫度篩選

將新鮮子實體分別置于35、45、50、60和70℃烘干箱內烘干至恒重，按照1.2.2方法進行分離，每個平板放置3個組織塊，5次重復。

1.2.5 烘干時間篩選

將新鮮子實體置于65℃烘干箱內，分別于烘干4、8、12和16 h后取出，按照1.2.2方法進行分離，每個平板放置3個組織塊，5次重復。

1.2.6 不同抗生素適用性驗證

將篩選后獲得的適宜用于木耳組織分離的方法進行驗證。使用13份驗證樣品，按照1.2.2方法進行分離，設置75%酒精和無菌水浸泡3～5 min作為對照，每個平板放置5個組織塊，4次重復。

1.2.7 組織分離的萌發面

驗證樣品Ac3、Ac6，按照1.2.2方法進行分離，后置于25℃恒溫培養箱中避光培養，每12 h在LEICA M165連續變倍實體顯微鏡下，對分離的組織塊的菌絲萌發部位進行觀察記錄。

1.3 數據處理

應用Excel 2007對數據進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 4種抗生素適宜處理使用方法

2.1.1 消毒劑1使用濃度及處理時間篩選

研究表明，3 mg/mL消毒劑1在浸泡1和5 min處理均出現細菌污染，雖然萌發率較高但組織塊萌發的同時也被細菌污染，低濃度不能較好的解決細菌污染問題；6 mg/mL消毒劑1在浸泡1 min處理也出現細菌污染，但隨著浸泡時間延長，再無細菌污染；12 mg/mL消毒劑1在浸泡3 min處理時出現霉菌污染，而目前霉菌污染無法通過使用抗生素來解決。當濃度6 mg/mL時，浸泡3～5 min就可以完全去除細菌的影響，可作為青霉素適宜使用濃度和時間。表2

2.1.2 消毒劑2使用濃度及處理時間篩選

研究表明，5和10 mg/mL消毒劑2在浸泡1和3 min處理均出現細菌污染，雖萌發率相對較高，但濃度較低時不能較好的控制細菌污染問題，20 mg/mL消毒劑2在浸泡3和5 min處理也出現細菌污染且萌發率較低，應與鏈霉素在75%酒精中具有析出現象有關，并且隨著濃度升高析出現象加重，甚至高濃度浸泡處理的部分組織塊在取出時會粘有沉淀，影響了組織塊萌發。濃度15 mg/mL浸泡1～3 min作為鏈霉素適宜使用濃度和時間。表3

2.1.3 消毒劑3使用濃度及處理時間篩選

研究表明，10 mg/mL消毒劑3在浸泡1和3 min處理均出現污染，其他處理均未出現污染；5 mg/mL消毒劑3在不同浸泡時間處理后的萌發率均低于其他濃度；15 mg/mL消毒劑 3 處理不同時間后均無污染且萌發率較高。頭孢曲松鈉在75%酒精中也有析出現象，濃度越高析出越明顯。結合污染率和萌發率分析，低濃度、短處理時間不能較好抵抗細菌污染，濃度15 mg/mL浸泡3～5 min是頭孢曲松鈉的適宜使用濃度和時間。表4

表2 消毒劑1不同處理組織分離污染率及萌發率Table 2 Germination and contamination rate of tissue isolation disinfected with reagent 1

表4 消毒劑3不同處理組織分離污染率及萌發率Table 4 Germination and contamination rate of tissue isolation disinfected with reagent 3

2.1.4 消毒劑4使用濃度及處理時間篩選

研究表明，0.5和1 mg/mL消毒劑4在浸泡1、3和5 min處理中均出現污染，雖然萌發率較高，但細菌污染率也較高，且隨著浸泡時間的增加污染率增高，因此，過低濃度的消毒劑4不適合用于木耳組織分離；1.5和2 mg/mL消毒劑4不同浸泡時間處理中均未出現細菌污染，但2 mg/mL長時間浸泡萌發率降低，濃度1.5 mg/mL浸泡1～3 min是慶大霉素的適宜使用濃度和時間。表5

2.2 組織分離最適烘干條件

研究表明，通常用于組織分離的樣品，使用自然干燥處理，以在不同烘干溫度條件下獲得的干耳為材料，使用6 mg/mL消毒劑1浸泡3～5 min的方法組織分離。新鮮樣品及時烘干儲存后分離，隨著烘干溫度的增加，萌發率并未降低，說明適當的較高溫度烘干對木耳組織分離成功率影響較小。表6

表5 消毒劑4不同處理組織分離污染率及萌發率Table 5 Germination and contamination rate of tissue isolation disinfected with reagent 4

表6 不同烘干溫度組織分離萌發率污染率Table 6 Germination and contamination rate of tissue isolation in different drying temperatures

研究表明，65℃烘干時，隨著烘干時間的增加，樣品2萌發率均呈現下降趨勢，其中玉木耳、毛木耳在65℃烘干12 h時萌發率為 0，黑木耳萌發率43.75%，當烘干時間達到16 h時樣品2均無法萌發。烘干時間對于木耳的萌發率影響較大，雖然烘干處理12、16 h的木耳組織塊在培養基上仍能夠復水泡發，但持續培養30 d仍不能萌發出菌絲。木耳樣品的處理可以選擇在65℃條件下烘干4～8 h，密封保存，再到具備實驗條件時進行組織分離，短時間內獲得能夠分離菌種的木耳樣品。表7

表7 65℃不同烘干時間組織分離污染率及萌發率Table 7 Germination and contamination rate of tissue isolation with different drying time at 65℃

2.3 干木耳組織分離方法驗證

研究表明，使用11份樣品對篩選到的不同抗生素使用方法進行驗證，同時進行75%酒精和無菌水處理。無菌水和75%酒精處理樣品幾乎全部出現細菌，無菌水樣品8份出現霉菌，75%酒精處理有5份出現霉菌，4種消毒劑處理，污染率明顯下降萌發率提高，不同樣品間的差異說明了樣品本身攜帶的雜菌基數、采集環境和儲藏條件對組織分離成功率的影響較大。

組織分離30～36 h即可在組織塊周圍觀察到部分污染菌落，48 h即可觀察到部分樣品組織塊明顯萌發，其中栽培樣品萌發時間較野生樣品短，3 d后統計發現，總體表現為栽培樣品的菌落直徑大于野生樣品，這應與菌株對培養基的適應性有關。以ITS通用引物ITS1/ITS4對獲得的部分菌株及樣品進行PCR驗證，經過NCBI比對均為目標菌株。

3份玉木耳干品，均使用自封袋封存于20～25℃干燥環境下保存，Ac6和Ac5萌發，驗證了高溫烘干或自然干燥的玉木耳，常溫保存1年仍具有萌發菌絲的能力，Ac6萌發率較高，而相同采收時期使用高溫烘干的Ac5，萌發率相對較低，推測自然晾曬相比于高溫烘干更適合長期保藏耳片。Ac7由于受到了長期的日照處理，雖然組織塊在培養基上仍能泡發但觀察30 d未萌發。圖2，表8

注：紅色箭頭指向霉菌污染，綠色箭頭指向細菌污染Note：Red arrow points to mould contamination,green arrow points to bacterial contamination圖2 不同消毒方法組織分離Fig.2 Isolation results by different disinfection methods

2.4 組織分離的萌發面

研究表明，不同樣品均具有組織塊周身可萌發的情況，為方便對木耳的絨毛進行觀察，選擇使用6 mg/mL消毒劑1處理的Ac3、Ac6組織塊進行觀察。48 h時可觀察到明顯的萌發菌絲(圖3A)，組織塊的可育層(光滑面)(圖3B)、菌肉(圖3C)、不育層(毛面)(圖3D)均出現細小菌絲。觀察到的萌發菌絲細弱且彎曲，其中可育層與菌肉萌發出的菌絲致密較易觀察，而不育層因為存在絨毛使得細弱菌絲不易分辨，在絨毛上也發現有細弱菌絲。從組織塊上萌發的菌絲，在接觸培養基后菌絲生長速度提高，菌絲形態白壯致密(圖3E)。由于操作過程中需快速通過火焰，在顯微觀察中發現有絨毛被灼傷(圖3F)，但該組織塊仍可萌發。圖3

注：A:Ac3萌發組織塊：B:Ac3可育層萌發菌絲：C:Ac3菌肉萌發菌絲：D:Ac3絨毛萌發菌絲：E:Ac6萌發組織塊：F:Ac6灼傷絨毛Note:A:Germinated tissue piece of Ac3:B:Germinated fertile layer of Ac3:C:Germinated context of Ac3:D:E:Germinated tissue piece of Ac6:F:Burnable of Ac6圖3 組織塊萌發面Fig.3 Microscopic observation of tissue piece germination surface

3 討 論

研究涉及的消毒方法，包括4 種常用抗生素以及75%酒精。其中青霉素在組織分離中應用最早且廣泛[19-21]，鏈霉素也被報道應用于木耳[22]、秀珍菇[23]等食用菌的組織分離，頭孢曲松鈉對荔枝霜疫霉菌等有害病菌也具有抑制作用[24]，而慶大霉素由于具有耐熱性，可于培養基滅菌前加入[25]。作為種質資源收集的重要方法，組織分離也用于鞏固優良菌株的遺傳特性和品種復壯效果[26,27]，但也存在可能攜帶病毒的情況[28]，組織分離獲得的菌株必須通過栽培試驗才可用于生產。

經過使用方法篩選試驗后，以11 份不同樣品進行驗證，同時對比無菌水、75%酒精和4種消毒劑處理，發現75%酒精比無菌水處理，可能會減少霉菌的發生，對細菌也有一定的抑制作用，部分樣品如Ac1、Ac2、Ah1在75%酒精處理下雖然被細菌污染，仍有較高的萌發率，這可能與木耳本身具有抗菌功能有關[29]，4 種抗生素有效降低了污染率，尤其是減少細菌污染，但對霉菌污染無明顯抑制作用。經試驗該方法也適用于干銀耳的組織分離，可在平板上獲得干銀耳泡發后再分化的黃白色子實體。

在試驗操作過程中發現：(1)由于玉木耳、毛木耳較黑木耳肉厚較韌，因此在掰取組織塊時更費力，黑木耳耳片較薄易掰碎；(2)除青霉素外的3種抗生素均在酒精溶液中呈現析出現象，溶解性青霉素>頭孢曲松鈉>慶大霉素>鏈霉素，隨著抗生素濃度升高析出現象加重，甚至高濃度浸泡處理的部分組織塊在取出時會粘有沉淀，影響了組織塊萌發，因此，配制易析出消毒劑時注意混勻并及時使用；(3)可使用60 mm玻璃平板或其他滅菌玻璃容器操作，保持消毒劑濃度使組織塊沒過消毒劑即可，一次配藥可分離多份樣品，以減少抗生素排放[30]。

菌物研究過程中發現部分真菌也會受到抗生素的抑制，比如在構建遺傳轉化中常用的潮霉素、卡那霉素等，還有如多菌靈、咪鮮胺等真菌抑制劑[24]，除所選用的4種常用抗生素外，氯霉素對細菌也有較好抑制效果可考慮使用[31,32]。研究的4種抗生素沒有表現出對木耳菌絲的抑制作用，但使用抗生素及真菌抑制劑對菌株的生物學特性、酶活性、栽培性狀等方面是否存在影響，還需進一步討論。

干耳組織分離成活率受干燥方式、保存時干耳含水量、保存條件和霉菌污染情況等因素的影響。以往報道中鮮耳可使用低溫鼓風干燥[33]、自然曬干或28℃烘干[19]獲得干耳后組織分離，試驗中65℃烘干玉木耳常溫保存1年仍可萌發菌絲，這與孟秀秀和李曉[34]關于自然曬干黑木耳可保存1年后組織分離的研究結果一致。木耳孢子在PDA培養基的萌發時間約為5 d[35]，因此可育層(光滑面)萌發菌絲非孢子萌發，且干木耳的不同部位均可萌發，這與鮮耳組織分離中使用菌肉分離研究一致[16]。不同萌發面菌絲的萌發時間、生長速度不僅與樣品本身有關，也與該萌發面所受物理損傷、是否能夠直接接觸培養基有關。通過觀察推測絨毛也具有分化出菌絲的能力，但不同萌發面萌發的菌絲間是否有差異，是否能夠發育出子實體完成生活史等還需要進一步研究討論。

4 結 論

4.14種抗生素具體使用方法為6 mg/mL消毒劑1、15 mg/mL消毒劑3浸泡3～5 min；15 mg/mL消毒劑2、1.5 mg/mL消毒劑4浸泡1～3 min。青霉素為最佳消毒劑。

4.2將采集的新鮮完整無霉變蟲害的耳片拍照記錄其性狀后，單獨包裝，使用烘干箱設置65℃烘干4～8 h或55℃烘干8～10 h，注意烘干過程中防止不同樣品間孢子污染，干燥后密封包裝，帶回實驗室在超凈工作臺按上述方法分離。

4.2木耳的可育層、菌肉、不育層均可萌發菌絲，且在毛木耳絨毛上也觀察到細弱菌絲，木耳具有全身萌發的特性。