表面活性劑脅迫培養對4株細菌生長的影響

李淑英，李 燕，胡貴蓮，張翠萍，申太波，劉淑娟，周元清

(玉溪師范學院化學生物與環境學院， 云南 玉溪 653100)

0 引言

表面活性劑是一類加入微少量就能使表面張力減少的有機物，有殺菌、潤滑等功能，被廣泛應用到各個領域，大量使用時，會帶來很多嚴重的環境問題，給生態環境帶來較大影響[1]。表面活性劑對微生物的毒性，一方面是通過與細胞膜中的液態成分作用使細胞膜溶解，另一方面是通過與細胞中的重要功能蛋白發生反應[2]，表面活性劑的毒性與類型及表面活性劑濃度有關[3,4]。十二烷基硫酸鈉(SDS)為白色或淡黃色粉狀，有去污、乳化和優異的發泡力，是一種陰離子表面活性劑；聚乙二醇6000(PEG6000)為白色蠟狀固體薄片或顆粒狀粉末，屬于非離子型表面活性劑[5]。表面活性劑在工業行業中應用較廣泛，有殺菌與消毒作用，其主要原因是可以和細菌生物蛋白質發生作用，加速蛋白質分子變性[6]，所以微生物生長變化可以直接反映出水體受污染程度，將微生物作為表面活性劑毒性監測指示者具有一定的實用價值[7]。

本實驗選擇4株細菌作為研究對象。2株革蘭氏陽性菌：枯草芽孢桿菌和簡單芽孢桿菌；2株革蘭氏陰性菌：大腸桿菌和變形桿菌。用不同濃度的表面活性劑PEG6000、SDS脅迫培養后，對4株細菌測定生長曲線，分析不同濃度PEG6000、SDS對細菌生長的影響。結果發現：4株細菌對兩種表面活性劑表現出不同的敏感性，兩種表面活性劑對細菌的毒性也表現出較大差異，為表面活性劑污染環境后對細菌的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

枯草芽孢桿菌(BaciLLussubtiLis)，簡單芽孢桿菌(BaciLLussimpLex)，革蘭氏陽性菌(G+)；

大腸桿菌(EscherichiacoLi)，變形桿菌(ProteusvuLgaris)，革蘭氏陰性菌(G-)。

1.2 培養基

LB培養基：胰蛋白胨 10g；酵母膏5g；NaCl 10g；蒸餾水1000mL。

1.3 方案設計

1.3.1 菌種活化

將4株供試菌種在無菌條件下轉接于LB培養基，連續轉接2次，于35℃恒溫培養24h后備用。

1.3.2 不同濃度表面活性劑培養基配制

250mL錐形瓶盛100mL LB液體培養基，加入PEG6000，濃度分別為：0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L，每個濃度3個平行；加入SDS，濃度分別為：0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L，每個濃度3個平行；同時設置對照。

1.3.3 脅迫培養

將活化后的斜面菌種用3mL無菌水洗脫3次，合并倒入無菌試管中混勻。

用10mL的移液管將脅迫培養基分別加入三角瓶中，每個三角瓶10mL，用牛皮紙包扎好置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌。滅菌后，分別按照濃度梯度為0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L添加PEG6000，0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L添加SDS，另以不含表面活性劑的培養基作對照，在無菌條件下將擴大培養的菌液按10%的接種量分別接種于上述培養基中，置于搖床(120r/min)上恒溫(35℃)搖瓶培養。

1.3.4 生長曲線測定

培養過程(96h)中每隔8h無菌操作取樣1次，于可見光分光光度計600nm處測其吸光度，每個樣品有3個平行，求其平均值，繪制4種細菌在不同濃度PEG6000、SDS脅迫培養過程中的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 PEG6000 脅迫對4株細菌生長曲線的影響

由圖1～圖3可看出，PEG6000對枯草芽孢桿菌、簡單芽孢桿菌和大腸桿菌的生長有影響，PEG6000濃度為0.5～2.0g/L時，對3株細菌的生長都表現為抑制作用；當PEG6000濃度為2.0g/L時，對大腸桿菌的抑制作用明顯；簡單芽孢桿菌則表現為PEG6000濃度為1.0g/L生長受到明顯抑制。有研究[8]發現，低濃度表面活性劑(TCJ0.1g/L和KPS 0.2g/L)對細菌的生長表現為促進作用，高濃度(1.5g/L)表面活性劑對細菌表現出抑制作用，本實驗中PEG6000對枯草芽孢桿菌、簡單芽孢桿菌和大腸桿菌的生長都表現為抑制作用。聚乙二醇6000(PEG6000)是廣泛選用的模擬干旱的滲透劑[9]，對細胞的生長發育有較大影響，PEG6000對枯草芽孢桿菌、簡單芽孢桿菌和大腸桿菌的生長抑制作用較TCJ和KPS明顯,本實驗選擇PEG6000濃度較高也會影響3株細菌的生長。

圖1 PEG6000脅迫下枯草芽孢桿菌生長曲線

圖2 PEG6000脅迫下簡單芽孢桿菌生長曲線

圖3 PEG6000脅迫下大腸桿菌生長曲線

由圖4可看出，變形桿菌PEG6000脅迫培養有較強的耐受性和適應性，在96h內變形桿菌的生長表現出上升趨勢，24h內變形桿菌的生長低于對照，說明一段時間內PEG6000對變形桿菌的生長有抑制作用，隨著培養時間的延長，變形桿菌的生長逐漸升高，應該是大腸桿菌對PEG6000脅迫環境有較強的適應能力，過度地使用表面活性劑也可能使細菌產生耐藥性[10]。

實驗結果表明，在低濃度下，PEG6000對兩種細菌的生長具有一定的刺激作用，在高濃度下，對枯草芽孢桿菌的生長具有抑制作用，但是抑制效果不太明顯，對假單胞菌的生長還是表現為促進作用。說明PEG6000的毒性不是太強，對細菌生長的脅迫作用不太顯著。且兩種細菌對PEG6000的敏感程度不同，枯草芽孢桿菌(G+)比假單胞菌(G-)更敏感，可能原因是兩種細菌的結構差異和對不良環境的適應能力不同[5]。

2.2 SDS脅迫培養對4株細菌生長曲線的影響

由圖5～圖8可看出，SDS對4株細菌的生長影響較大，本實驗SDS>0.4g/L后對4株細菌的生長都表現為抑制作用，與雷鳴[11,12]等人研究結果類似，其結果表明表面活性劑質量濃度>0.5g/L時，微生物種群數量降低。SDS對納豆芽胞桿菌的生長具有較大的影響，即使在0.2g/L的低濃度下也不能使菌體正常生長[13]，本實驗中當SDS濃度為0.2g/L時，4株細菌在一段時間內生長明顯受到抑制，后期對SDS表現出不同的適應能力：枯草芽孢桿菌40脅迫培養40h后開始有生長，大腸桿菌與變形桿菌脅迫培養56h后出現生長現象，而簡單芽孢桿菌對SDS脅迫環境適應能力較弱，直至88h后才開始生長。4株細菌在初期培養過程中對一定濃度SDS(本實驗為0.2g/L)耐受性較弱的菌群大量死亡，少量耐受性較強的菌群由于外界環境變化所造成的環境脅迫會誘惑其產生保護或適應機制來適應環境變化，從而使其生存能力提高，導致細菌數量大量增加[14]。枯草芽孢桿菌是用于研究芽孢萌發的模式微生物，對其芽孢萌發的特點及機制[15,16]較多，環境因素會影響芽孢萌發，同時芽孢在其他因子，如溶菌酶、鹽、高壓、2，6吡啶二羧酸鈣(Ca+-DPA)以及陽離子表面活性劑作用下也能萌發。實驗中選擇的簡單芽孢桿菌是從濕地植物-香蒲根際經過HCB多次脅迫培養篩選分離到的內生細菌，研究[17]發現該菌株芽孢形成時間較早，基礎培養基上培養16h即出現芽孢，這一特征有別于其他芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌為46h)。其他生物學特性還在進一步研究中，芽孢萌發“多信使，多受體”假說認為超表達芽孢的萌發受體能增加萌發速率，而低表達則會出現深度休眠芽孢[18]，簡單芽孢桿菌在脅迫環境中是否產生了深度休眠芽孢導致其在SDS(0.2g/L)環境中芽孢的萌發延遲還需深入研究，該菌株在本實驗中芽孢萌發時間為80h。

圖5 SDS脅迫下枯草芽孢桿菌生長曲線

圖6 SDS脅迫下簡單芽孢桿菌生長曲線

圖7 SDS脅迫下大腸桿菌生長曲線

圖8 SDS脅迫下變形桿菌生長曲線

實驗結果表明，SDS在低濃度下(本實驗為0.2g/L)對4種細菌的生長前期有明顯的抑制作用，說明SDS的毒性比PEG6000更強，SDS濃度為0.4g/L時，4株細菌的生長已經完全被抑制。研究[19,20]認為兩類細菌對外界污染的敏感程度不同，G+比G-更敏感，原因是兩類細菌結構及成分有差異，導致其解毒抗性能力不同，對不良環境的適應能力也不同。

3 結論

3.1 4株細菌對兩種表面活性劑的敏感性不同

PEG6000(濃度：0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L)和SDS(濃度：0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L)對簡單芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌及大腸桿菌都有抑制作用，其中PEG6000有抑制現象但3株細菌還有生長，SDS濃度>0.4g/L 3株細菌的生長完全停止，SDS濃度為0.2g/L時培養一段時間3株細菌數量開始增加，應該是遺傳變異所致；變形桿菌對PEG6000和SDS表現有差異，該實驗濃度條件下PEG6000促進變形桿菌的生長，變形桿菌在SDS(0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L)條件下生長完全被抑制，試驗發現4種細菌在PEG6000和SDS的脅迫作用下，G+比G-更敏感。

3.2 不同的表面活性劑對微生物的毒性有明顯差異

實驗通過測定陰離子表面活性劑(SDS)和非離子表面活性劑PEG6000對4株細菌脅迫后生長曲線的變化后發現，低濃度(0.2g/L))的SDS對細菌的生長表現出明顯的抑制作用，當SDS濃度>0.4g/L后對4株細菌的生長完全抑制；相對高濃度(2.0g/L)的PEG6000對細菌生長也有抑制作用，變形桿菌在此濃度下表現為促進作用，兩種表面活性劑對4種細菌的毒性順序為SDS>PEG6000。