激活前扣帶皮層腺苷酸活化蛋白激酶對大鼠痛情緒和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白活性的影響

盧波，王瑞春，王秋生，孟波，陳駿萍

疼痛的感覺部分和情緒部分由不同的神經傳導通路傳導，而且最終對其進行整合、調控和處理的大腦腦區也并不完全相同。研究表明，邊緣系統中的前扣帶皮層（ACC）與痛情緒的形成與維持密切相關[1-2]，目前對其具體機制尚不清楚。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）參與脊髓水平的痛覺中樞敏化和ACC腦區的痛情緒調控[3-5]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）是mTOR通路的上游信號分子，通過負性調控mTOR 通路參與蛋白質的合成，進而作用于脊髓背角神經元的中樞敏化[6]。但是，關于mTOR 通路調控痛情緒的形成過程是否依賴于AMPK 的活性變化，目前尚不清楚。基于此，本研究擬觀察激活ACC 腦區AMPK 對大鼠痛情緒反應以及mTOR活性的影響。報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠30只，體質量230 ～300 g，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心，飼養于寧波大學SPF 級實驗動物中心。本研究在實施前已獲得寧波大學實驗動物倫理委員會批準。

1.2 實驗分組 將大鼠隨機分為甲醛模型組（F組）、AMPK激動劑組（A組）和溶劑對照組（C 組），各10 只。所有大鼠均在七氟烷麻醉下建立甲醛炎性痛模型，在左側足底皮下注射5%甲醛溶液50 l，建立模型。

1.3 方法 ACC腦區置管和藥物輸注大鼠麻醉后頭部固定于腦立體定位儀上，門齒桿－ 3.3 mm。檢測是否固定成功的標準：鼻對正中，頭部不動，提尾不掉。按照大鼠腦圖譜選取ACC坐標（AP：+2.6mm，L：±0.6 mm，H：－ 2.5 mm）。用牙科鉆于進針點處鉆一小孔，深度至硬腦膜。將外套管緩慢植入，并以牙托粉固定于顱骨表面。待牙托粉凝固后，外套管塞入長度較套管長0.2 mm 的不銹鋼內芯并蓋上導管蓋。術后隔天插拔內芯一次，防止套管堵塞。

A 組和C 組于建模前20 min 經套管注射相應藥物或溶劑。以七氟烷麻醉，將套管內芯拔出，插入注射內管，注射內管尖端長于套管0.2 mm，末端通過PE-10 軟管連接微量進樣器。雙側ACC給藥，每側注射0.5 l 藥物或溶劑。其中，AICAR（Sigma公司，美國）用DMSO溶解，PBS稀釋（DMSO終濃度為0.5%）為20 mol/L，溶劑對照為0.5% DMSO。在3 min 內注射完畢，隨后留針5 min，防止液體溢出，使藥液充分擴散。

1.4 甲醛條件位置回避訓練（F-CPA）CPA 訓練箱由3 個小室組成，其中A、B室等大并排放置，C室位于A、B室前方。A室壁為黑白相間的垂直條帶，以1%醋酸溶液作為氣味劑；B 室壁為黑白相間的水平條帶，以1%桂皮水作為氣味劑；C 室內壁灰色，無標記，無氣味。

第1 天，將大鼠放入C室，待其進入A 或B 室后，關閉C 室與A、B 室間的小門，記錄15 min 內動物在A、B 室的停留時間。第2 ～3 天，大鼠不經任何處理直接放入甲醛非條件匹配室，任其在內自由活動45 min。間隔4 h 后，大鼠左側足底注射甲醛或0.9%氯化鈉注射液后放入甲醛條件匹配室（A 或B 室，信封法隨機選擇），同樣使其在內45 min 后取出。第4 天，操作過程同第1 天，記錄大鼠15 min 內在A 和B 室所停留的時間。計算回避分數（訓練前后在甲醛條件室停留的時間差值）以評價大鼠是否形成條件性位置回避，回避分數越高提示痛情緒越顯著。

1.5 免疫印跡 CPA行為學結束后，大鼠被過量的七氟烷麻醉處死，取ACC（AP 3.7 ～0.7 mm）。加入裂解液并破碎組織，4 ℃離心30 min，取適量上清液用BCA 試劑盒測蛋白濃度。剩余上清液取適量，按上清液：5×Loading buffer為4：1 的量加入5×Loading buffer。放入99.9 ℃水浴煮沸5 ～10 min，之后將樣品分裝―80℃條件保存。

根據蛋白濃度確定上樣量。電壓設定60 V 待條帶壓成一條線后調整為80 V 跑膠，結束后用100 V，90 min 轉膜。轉膜前需先用甲醇活化PVDF 膜。轉膜后加入5 ml 封閉液室溫封閉1 h。封閉后加兔來源的抗磷酸化mtor（Ser2448，cat no.2971，1∶500，CST 公司）和小鼠來源抗-actin抗體（1∶2 000，Santa cruz公司）4 ℃搖床孵育過夜。用1×TBST 清洗之后加二抗室溫避光孵育1 h 后，紅外熒光掃描儀曝光。使用ImageJ 軟件（NIH，Bethesda，MD USA）對Western blot 結果的灰度圖像進行半定量分析。

1.6 統計方法 數據采用GraphpadPrism7.0 統計軟件分析，計量資料采用均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痛情緒比較 與CPA 訓練之前相比，F 組和C 組大鼠訓練后在條件室內停留時間明顯減少（t=4.34、6.63，均P＜0.01）。A 組大鼠訓練前后在條件室內停留時間差異無統計學意義（t=1.34，P＞0.05）。3 組大鼠回避分數差異有統計學意義（F=3.68，P ＜0.05），其中A 組回避分數顯著低于C 組和F 組（t=2.39、2.30，均P ＜0.05）。見封四彩圖5 ～6。

2.2 ACC中mTOR磷酸化形式（p-mTOR）的表達 3 組大鼠ACC 中p-mTOR 表達差異有統計學意義（F=8.67，P ＜0.01），其中A組顯著低于F組和C組（t=2.39、2.30，均P ＜0.05）。見封四彩圖7。

3 討論

外周疼痛刺激信息經脊髓背角投射至高位中樞后，大腦的不同腦區以相互分工、相互聯系的方式整合、處理和調控疼痛感覺和疼痛情緒信息，其中ACC主要負責處理疼痛相關的負性情緒信息，并促進疼痛相關情感、認知和反應的抉擇[1-2,7]。然而，目前對其具體的細胞和分子機制了解較少。筆者前期研究表明，慢性疼痛（甲醛疼痛刺激）可誘導ACC內p-mTOR、p-p70S6K表達的顯著上調，預先給予雷帕霉素可阻斷痛情緒行為的產生[5]。在此基礎上，本研究進一步發現，激活AMPK 同樣能夠削弱甲醛誘導的痛情緒，并且其機制可能與AMPK 負性調控mTOR 磷酸化表達降低有關。

研究顯示，AMPK 通過對mTOR 信號通路的負性調控，參與了痛覺中樞敏化的形成[8-10]。脊神經結扎的動物模型上，脊髓背角p-AMPK 的表達顯著減少[10]；AMPK 激動劑可抑制mTOR 的活性和下游翻譯元件的表達，抑制蛋白翻譯，進而減輕外周神經損傷或手術切口引起的觸誘發痛；并且，AMPK激動劑可顯著降低離體背根神經節神經元的興奮性[8-9]。這些研究證據提示了AMPK/mTOR 通路在慢性疼痛中發揮著重要作用。本研究結果初步提示了ACC 腦區中AMPK通過調控其下游mTOR通路參與痛情緒的形成和發展，但是仍有諸多問題尚需進一步研究，如：（1）慢性疼痛的經典分子ERK 同樣受AMPK 的調控[9]，那么ERK通路與mTOR通路是否存在關聯？（2）AMPK 目前有多種激動劑，如AICAR、二甲雙胍等[11]，不同的激動劑是否產生同樣的鎮痛效果？（3）F-CPA 將疼痛與情緒分開，目的是為了在研究痛情緒時不受痛感覺的干擾，然而近年來痛與負性情緒（如抑郁）共患也是疼痛研究熱點，AMPK-mTOR 通路在不同痛情緒模型中的作用也值得研究者進行探討。

綜上所述，激活ACC腦區AMPK能夠削弱甲醛炎性痛誘導的痛情緒，其機制與AMPK 調控mTOR 活性的變化有關。