鹽穗木葉片及根際土壤微生物群落高通量分析

迪拉熱·海米提，樊永紅，王偉楠，喻文麗，艾海白爾·卡斯木

(新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】根際土壤微生物是一類能夠直接影響植物根系的土壤范圍內生長繁殖的微生物，其與植物根系相互作用，在維系根系的生態平衡的同時也擔負著根際重要的生理過程[1]，主要參與土壤與植物之間進行的物質交換有多種功能[2]。根際微生物也被稱為植物體的“第二套基因組”[3]。植物能通過一些有益的根際微生物獲得某些特定的功能，同時釋放部分光合作用所產生的碳，為這些微生物提供所需的生存能量和物質基礎[4]。【前人研究進展】根際微生物對植物的作用主要體現在提高植物從環境中獲取營養物質的能力[5]，通過激素合成或者降解調控植物的生長能力和適應環境的能力[6]，通過與致病菌相互作用誘導植物產生抗性，啟動免疫調控[7]。在正常條件下，植物根系與土壤及根際微生物所形成的根際微生態圈會維持著一種動態平衡。植物內生菌是指植物組織內的微生物，也被學者定義為在其生活史中的某一段時期生活在植物體內并且對植物組織沒有造成傷害的菌[8]。有一些內生菌能夠促進植物種子萌發、光合形態建成、增強宿主植物抗逆性[9]。鹽穗木是分布于中國西北新疆塔里木盆地、焉耆盆地和吐魯番盆地的藜科多年生灌木，是一種極端耐鹽植物也是鹽生荒漠的主要建群植物，具有抗干旱、耐鹽堿、耐風蝕沙埋的特點[10-11]。【本研究切入點】高通量測序作為一個有效研究微生物群落結構的手段，提取微生物總DNA進行測序和比較廣泛應用于微生物學領域中。研究鹽穗木根際土壤中以及葉片內的微生物群落結構及其多樣性。【擬解決的關鍵問題】采用高通量測序技術，研究新疆鹽堿環境中，極端耐鹽植物鹽穗木的根際土壤及葉片內生微生物群落組成和結構，鹽穗木植株體內和其生長的鹽堿化土壤環境中微生物所表現的功能、資源的開發利用和生物菌肥的制作等提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用鹽穗木根際土壤及其葉片樣本采自新疆五家渠市103團的鹽堿地。

1.2 方 法

1.2.1 鹽穗木葉片及根際土壤

采用剝落法和鏟除法，收集鹽穗木根際土壤及其葉片各3份，分別命名為鹽穗木根際土壤樣品(YS1、YS2、YS3)，鹽穗木葉片樣本(YP1、YP2、YP3)采自同一生境下的不同植株。首先選出生長正常的植株，用小鐵鏟輕輕鏟土直至植物根，收集附著在根上0～4 mm的土作為根際土，收集適量鹽穗木葉片。將土樣及葉片收集物中的雜質去除后，裝入密封袋后帶回實驗室，置于-20℃冰箱中，備用。

1.2.2 高通量測序

采用SDS方法對樣本的基因組DNA進行提取，使用帶Barcode的特異引物和高效高保真酶進行PCR。引物對應區域分別為：16S V4區引物(515F和806R)：鑒定細菌多樣性；18S V4區引物(528F和706R)：鑒定真核微生物多樣性；ITS1區引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)：鑒定真菌多樣性。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量并使用NovaSeq6000進行上機測序。

1.2.3 生物信息學

根據Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數據中拆分出各樣本數據，使用FLASH[12]對每個樣本的reads進行拼接，過濾處理[13]得到高質量的Tags數據。參照Qiime[14]的Tags質量控制流程，Tags序列通過[15]與物種注釋數據庫進行比對去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效數據。利用Uparse軟件[16]對所有樣本以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)。對OTUs序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132[17]的SSUrRNA數據庫[18]進行物種注釋分析，獲得分類學信息并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。

1.3 數據處理

使用MUSCLE[19]軟件進行比對并且得到所有OTUs代表序列的系統發生關系。使用Qiime軟件計算Alpha多樣性指數，使用R軟件繪制稀釋曲線，物種累積曲線并使用R軟件進行Alpha多樣性指數組間差異分析。用Qiime軟件計算Unifrac距離、構建UPGMA樣本聚類，使用R軟件繪制PCoA圖。

2 結果與分析

2.1 鹽穗木根際土壤微生物群落多樣性

2.1.1 測序數據的質控

研究表明，鹽穗木土壤樣品YS1、YS2、YS3最終用于后續分析的有效序列分別有60 488、63 755、54 921。對所有樣本的有效序列，以97%的一致性(Identity)進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，然后對OTUs的序列進行物種注釋。鹽穗木根際土壤樣品YS1、YS2、YS3的細菌OUT數分別為1 401、1 341、1 262。相對應的文庫覆蓋率分別為99.7%、99.7%、99.8%，真菌OUT數分別為375、413、277，相對應的文庫覆蓋率分別為100%、99%、99%。物種豐度稀釋曲線上升到一定高度后趨于平穩，測序的深度已足夠代表樣品中大多數細菌與真菌種類。表1～2，圖1～2

ACE指數1 213.322～1 368.982，ACE和Chao1越大，群落的豐富度越高，Chao1指數為1 183.266～1 368.077。Shannon指數和Simpson指數是用來估算菌群多樣性的指數，Shannaon值越大，菌群多樣性越高。3個鹽穗木根際土壤樣品的Shannon指數為7.161～8.132，Simpson指數為0.965～0.991。其中YS1的Shannon指數(8.132)，Simpson指數(0.991)，chao1(1 368.007)，ACE(1 368.982)高于其它2個樣品，其細菌群落多樣性和豐富度比其余2個樣品較高。對3個鹽穗木根際土壤樣品YS1、YS2、YS3真菌群落分析中ACE指數263.863～418.376，Chao1指數258.857～412.000，3個鹽穗木根際土壤樣品YS1、YS2、YS3的Shannon指數為2.571～4.817，Simpson指數為0.670～0.927。其中YS1的Shannon指數(4.817)，Simpson指數(0.927)，高于其它2個樣品，其真菌群落多樣性比其余2個樣品較高。表1～2

表1 鹽穗木根際土壤樣品細菌OTUs豐度和α多樣性指數Table 1 OTUs composition and α-diversity index of bacterial community of Halostachys caspica rhizosphere soil

表2 鹽穗木根際土壤樣品真菌OTUs豐度和α多樣性指數Table 2 OTUs composition and α-diversity index of fungus community of Halostachys caspica rhizosphere soil

圖1 鹽穗木根際細菌物種豐度稀釋曲線Fig.1 Rare faction curve of bacterial communityof Halostachys caspica rhizosphere soil

圖2 鹽穗木根際真菌物種豐度稀釋曲線Fig.2 Rare faction curve of fungus communityof Halostachys caspica rhizosphere soil

2.1.2 不同鹽穗木根際細菌和真菌OTUs分布

研究表明，占文庫總OTUs的38.79%，不同鹽穗木根際細菌群落的種類組成差異大，其中YS1特有的OUT數最多，即其細菌群落組成多樣性較其它2個樣品高。3株鹽穗木根際土壤樣品之間共有的真菌OTUs個數為124，即有124個真菌OTUs在3個鹽穗木根際土壤樣品中均有分布，YS1、YS2、YS3分別有119、142、68個特有OTUs，YS2真菌多樣性最高，YS1和YS3擁有的相同菌群種類，兩者種類組成差異大。圖3～4

圖3 鹽穗木根際細菌OTUs分布韋恩圖Fig.3 Venn graph of bacterial OTUs in Halostachys caspica rhizosphere soil

圖4 鹽穗木根際真菌OTUs分布Fig.4 Venn graph of fungus OTUs in Halostachys caspica rhizosphere soil

2.1.3 不同鹽穗木根際細菌和真菌多樣性

研究表明，鹽穗木根際土壤樣品YS1中放線菌門(Actinobacteria)豐度最高，為34.21%。其次為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對豐度分別為23.94%、14.9%、9.6%、7.3%、4.4%、2%、0.9%、0.8%。在YS2中變形菌門豐度最高，為36.83%。其次為放線菌門、芽單胞菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門、厚壁菌門相對豐度分別為17.97%、15.71%、10.02%、6.23%、5.3%、2.9%、1.5%、0.4%。YS3中芽單胞菌門豐度最高，為32.77%。其次為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、疣微菌門、厚壁菌門，相對豐度分別為28.38%、13.44%、10.36%、4.02%、3.77%、2.97%、0.68%、0.25%。鹽穗木根際土壤YS1、YS2、YS3中真菌的優勢菌群均是子囊菌門(Ascomycota)，分別占64.40%、50.04%、39.87%。其次為圖中10個門之外的其他所有門之和，與數據庫無法比對的。除此之外，YS1和YS2、YS3中分別有擔子菌門(Basidiomycota)3.39%、13.30%、0.25%，毛霉門(Mucoromycota)0.08%、0.21%、0.02%以及極少量的被孢霉門(Mortierellomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)。圖5～6

2.1.4 不同鹽穗木根際細菌和真菌群落主成分

研究表明，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對樣品差異性的解釋度分別為31.86%、20.66%，合計為52.52%和30.84%、21.42%，合計為52.26%，是差異的部分來源。鹽穗木根際土壤樣品YS2和YS3細菌群落組成相似程度高，但YS1位于PC1軸正值區域，與位于PC1負值區域的YS2、YS3偏離較大，主成分差異顯著，樣品的細菌群落結構發生了顯著的變化。YS1的真菌群落結構與其余2個樣品YS2、YS3差異較大。圖7～8

圖 5 鹽穗木根際細菌門水平上的相對豐度Fig.5 Relative abundance in the major phyla of bacterial community composition

圖6 鹽穗木根際真菌門水平上的物種相對豐度Fig.6 Relative abundance in the major phyla of fungus community composition

注：紅色點為鹽穗木Note:Red representative Halostachys caspica圖7 鹽穗木根際細菌群落PCoAFig.7 Principal component analysis of bacterial community in Halostachys caspica rhizosphere soil

注：紅色點為鹽穗木Note:Red representative Halostachys caspica圖8 鹽穗木根際真菌群落PCoAFig.8 Principal component analysis of bacterial community in Halostachys caspica rhizosphere soil

2.2 鹽穗木葉片內生微生物群落多樣性

2.2.1 測序數據的質控

研究表明，鹽穗木葉片樣品YP1、YP2、YP3最終用于后續細菌多樣性分析的有效序列分別有67 602、63 071、50 157。真菌多樣性分析產生的有效序列分別有60 201、62 886、63 555。對其進行OTUs聚類，然后對OTUs的序列進行物種注釋。鹽穗木葉片樣品YS1、YS2、YS3的細菌OUT數分別為181、165、354。相對應的文庫覆蓋率分別為99.7%、99.7%、99.8%，真菌OUT數分別為38、39、230，相對應的文庫覆蓋率均為100%。物種豐度稀釋曲線，上升到一定高度后趨于平穩，測序的深度已足夠，可以代表樣品中大多數細菌與真菌種類。其中，YP3的細菌和真菌種類多樣性顯著高于其余2個樣品。表3～4，圖9～10

ACE指數為196.210～349.602，Chao1指數為1 183.266～1 368.077。ACE和Chao1越大，群落的豐富度越高。Shannon指數和Simpson指數是用來估算菌群多樣性的指數，Shannaon值越大，菌群多樣性越高。3個葉片樣品的shannon指數為1.612～4.942，Simpson指數為0.462～0.904。其中YP3的shannon指數，simpson指數，chao1(1 368.007)高于其它2個樣品，說明其細菌群落多樣性和豐富度比其余2個樣品較高。對3個鹽穗木葉片樣品YP1、YP2、YP3真菌群落分析中，各樣品的shannon指數為0.634～1.383，Simpson指數為0.228～0.353。其中YP3的shannon指數(1.383)，simpson指數(0.353)，高于其它2個樣品。表3～4

表3 鹽穗木葉片內生細菌OTUs豐度和α多樣性指數Table 3 OTUs composition and α-diversity index of bacterial community of Halostachys caspica leaves

表4 鹽穗木葉片內生真菌OTUs豐度和α多樣性指數Table 4 OTUs composition and α-diversity index of fungus community of Halostachys caspica leaves

圖9 鹽穗木葉片內生細菌物種豐度稀釋曲線Fig.9 Rare faction curve of bacterial community of Halostachys caspica leaves

圖10 鹽穗木葉片內生真菌物種豐度稀釋曲線Fig.10 Rare faction curve of fungus community of Halostachys caspica leaves

2.2.2 不同鹽穗木葉片細菌和真菌OTUs分布

研究表明，3株鹽穗木葉片樣品之間共有的OTUs個數為54。有54個OUT在3個鹽穗木葉片樣本中均有分布，僅占文庫總OTUs的9.10%，不同鹽穗木葉片樣本內生細菌的種類組成差異大；其中YP3特有的OTUs個數為221，YP3較YP1、YP2差異較大，YP1、YP2特有的OTUs個數少，種類組成較為接近。真菌多樣性分析中有24個OUT在3個鹽穗木葉片樣本中均有分布，僅占文庫總OTUs的7.8%，不同鹽穗木葉片樣本內生真菌的種類組成差異大；其中YP3特有的OTUs個數為194，YP3較YP1、YP2差異較大，YP1、YP2特有的OTUs個數少，種類組成較為接近。圖11～12

圖11 鹽穗木葉片內生細菌OTUs分布韋恩圖Fig.11 Venn graph of bacterial OTUs of Halostachys caspica leaves

圖12 鹽穗木葉片內生真菌OTUs分布韋恩圖Fig.12 Venn graph of fungus OTUs of Halostachys caspica leaves

2.2.3 不同鹽穗木葉片內生細菌和真菌多樣性

研究表明，在YP1中藍細菌門(Cyanobacteria)豐度最高，豐度為98.43%，其次為變形菌門(Proteobacteria),放線菌門(Actinobacteria)，硬壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，酸桿菌門(Acidobacteria)，其相對豐度分別為0.64%、0.65%、0.19%、0.03%、0.01%、0.01%。在YP2藍細菌門豐度最高，豐度為98.82%，其次為放線菌門、變形菌門、硬壁菌門、擬桿菌門，其相對豐度分別為0.58%、0.38%、0.15%、0.04%，在YP3中藍細菌門豐度最高，豐度為40.82%，其次為放線菌門、變形菌門、硬壁菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、德氏球菌門、酸桿菌門、綠彎菌門，其相對豐度分別為31.64%、18.73%、5.68%、1.34%、0.57%、0.49%、0.14%、0.12%。鹽穗木葉片YP1、YP2的優勢菌群門為子囊菌門，占比分別為65%、70%，但YP3中子囊菌門(Ascomycota)只占10%。YP2中還有占比2.5%的被孢霉門(Mortierellomycota)。鹽穗木葉片內生真菌以子囊菌門為主，占比48.33%，還有0.83%的被孢霉門。鹽穗木葉片內生菌中沒有擔子菌門(Basidiomycota)。圖13～14

圖13 鹽穗木葉片內生細菌門水平上的相對豐度Fig.13 Relative abundance in the major phyla of bacterial community composition in Halostachys caspica leaves

圖14 鹽穗木葉片內生真菌門水平上的相對豐度Fig.14 Relative abundance in the major phyla of fungus community composition in Halostachys caspica leaves

2.2.4 不同鹽穗木葉片內生細菌和真菌群落主成分

研究表明，鹽穗木葉片樣品YP1和YP2群落組成相似程度高，但YP3偏離較大。YP1和YP2的點靠的很近都位于PC1的負值區域，兩者群落組成相似。YP3位于PC1的正值區域，與YP1、YP2不在同一象限，間隔較大距離，其群落組成與其它2個鹽穗木葉片樣本有較大差別。PCA主成分分析可以得出各樣品分布在不同區域，且有的樣品密集聚集，有的樣品間間隔較大，主成分差異顯著。圖15～16

注：紅色點為鹽穗木Note:Red representative Halostachys caspica圖15 鹽穗木葉片內生細菌群落PCoAFig.15 Principal component analysis of bacterial community in Halostachys caspica leaves

注：紅色點為鹽穗木Note:Red representative Halostachys caspica圖16 鹽穗木葉片內生真菌群落PCoAFig.16 Principal component analysis of fungus community in Halostachys caspica leaves

3 討 論

基于Illumina NovaSeq 測序平臺對該文庫進行雙末端測序。經過序列的拼接過濾，OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，可以進行物種注釋及豐度分析；通過α多樣性(Alpha Diversity)和β多樣性分析(Beta Diversity)，不僅可以揭示出樣本中物種組成和樣本間群落結構的差異，而且還可以進行個性化分析和深度的數據挖掘。在實驗中，相同生長環境下不同的鹽穗木根際土壤中的微生物群落也存在差異，造成這種差異的原因主要是土壤類型，植物殘體和根系分泌物及土壤理化性質等因素[20]。而內生菌的多樣性與植物種類、季節以及生長的地理環境等因素有密切的關系[21-22]。研究表明，在門水平上根際土壤細菌群落中的優勢菌門為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)等。放線菌是植物根際一類重要的微生物，在促進植物生長和防治病害等方面發揮重要作用[23]。根際鹽穗木真菌群落中的優勢菌門為子囊菌門。鹽穗木根際土壤1號樣品YS1的細菌和真菌群落多樣性明顯高于其余2個樣品。在門水平下，鹽穗木葉片內生細菌群落中的優勢菌門為藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)；內生真菌群落中的優勢菌門為子囊菌門(Ascomycota)。有研究表明，變形菌門能夠在根際土壤中成為優勢菌門是因為它們增長的速度很快，在研究中鹽穗木根際土壤中檢測到的酸桿菌門由于生長所需的營養物質基本保持不變或者很少，所以是較為穩定的微生物組分[24-25]。藍細菌分布極廣，普遍生長在淡水、海水和土壤中，并且在極端環境(如溫泉、鹽湖、貧瘠的土壤、巖石表面或風化殼中以及植物樹干等)中也能生長。許多藍細菌類群具有固氮能力。從本次高通量分析結果中可以看出，鹽穗木根際土壤中的微生物種群豐度是高于葉片內生微生物種群豐度的。基于第二代高通量測序技術探索鹽穗木根際及葉片內生微生物種群分布特征和多樣性特點并探究與其在干旱、鹽堿地生境下的抗逆性之間是否存在相關性，為利用有益微生物對宿主的特性進行改變，為利用根際促生菌制作生物菌肥提供科學依據。

4 結 論

物種豐度稀釋曲線上升到一定高度后趨于平穩，測序的深度已足夠，可以代表樣品中大多數細菌與真菌種類。其真菌群落多樣性比其余2個樣品較高。YS2真菌多樣性最高，YS1和YS3擁有的相同菌群種類最少兩者種類真菌種類組成差異大。YS1的真菌群落結構與其余2個樣品YS2、YS3差異較大。其真菌群落多樣性比其余2個樣品高。樣品的細菌群落結構發生了顯著的變化，這種群落結構的差異來源可能是植物本身及其根系分泌物的差異。