食物過敏：從致敏機理到控制策略

傅玲琳，王彥波

（浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018）

過敏性疾病是一種嚴重影響人體健康的全球性問題，引起機體過敏的原因眾多，其中食物過敏占有不容忽視的比重。食物過敏是指由機體免疫系統對某些食物蛋白質的超常反應，發病時可累及周身多個系統，如皮膚、呼吸道、胃腸道和中樞神經系統，嚴重時可導致過敏性休克甚至危及生命。近些年來，世界范圍內食物過敏的發病率呈逐年上升趨勢，食物過敏已經成為全球關注的食品安全和公共衛生問題，被稱為繼哮喘之后的“第二波”過敏流行病[1]。在歐美、澳大利大等西方國家，食物過敏在成人中的患病率約為2%，而在兒童中則高達8%[2]。大量研究發現，食物過敏的發病率上升可能與基因、環境以及二者的相互作用（如表觀遺傳）有關，考慮到短時間內遺傳基因不會發生顯著變化，環境和飲食因素被認為是導致食物過敏風險上升的主要原因[2]。根據發病機制的不同，食物過敏可以分為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E介導、非IgE介導和混合介導的反應，其中IgE介導食物過敏的機制較為清楚，主要包括致敏階段和效應階段，即機體首次暴露致敏原產生特異性IgE（specific IgE，sIgE），sIgE與肥大細胞和嗜堿性粒細胞上的受體結合使機體致敏，當致敏原再次進入體內時，通過與上述細胞表面的sIgE結合發生交聯，激活胞內的酶系統，促進多種炎性介質的釋放，引發一系列生理反應[3-5]。

根據世界衛生組織（World Health Organization，WHO）和聯合國糧食與農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）的統計，90%以上的食物過敏反應是由牛乳、雞蛋、大豆、花生、小麥、堅果、魚類和甲殼α綱類動物以及相應制品引起的，這8 類食物因此也被稱作“Big Eight”[6-7]。2021年2月，最新的WHO/FAO食物致敏原風險評估專家咨詢會上提出，綜合考慮每種食物引起超敏反應的發生幾率、嚴重程度和潛在風險，芝麻或將取代大豆成為新的八大類之一[8]。除八大類以外，其他種類的食物，如某些水果、蔬菜、昆蟲和谷物等也可能是特定國家或地區的常見致敏食物。近年來，隨著人們對黏膜免疫系統、口服免疫耐受以及腸道共棲微生物的逐漸認識，有關食物過敏的機理研究也在不斷深入。但是，目前對于食物過敏最有效的治療手段仍是嚴格避免接觸致敏原。隨著食品工業的快速發展，使用的原料越發復雜和多樣，飲食回避對于易感人群難度較大，且易造成人體營養素的缺乏與失衡。一方面，日益嚴峻的食物過敏問題需要切合實際的風險評估和標識措施；另一方面，各類易感人群的營養需要也為低敏食品體系的研究提出了挑戰。

食物過敏現已成為食品行業亟需面對和解決的食品安全問題。基于此，本文將圍繞食物過敏的研究現狀，從食物過敏的流行病學特征與分子機制、食物致敏原的識別與評價，以及食物過敏的診斷與控制等方面逐一展開，系統回顧最新研究進展并提出展望，以期為食物過敏的預防與控制，以及保障食物致敏原安全提供一定借鑒。

1 食物過敏的流行病學與致敏機制

1.1 中國食物過敏的最新流行病學特征

食物過敏的流行病學調查在美國、加拿大和歐洲一些國家已經有了較為全面的數據。但是在我國，尚無針對普通人群開展的食物過敏流行病學研究，僅有部分區域性或針對特定年齡段的調查數據可供參考。其中區域性的橫斷面研究主要集中在省會城市和南方地區，如溫州（浙江）[9]、重慶[10]、廣州（廣東）[11]、北京[12]、上海[13-14]和香港[15]等地，并且針對的多是嬰幼兒、學齡前和學齡段兒童，尚無有關成人或全年齡段人群的食物過敏流調報告。如表1所示，通過問卷調查或病史初篩，自述/父母報告的食物過敏發病率范圍較大，為4.80%～21.13%，結合皮膚點刺（skin prick test，SPT）和/或血清學特異sIgE和/或開放性食物激發確診的發病率為0.34%～18.0%。除橫斷面調查外，也有少數研究針對門診過敏病人和超敏報告事件進行了統計[16-20]，其中規模最大的是一項2017年我國南方地區過敏性疾病患者血清sIgE檢測結果（n＝39 813）的回顧性分析，該項報告發現過敏食物中陽性檢出率最高的是蝦（19.2%），其次是蟹（15.5%）和雞蛋白（9.9%）[20]。

表1 中國人群食物過敏的橫斷面流行病學調查數據Table1 Cross sectional epidemiological survey data of food allergy in China

盡管有關食物過敏的橫斷面研究十分有限，但從已有的數據中仍可對我國食物過敏的流行病學特征窺知一二。1）發病率總體呈上升趨勢。一項針對溫州地區2 歲及以下兒童的3 次橫斷面調查顯示（1999、2009年和2019年；n＝1 228），該年齡段兒童的食物過敏發病率呈逐年上升趨勢：1999年為3.5%，2019年上升為11.1%；其中最常見的牛乳過敏在1999—2019年間的發病率由1.6%上升為5.7%（P＝0.004）[10]。2）可能存在城鄉、地域和民族差異。有關城鄉地區的發病情況，一項北京6～11 歲小學生的隨機抽樣調查（n=10 672）發現，該地區城市兒童食物過敏的父母報告率為11.90%，顯著高于郊區兒童的8.2%（P＜0.001）[12]；但另一項廣州市區及韶關農村學齡兒童的研究（n＝11 432）發現，結合問卷答案和SPT或sIgE檢查，兩地食物過敏的發病率并無顯著差異（P=0.872）[11]。此外，袁娟麗等對我國南北方人群攜帶的乳糜瀉人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）易感基因進行研究發現，我國南方人群和女性群體罹患乳糜瀉的風險可能更高[21]。針對民族差異性，Zhou Chunyan等通過對我國新疆地區患有胃腸不適癥的患者進行篩查（n＝2 277），發現漢族人患乳糜瀉的比率顯著低于維吾爾族、哈薩克族和回族人群[22]。3）最常見的過敏食物與西方國家存在異同。由表1不難看出，我國食物過敏人群主要對牛乳、雞蛋（白）和蝦蟹過敏，而西方國家發病率較高的花生和堅果過敏在我國并不常見，WHO列舉的“八大類”致敏原在我國并不完全適用；此外，水果類食物例如桃子和芒果也是我國人群的常見致敏原。當然，由于缺乏全國范圍內的規范性調查結果，以上幾點只是筆者的初步判斷，并且只能部分代表嬰幼兒和未成年兒童群體，但是相信隨著政府和業內專家對食物過敏疾病的日漸重視，我國普通人群的食物過敏流行病學數據將逐漸得到完善和補充。

1.2 食物過敏的分子機制

針對食物過敏的分子機制，比較清楚的是IgE介導型的免疫學機理。正常情況下，機體免疫系統能夠正確區分致病性抗原與無害的環境抗原，如食物中的營養物質。這一免疫耐受的形成過程最初與腸道相關淋巴組織（gut-associated lymphoid tissue，GALT）密切相關。一系列細胞參與了免疫耐受的誘導過程，包括抗原從腸腔轉移到固有層和淋巴組織，進而被呈遞并誘導相應的T細胞反應，最后免疫效應細胞歸巢回到腸道等[4]。簡單來說，進入機體的變應原經胃腸消化后可能通過細胞旁途徑、腸上皮細胞胞吞作用和M細胞的內吞等方式透過腸上皮屏障。透過屏障后，變應原可經固有層中傳統的抗原遞呈細胞（antigen-presenting cells，APCs）如樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）攝取，或經非傳統的APCs，如庫普弗細胞和漿細胞樣DCs處理后遷移進入腸系膜淋巴結（mesenteric lymph node，MLN），然后被攝取的蛋白/多肽進一步降解并通過主要組織相容性復合物類（major histocompatibility complex，MHC）分子呈遞給初始T細胞，激活T細胞免疫反應[5]。其中，CD103＋DCs是促進黏膜耐受形成的主要DC亞群之一[23]，該類細胞產生的轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和視黃酸，可誘導初始T細胞分化為特異性叉頭狀P3（FOXP3＋）調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）[24]。此外，視黃酸也可誘導Treg細胞表達整合素α4β7，誘導其他Treg細胞歸巢到腸道，抑制免疫反應[25-26]。與此同時，視黃酸和DCs的相互作用在次級淋巴組織中也可誘導B細胞向分泌IgA的漿細胞分化，最終達到IgA抗體的類別轉換。

在食物過敏患者體內，這一口服耐受的形成過程遭到了破壞。一般認為，致敏過程中腸上皮屏障的損傷導致了變應原的透過量增加，同時誘導上皮細胞因子，如白介素（interleukin，IL）-33、IL-25和胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的分泌，這些細胞因子可上調DCs上的OX40配體（OX40L）。DCs進一步誘導初始T細胞向Th2細胞分化，釋放可招募嗜酸性粒細胞的細胞因子IL-5，并促進B細胞類別轉換產生IgE（通過IL-4和IL-13）[4-5,27]。形成的sIgE與組織中肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面上的FcεRI受體結合，再次接觸致敏原時發生脫顆粒反應，激活胞內的酶系統釋放一系列活性介質，引起局部或全身性的變態反應。圖1匯總并展示了致敏過程中腸道內Th2細胞介導的變應原免疫反應。

圖1 致敏過程中腸道內Th2細胞介導的變應原免疫反應[4]Fig. 1 Th2 cell-mediated inflammatory response to oral allergens in the gut during sensitization process[4]

另一方面，腸道微生態在調節機體對致敏原的免疫反應中起著關鍵作用[28]。研究發現，食物過敏和健康人群的腸道微生態組成存在明顯不同，這些差異出現在過敏癥狀之前，且在嬰幼兒和兒童時期更為明顯：例如，患有雞蛋過敏的兒童其腸道菌群的α-多樣性更高，且毛螺菌科和瘤胃菌科的類群豐度更高[29]。而與健康組相比，食物過敏的嬰兒腸道菌群的多樣性沒有差異，但厭氧菌和自養型芽孢桿菌的相對豐度有所減少，擬桿菌和芽孢桿菌的相對豐度有所增加[30]。再如，在患有牛乳過敏的嬰兒中，與持續性過敏組相比，8 歲后過敏癥狀得到緩解的個體其早期（3～6 歲）腸道菌群中梭菌屬和擬桿菌屬的水平更高[31]。更直接的是，通過將健康嬰兒的糞便菌群移植到無菌小鼠上，可以緩解這些小鼠攝入牛乳后的過敏反應，但是從牛乳過敏的嬰兒移植的糞便菌群則沒有這一能力[32-33]。以上證據有力地表明了食物過敏與腸道微生態間的因果關聯。有關微生態參與調控的食物過敏機制仍在不斷探索階段，目前報道的作用主要包括：調節腸道細胞功能，提升腸道屏障特性；生成代謝產物（如乙酸、丁酸和丙酸等短鏈脂肪酸）參與免疫調控；以及促進和維護機體口服耐受等[34-36]。筆者前期研究發現，與健康人群相比，食物過敏患者在腸道菌群的組成和功能上存在顯著差異，進一步經代謝組學和通路富集分析發現，過敏患者體內腸道微生物的若干關鍵代謝通路得到了調控，尤其是氨基酸代謝水平發生了顯著變化，多種氨基酸的合成增強，降解減弱；與此同時，特征氨基酸（如異亮氨酸）的變化程度與患者的臨床和免疫學指標密切相關。菌群來源的氨基酸代謝物可能與食物過敏的發生有關，但這其中涉及的免疫信號通路和分子機制有待進一步的研究。

1.3 食物過敏發生的機體風險因素

目前，尚不清楚是哪些原因導致人體內由DCs和Treg細胞介導的口服耐受過程轉變為了由Th2細胞介導的食物過敏反應。研究人員指出，一些可能誘發食物過敏的風險因素包括家族病史、性別、種族、基因多態性、接觸細菌的時間和途徑、膳食習慣的改變和早期皮膚暴露等[37]。關于先天遺傳因素的作用可詳見Lack[37-38]、Sicherer[2]等的報道，此處筆者將針對后天性因素進行詳細闡述。

Strachan在1989年提出了著名的“衛生學假說”（Hygiene hypothesis），認為兒童早期缺乏對傳染源、細菌和寄生蟲的接觸，導致機體免疫系統沒有得到足夠的鍛煉，增加了其對過敏性疾病的易感性。進一步研究發現，過敏性疾病的增加更有可能是由于現代化的環境和生活方式使得人們接觸共生有益菌的機會變少，而這些共生菌能夠幫助宿主免疫系統建立正確的調控途徑避免發生紊亂，即發展形成了“老朋友假說”（old friends hypothesis）。目前已發現支持這一假說的流行病學證據，如孕婦產前避免食用抗生素、孕期攝入膳食纖維（調控腸道微生態平衡）、陰道分娩、母乳喂養、幼兒時期接觸動物等均能在一定程度上降低兒童發生過敏性疾病的幾率[37,39-41]。

近30 年來，飲食結構的顯著變化使得研究學者們懷疑，某些宏量和微量營養素的攝入可能與日益增加的食物過敏狀況有關，這里有4 個假說值得深思：VD水平、膳食脂肪的來源、抗氧化劑的減少和伴隨有害產物的攝入。首先，VD假說認為，體內VD的不足或過量（主要是日照時長、緯度、出生季節和膳食攝入導致的）是哮喘和過敏發生率增加的原因。例如在美國和澳大利亞，與靠近赤道的地區相比，遠離赤道的地區人群發生食物過敏的可能性更高[42,43]，再如Nwaru等[44]發現，母親在懷孕期間VD的攝入量與嬰兒較低的食物過敏風險有關；另一方面，也有幾項隊列研究發現嬰兒期間補充VD增加了人群罹患食物過敏的幾率[45-46]。有關VD與食物過敏的關系尚未得到一致的結論，有人提出，二者之間可能存在一種“U形”關系，即VD過少或過多均會增加食物過敏發生的風險[47-48]。從機制上看，VD的活性形式1,25-二羥VD參與著多種免疫細胞的調節，如T細胞、DCs和Treg細胞等，VD也可能通過影響下游基因的表達、作用于表觀遺傳（如DNA甲基化）和調節腸道菌群組成等方式影響免疫系統的平衡[49]。第二，膳食脂肪的來源，研究認為動物脂肪消耗量的減少以及人造奶油和植物油使用量的增加加劇了食物過敏的發生。這主要是與ω-6系多不飽和脂肪酸（如亞油酸）的攝入降低、ω-3系多不飽和脂肪酸（如二十碳五烯酸）的攝入升高有關。ω-6系脂肪酸可以合成前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2），而ω-3系脂肪酸則會抑制PGE2的合成。PGE2能抑制T細胞產生IFN-γ，導致B細胞產生IgE，誘發食物過敏的發生[37,50]。第三，抗氧化劑假說，這個假說認為新鮮水果和蔬菜的食用量減少降低了膳食抗氧化劑的攝入，如VC、VE、β-胡蘿卜素、硒和鋅等，這可能是導致機體過敏的原因之一[38,51]。關于這一觀點的爭議較大，并且有關食物過敏的證據尚不完善，此處不再詳述。第四，伴隨有害產物的攝入，該假說認為在食品原料及在加工、儲藏過程中引入的特定有害物質可能誘發食物過敏。例如，一項研究分析了南非食物過敏隊列中兒童的環境風險因素，發現快餐的攝入和油炸烹飪方式與過敏的發生有關[52]。再如Wang等[53]經Meta 分析發現，人群攝入快餐的頻率與哮喘和喘鳴樣癥狀的發病有密切關系。這一現象可能與油炸食品中廣泛存在的糖基化終末產物（advanced glycation end-products，AGEs）有關。AGEs是一類蛋白質、多肽和脂類與還原糖反應生成的多種高度異質產物的總稱，它們具有改變致敏原表位結構、激活炎癥細胞通路和Th2型偏向分化的特點，這些物質可能通過變應原相關/無關的多種途徑誘發食物過敏[54-56]。近期發表在Cell上的觀點進一步支持了該假說，提出了“食物過敏是機體食品質量控制體系（food quality control system，FQCS）的異常激活”[57]。該觀點認為，FQCS通過監視食物成分來消化和吸收有益的營養物質并排出有害物質。但當環境或食物中存在某些能夠有效誘發機體FQCS的有害物質（如加工產物、防腐劑、有毒的植物次生代謝物等），可能使得免疫系統對同時攝入的食物蛋白質高度敏感，從而誘發免疫反應。以上有關膳食習慣與食物過敏的關聯可以總結為“營養免疫調節假說”（nutritional immunomodulation hypothesis），即認為現代飲食和環境的急劇變化導致某些具有免疫調節潛力的因素影響了食物過敏的發生[2]。

另一方面，早期皮膚暴露是誘發食物過敏的重要風險因素。Fox等據此提出了“雙重致敏原暴露假說”（dual allergen exposure hypothesis），認為經口致敏可以促進免疫耐受的形成，但是經皮膚致敏則會干擾口服耐受。受損的皮膚屏障導致的變應原早期暴露和持續性炎癥可能誘發和加劇食物過敏[58]。已經有越來越多的證據支持這一觀點，例如在絲聚蛋白（具有維持皮膚屏障的功能）突變的人群中觀察到了更高的食物過敏發生率[59]；再如在患有特異性疾病的嬰兒中，花生過敏的發病率與環境粉塵中檢出的花生含量密切相關等[60]。在動物模型中，將小鼠破損的皮膚暴露于卵清蛋白或花生提取物，其體內產生了相應的sIgE并誘發了Th2型免疫應答[61-62]。有關皮膚暴露致敏的具體機制還在研究中，已有觀點認為：受損的皮膚上皮細胞可釋放多種炎性因子，如IL-25、IL-33和TSLP，它們作用于DCs和其他細胞，誘導形成局部的Th2偏向型免疫反應，進一步轉移到腸道，通過效應細胞歸巢和腸道肥大細胞聚集等方式誘發食物過敏[37,63]。

2 食物致敏原的識別與評價體系

2.1 什么使食物蛋白質成為致敏原?

食物致敏原的定義是可由特定免疫細胞識別并引發產生特定癥狀的食物蛋白種類。截止目前，經WHO和國際免疫學會聯合會（International Union of Immunological Societies，IUIS）致敏原命名小組委員會命名的食物致敏原共有370余種，涵蓋了包括“八大類”食物在內的125 種食物。

致敏原結構中決定其被免疫系統識別的片段稱為表位，即表位是變應原中參與抗體結合的部分。根據結合受體的不同，表位可分為T細胞表位和B細胞表位；根據結構的不同，表位又可分為線性表位和構象表位。其中，線性表位是由多肽鏈上連續的氨基酸組成的，構象表位是由空間上臨近但一級序列不連續的氨基酸組成的[64]。目前，針對表位長度的觀點不甚統一，但考慮到MHC II類分子對不同鏈長肽段的親和程度，抗原表位的合適長度一般為10～25 個氨基酸。表位是機體識別致敏原的物質基礎，因此有相當一部分研究致力于鑒定不同食物致敏原的表位結構，近年來也發展形成了一系列集成化、高通量化的表位定位技術，如多肽芯片技術、質譜技術、表面等離子體共振和噬菌體展示技術等[65]。明確致敏原的表位一方面可以幫助理解抗原-抗體相互作用的結構基礎；另一方面，也可為食物過敏病患者的血清學診斷提供重要信息。如通過比較不同雞蛋過敏兒童血清對卵類黏蛋白表位的識別能力，J?rvinen等發現持續過敏患者的血清抗體較暫時性過敏患者可以識別更多的致敏原表位，針對其中特異性表位的結合抗體或可作為持續性食物過敏的篩查工具[66]。

食物中的蛋白質數量非常龐大，但只有其中少部分的蛋白質成為了食物致敏原。研究人員通過比較不同類食物致敏原的結構和生化特性，發現致敏原具有如下共同特征：1）含量豐富。食物中的致敏原通常為其中豐度較高的蛋白質，相較那些含量較低的蛋白組分，免疫系統有更多的機會接觸到這些高豐度蛋白引發免疫反應[67]；2）穩定性高、不易消化。許多食物致敏原耐熱和酸堿，且不易被消化酶降解，具有較強的化學穩定性和抗消化性，它們經烹飪或胃腸消化后仍能保持一定的結構完整性，被認為是能夠刺激腸屏障發生特異性反應的重要因素[68]；3）蛋白質結構的特殊性。許多致敏原含分子內二硫鍵，破壞這些二硫鍵會改變蛋白質的結構和穩定性，降低表位結合sIgE的能力；此外，大部分致敏原屬于糖蛋白，蛋白質翻譯后修飾，尤其是糖鏈的修飾被認為與致敏原的免疫識別有關。雖然已有研究鑒定了其中部分蛋白的糖鏈結構，但其與致敏原抗原表位的特異性和參與的致敏識別機制尚不十分明確[67,69]。4）與已知致敏原的同源性[70]。相當一部分致敏原之間存在序列同源性，例如一些果蔬類致敏原與吸入性致敏原（如花粉）存在不同程度的同源性，這些變應原之間的免疫交叉反應可能導致機體對多種食物過敏。根據這一特征，未知蛋白與已知致敏原的序列或結構相似性常是判定其安全性和潛在致敏性的指標之一。值得注意的是，以上提到的各種致敏原特征均存在例外，例如鱈魚主要致敏原Gal d 1（屬小清蛋白）的豐度較低，不到其肌肉組織濕質量的1%[71]；獼猴桃致敏原Act c 1、桃致敏原Pyr c 1和蘋果致敏原Mal d 1等化學性質不穩定，極易被胃蛋白酶消化[72]；再如有些致敏原不含糖基，也并非每位花粉癥患者都對某種水果或蔬菜過敏等等。使食物蛋白質成為致敏原的原因還未完全揭示。食物本身是十分復雜的基質，除了含有致敏原外，還有很多非致敏組分，如其他蛋白質、脂質、添加劑和食品加工伴隨產物等。以脂質為例，膳食中的脂肪可能作為助劑誘發炎癥和Th2偏向型免疫響應，同時可能會降低蛋白質的消化率，增加腸道屏障的通透性[73]。目前針對食物致敏原的研究大多集中在蛋白質分子本身，除此之外，食物復雜基質的影響、內外源有害物質的協同作用（例如前述的FQCS）以及特定人群的飲食習慣和地域差異等都可能是導致某種特殊致敏原出現的潛在因素。

2.2 食物致敏原的致敏性評價手段

準確的食物致敏原評價方法有助于過敏相關免疫機理的研究，也是研發預防和治療食物過敏手段的必要途徑。根據體系的不同，食物致敏原的評價手段可以分為體內、體外和生物信息學比對方法。

2.2.1 體內評價方法

體內評價是研究食物潛在致敏性最直接、準確的方法。考慮到人體激發實驗的難度和風險性，致敏原的體內評價手段多采用齲齒類動物過敏模型，常見的有BALB/c、C3H/HeJ、A/J和C57BL/6等小鼠，以及Wistar和Brown Norway（BN）等大鼠[74-75]。除此之外，也有少數研究利用狗、豬和斑馬魚構建食物過敏動物模型[75-77]。理想的動物模型應具有和人體相似的黏膜免疫機制、胃腸消化和腸道生理特征，并且具有一定的易感性，可以形成類似機體內發生的免疫效應過程和臨床過敏癥狀。其中，BALB/c小鼠是近交高應答IgE品系，C3H/HeJ小鼠是Toll樣受體4基因突變型，二者廣泛應用于食物過敏模型的構建；C57BL/6常被用作吸入性過敏反應的相關研究；BN大鼠是高免疫球蛋白應答品系，可以在不使用佐劑的情況下產生致敏原特異性應答，但是其效果易受環境、年齡及亞臨床感染的影響[74,78]。值得指出的是，不同種類和品系的鼠類對同一種食物致敏原的識別方式和敏感程度存在差異，因此需要根據研究目的和致敏原特性有目的地進行選擇和評價。

在食物過敏動物模型中，除類型和品系的選擇外，動物對致敏原分子的易感性，致敏原的給予劑量、頻次、致敏途徑和佐劑的使用均會影響動物免疫反應的形成方向（致敏/耐受），進而決定模型的構建是否成功。其中，致敏原的致敏途徑有口服灌胃、腹腔注射和皮下注射等。表2以對蝦致敏原原肌球蛋白刺激BALB/c小鼠為例，列出了2 種主要致敏途徑的致敏劑量、周期和優缺點。可以看出，致敏原的口服給藥符合實際生活中食物經口攝入過敏的情況，但易產生免疫耐受，一般需要借助黏膜佐劑（如霍亂毒素（cholera toxin，CT）或其亞單位）破壞免疫耐受，誘導食物過敏反應；相比較下，致敏原的腹腔注射作用部位靠近黏膜，在佐劑（如弗氏佐劑和氫氧化鋁）的幫助下，更易引起黏膜免疫反應，致敏效果好、成功率高，但是致敏原未經胃腸消化，因而不能反映食物進入機體的真實情況[79]。鑒于此，一部分研究會使用多種途徑組合的方式以獲得最佳的刺激效果，如采用腹腔注射致敏聯合灌胃激發的方式建立過敏模型[80-81]。經激發后，刺激物的致敏性可以通過不同的指標評價，常見的如動物的體溫、體質量和過敏癥狀評分，血清學特異性抗體、活性介質和細胞因子的水平，以及免疫細胞的功能和分化等。

表2 不同致敏途徑構建BALB/c小鼠過敏模型的對比[79]Table2 Comparison of the establishment of food allergy model in BALB/c mice by different sensitization routes[79]

2.2.2 體外評價方法

致敏原的體外評價方法具有操作性強、通量高、周期短、安全可行等優勢。常用的體外評價手段有血清學和細胞學兩種。血清學方法一般是基于“致敏原表位-特異性抗體結合”的原理進行評價，主要包括放射過敏原吸附實驗（radioallergosorbent test，RAST）、酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、斑點印記雜交（Dot blot）和免疫印記法（Western blot，WB）等。其中ELISA因特異性好、靈敏度高，常被用作食物致敏原的評價和定性定量分析，主要有間接法、競爭法和雙抗體夾心法等，Dot blot的原理近似于間接ELISA，而WB主要用于評價復雜混合物，聯立二維電泳和蛋白質譜可以達到分析、鑒定粗蛋白組分中抗體結合蛋白的目的。值得指出的是，以上血清學方法依賴于“致敏原-抗體”的特異性結合，易受食物基質和抗體識別特性的影響出現假陽/陰性，往往需要進一步的驗證[82]。

在IgE介導的食物過敏反應中，致敏原表位與肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面的sIgE抗體結合，引起細胞脫顆粒并釋放活性介質（如組胺、類胰蛋白酶和β-氨基己糖胺酶），作用于特定組織和器官引起過敏癥狀。因此可以通過評價免疫細胞的相應變化研究食物的致敏能力，即細胞脫顆粒實驗。已經有若干個細胞模型被用于食物致敏原的評價，如人肥大細胞（HMC-1和LAD2）和嗜堿性粒細胞，以及大鼠嗜堿性粒細胞（RBL-2H3）等。其中HMC-1和LAD-2是兩類商業化的人肥大細胞系，人嗜堿性粒細胞可由患者外周血分離得到；RBL-2H3是大鼠嗜堿性粒細胞腫瘤株亞系，經人源化處理的RBL-2H3呈現了理想的人IgE結合能力，并且具有與人嗜堿性粒細胞類似的功能和介質釋放特點[83]。上述細胞（系）經與患者血清中的sIgE結合后，再次暴露于致敏原發生脫顆粒，通過細胞形態學的改變、活性介質和細胞因子的釋放評價食物的致敏能力[75,84]。該類方法更好地重現了體內IgE-介導的細胞生物學變化，是傳統血清學方法的有力補充，但是其結果易受細胞狀態、分散形式和操作條件的影響，進一步應用需要進行必要的方法學標準化。

由于食物過敏的復雜性，單一細胞模型往往不能很好地模擬體內免疫環境，共培養技術通過將2 種及以上的細胞培養于同一環境中，實現了細胞間信息和物質的溝通，具有更好地反映體內環境的優點。筆者前期利用Tranwell小室將腸道上皮細胞CMT93、小鼠脾臟來源DCs和T細胞進行共培養，成功構建了腸道三維細胞模型（圖2）。以卵白蛋白為典型致敏原進行刺激發現，與傳統平面培養相比，三維細胞模型中各個信號通路的基因表達得到了顯著調控，且體系中初始T細胞向Th2細胞分化的現象更為明顯。Transwell共培養系統更好地模擬了體內腸道黏膜免疫的微環境，適用于致敏原評價、抗過敏因子篩選和食物過敏機制等方面的研究。

圖2 腸道三維細胞模型圖示Fig. 2 Illustration of the three-dimensional cell model of small intestine

2.2.3 “高通量生物信息預測-體外驗證”表位研究方法

生物信息學是整合了生物學、數學、統計學和計算機科學來闡明和理解生物學大數據的學科。作為一種低成本、高通量的手段，常被用作致敏原評價初期的篩選工具，主要體現在轉基因食品的安全性評估和致敏原表位的預測研究上。從本質上看，生物信息學分析是通過將目標蛋白與致敏原數據庫進行同源比對，根據基因或蛋白序列的同源性對研究對象的致敏性進行評價。可提供致敏原信息的數據庫包括Allergome（www.allergome.org，目前最完善的過敏原數據庫）[85]、美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）、Uniprot蛋白數據庫、國際免疫學會聯合會（International Union of Immunological Societies，IUIS）（http://www.allergen.org）、致敏原搜索引擎AllergenOnline和致敏原結構數據庫（structural database of allergenic proteins，SDAP）等[86-87]。

在致敏原評價方面，近年來得到廣泛關注的是生信分析在表位預測中的應用，包括線性表位和構象表位的預測[65,88]。最常見的是致敏原B細胞線性表位的預測，代表性軟件/網站有BepiPred[89-90]、DNAstar[91]、ABCpred[91]、AntheProt[92]、BcePred[93]和Immunomedicine Group[94]等。這些工具多是基于蛋白質氨基酸殘基和多肽鏈的理化性質，如親/疏水性、可及性、柔韌性、電荷分布和二級結構等（或結合多種指標得出的抗原指數）對目標蛋白進行表位預測。由于以上各種軟件單獨使用均有一定的局限性，實際操作往往結合3 種以上的工具進行綜合分析，后續再利用其他評價方法進行驗證。由此發展形成的“高通量生信預測-體外驗證”表位研究方法[82,95]，相較傳統的肽掃描技術具有耗時短、成本低、通量高的優勢，在食物致敏原的表位定位中得到了廣泛應用，如對蝦原肌球蛋白和精氨酸激酶[96]、大豆β-伴大豆球蛋白[97-98]和脈紅螺副肌球蛋白[99]的表位研究等。圖3所示為該體系的基本流程和研究策略。

圖3 “高通量生物信息預測-體外驗證”表位研究策略[96]Fig. 3 Research strategy for allergenic epitopes by high-throughput immunoinformatics coupled with in vitro verification[96]

相對于線性表位的預測，構象表位的預測研究進展相對緩慢，但也已有一些基于致敏原結構信息的預測工具，如SEPPA[100-101]、DiscoTope[102]、EPSVR和EPCES[103]等。除表位預測外，生物信息學工具也可通過已知的表位信息預測相似致敏原之間的交叉反應，聯合突變肽技術還可篩選出表位中影響IgE結合能力和致敏性的關鍵氨基酸[96]。其他有關食物致敏原的表位研究手段，詳見Zhou Fanlin等的報道[65]，此處不再詳述。

2.3 食物致敏原的確證與檢測

實施食物致敏原標簽制度是避免食物過敏的有效措施之一。目前，已頒布強制性食品致敏原標識措施的國家/地區有美國、歐盟、加拿大、日本、澳大利亞和新西蘭等[104]。我國GB 7718—2011《食品安全國家標準 預包裝食品標簽通則》中規定：食品中可能含有八大類食物致敏原時，宜在配料表中使用容易辨識的名稱，或在鄰近位置加以提示[105]。2019年12月，食品安全國家標準審評委員會發布了該標準的征求意見稿，沿用了GB 7718—2011版中規定的致敏物質目錄，但擬將其中致敏原標識的相關條款由推薦性轉為強制性標識。

致敏原管理的程序一般包括識別、評估、標識及相應的控制措施。在整個過程中，建立靈敏可靠的致敏原檢測方法至關重要。目前已有多種技術可用于檢測加工或未加工食品中的致敏原含量，根據目的物的不同可分為針對蛋白質或針對DNA的檢測，根據檢測原理的不同可分為基于免疫學、基于分子生物學、基于質譜技術和基于生物傳感器的檢測方法等。

免疫學方法，即利用特異性抗體檢測目標蛋白，使用的抗體有單克隆抗體和多克隆抗體兩類。傳統的免疫學方法如ELISA和WB的原理在2.2.2節已有介紹，此處不再贅述。其中，ELISA是食品工業最常用的致敏原定量手段，具有易操作、靈敏度好、檢測限（limit of quantitation，LOD）理想等優勢，但也存在一定缺陷：如抗體的交叉反應易出現假陽性，食物基質效應的影響，此外致敏原在食品加工過程中發生反應可能掩蓋其部分抗原性，導致ELISA的結果產生偏差[106-107]。目前已有大量商品化的ELISA試劑盒可供各類致敏原檢測使用，但是多數試劑盒是針對單一致敏原/致敏食物設計的，針對不同種類原料進行多靶標檢測的體系尚多處于研究階段。側流免疫層析技術是另一類常見的免疫學檢測方法，其原理與ELISA相似，具有可視性強、成本低、易操作、易攜帶等優點。傳統的側流免疫層析依賴于肉眼觀察，靈敏度較低，僅能進行半定量或定性分析，但是隨著高靈敏標記物、新型層析膜和檢測設備的應用，側流層析檢測系統正由傳統的定性檢測向精準定量檢測轉變[108-109]。

分子生物學方法主要是指聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光定量PCR法（quantitative real-time PCR，qPCR）和環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。該類手段分析的是致敏原/致敏食物的特征DNA序列，與蛋白質相比，DNA的穩定性更高且不易受表型變異的影響，隨著越來越多致敏原的DNA序列被報道出來，依賴DNA的致敏原檢測技術得到了快速發展[110]。傳統的PCR法，檢測靈敏度有限且只能提供定性結果。相比之下，qPCR可在擴增階段實現目標蛋白DNA的實時檢測，具有操作簡便、靈敏度高、重復性好的優勢，可以作為定量食物致敏成分的有力手段。通過使用不同的熒光探針建立多重qPCR，還可實現多種食物致敏原的同時檢測[111]。LAMP法則是基于恒溫核酸擴增技術，通過高度特異的顏色/濁度變化進行判定，無需熱循環儀器，更適合現場或條件一般的情況下進行快速檢測。值得指出的是，依賴DNA的分析手段可能受食品中抑制劑的影響出現誤差，提取前加入內標物可幫助提高定量結果的可信性[110]。研究人員通過比較檢測同一種致敏原的市售ELISA試劑盒與qPCR試劑盒，發現兩種檢測方法的結果較為一致，qPCR的特異性更好但ELISA的靈敏度更高，并且兩類產品均會受到樣品基質效應和加工處理的影響[112-113]。此外，由于PCR類技術并不直接檢測蛋白，無法直接反映樣品中致敏原的含量，其結果轉換為蛋白含量的校準參數也備受爭議，另外該手段也不適用于乳類和蛋類樣品中的致敏原分析[114-115]。

質譜類技術以高分辨率、高靈敏度和高通量的獨特優勢，在食物致敏原的識別與檢測領域備受關注。該技術克服了免疫學方法通量低和易有交叉反應的弊端，也避免了PCR類方法不能直接檢測致敏蛋白的缺陷。食物致敏原的質譜類確證技術可分為“top down”和“bottom up”兩類：其中“top down”指的是將完整蛋白離子化后進行質譜檢測，最常見的是基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight，MALDI-TOF），但是該方法提供的信息比較有限；另一類“bottom up”是現在主流的分析手段，其原理是利用特異性的酶或其他水解方法將蛋白質切割為小分子質量多肽混合物，利用色譜柱將混合物分離后進行一級或多級質譜的測定，再將得到的數據與蛋白質數據庫比對，從而確證目標蛋白[116]。在此基礎上建立的致敏原定量方法主要是采用多反應監測的方式（multiple reaction monitoring，MRM），通過選擇合適的目標物特征肽段和內標物，實現致敏原的絕對精準定量和多靶標檢測。常見的此類技術包括三重四極桿質譜（triple quadrupole mass spectrometer，QqQ-MS）、四極桿飛行時間質譜（quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Q-TOF-MS）和四極桿-線性離子阱質譜（quadrupole-linear ion trap tandem mass spectrometry，Q-LIT-MS）等[117]。其中QqQ-MS檢出限較低，在食物致敏原分析領域較為常見；此外，在這類方法基礎上形成的同位素稀釋質譜法已被定義為國際上食品安全檢測最精準的仲裁檢測方法，具有靈敏度高、特異性強、不易受基質干擾等優勢，其在致敏原確證和檢測領域的應用正處于積極探索階段。當然，質譜類檢測方法的缺點也比較明顯，除了設備和操作要求高、成本昂貴外，基質效應和食品加工可能導致目標物提取不完全，因此這類技術通常會選擇不同的基質以考察方法的適用范圍，同時優化前處理方法實現致敏原的有效提取等。

最后一類基于生物傳感器的檢測方法主要是指利用分子識別元件特異性地結合待測致敏原，發生反應后產生的信號通過轉換器轉變為可以定量處理的光學和電學等信息[118]。生物傳感器的種類非常豐富，常見的用于食物致敏原分析的類型有表面等離子共振傳感器（surface plasmon resonance，SPR）、電化學免疫傳感器和壓電免疫傳感器等；他們根據識別元件的類型也可分為免疫傳感器、核酸傳感器和適配體傳感器[119-120]。有關不同傳感器的原理、特點和應用形式可詳見若干前人綜述[119-122]。其中，SPR是基于表面折射率敏感變化的一類分析技術，當目標物與傳感器芯片結合形成復合物時，反映為傳感器表面性質的改變可對致敏原進行定量檢測[123]。該類方法具有簡單、快速、無需標記、靈敏度高等優勢，進一步通過與納米材料和免疫磁珠相結合，SPR在致敏原確證與檢測領域的應用日漸拓展。如Zhou Jinru等將抗體固定在金膜傳感器芯片上檢測水產品中的原肌球蛋白，檢測時間僅為3 min, 檢測限為1.0 μg/mL[124]。另一類電化學免疫傳感器主要是利用電化學方法對免疫反應進行監測，具體可分為電流型、電位型、阻抗型和伏安型傳感器4 類[119]。與其他種類的傳感器相比，電化學傳感器具有較高的小型化潛力。其中，如Fu Linglin等采用離子交換色譜聯立毛細管電泳檢測魚中的小清蛋白，最優條件下檢測時間為2.8 min，LOD為0.71 μg/mL[125]。目前，大部分用于定量食物致敏原的生物傳感器還處在實驗室研究階段，這類技術的產業化推廣無疑會為現有的檢測手段提供有力補充。

總體來說，各類檢測方法都有其獨特的優勢，目前尚沒有一種方法可以集合各種技術的優勢，實現致敏原的精準定量和高效分析（表3）。綜合不同方式的特點，筆者認為未來食物致敏原的檢測技術可以從以下幾個方面著手：1）開發有效的樣品前處理方法以實現蛋白的高效提取和純化，聯合背景抑制和/或信號放大手段，避除基質的影響；2）提高分析的特異性，如開發高特異性抗體、篩查穩定特征肽段和適配體等，最大限度地降低交叉反應現象；3）開展基于多種致敏食物的高通量檢測手段，特別是針對未知蛋白的非靶標確證技術；4）研究適用于不用場所的快速檢測方法和便攜設備等。

表3 食物致敏原定量檢測方法的優劣勢對比Table3 Comparison of different methods for food allergen quantification

3 食物過敏的診斷與控制

3.1 食物過敏的診斷：傳統與新興診斷技術

食物過敏可以分為IgE介導和非IgE介導的反應兩類，其中非IgE介導的類型因發病機制不明確、病程緩慢且臨床表現各異，現今缺乏公認的診斷標準[126]，本文將主要針對IgE型食物過敏的診斷展開探討。臨床上，醫生在詢問患者病情和家族過敏史，確定其為食物過敏引起的不良反應后，可以通過食物激發（oral food challenge，OFC）、SPT和飲食回避等體內方法，聯合血清sIgE的檢測等體外方法進行確證。

OFC實驗包括開放性食物激發實驗、單盲安慰劑對照食物激發實驗和雙盲安慰劑對照食物激發實驗（double-blind placebo-controlled food challenge，DBPCFC）。開放性食物激發實驗，即使用天然形態的食物激發，醫患雙方均知情，主要用于嬰幼兒及少兒群體的食物過敏診斷；單盲安慰劑對照食物激發實驗，通過制備食物膠囊等掩蓋受試食物的性狀和氣味，同時設置安慰劑，醫生知情但患者不知情，可以幫助排除患者心理因素的影響；DBPCFC，即制備食物膠囊和給予激發時，醫患雙方均不知情，是目前國際公認的食物過敏診斷“金標準”[2,127-128]。雖然OFC是食物過敏最準確的診斷方法，但是該實驗程序復雜，必須在有專業醫務人員和設施準備充分的條件下進行，不規范操作可能引起嚴重的過敏反應[129]。相比之下，SPT通過采用食物提取物/新鮮食物進行局部皮膚表層的侵入刺激，根據產生的風團和紅暈反應進行判斷，具有操作簡單、靈敏度高、安全性好的優勢，陰性結果準確率大于90%，但需注意該方法的特異性不高，并且由于沒有統一標準化的測試物，不同機構間SPT結果95%陽性的預測值存在一定差異[130]。此外，飲食回避則是通過短期回避暴露的可疑食物，后期觀察臨床癥狀的變化輔助明確食物過敏的種類，但是飲食回避易受患者機體狀況和其他因素的干擾，不能作為食物過敏的確診依據。另一方面，血清sIgE水平是反映機體識別致敏原的客觀指標，檢測血清sIgE水平是常用的食物過敏體外診斷方式，其中ImmunoCap系統是目前較為廣泛使用的致敏原檢測系統，可提供多達600 種食物抗原的sIgE分析。有報道稱，聯合SPT和血清sIgE檢測可顯著提高食物過敏診斷的準確率，陽性預測值高達92%[131]。

近年來，在已有診斷技術的基礎上，逐漸發展出現了一系列新興的檢測方法，包括致敏原成分診斷（components-resolved diagnosis，CRD）、嗜堿性粒細胞激活和肥大細胞激活實驗等。簡單來說，CRD是使用單一致敏原成分替代原有粗提物進行診斷的方法，例如使用Ara h 2和Ara h 6診斷花生過敏，使用Cor a 9和Cor a 14診斷榛子過敏，使用Jug r 1診斷核桃過敏，使用Ana o 3診斷腰果過敏等[132-134]。CRD在區分花粉癥與食物過敏的診斷上很有意義，因為許多植物花粉與食物間存在交叉反應性，如榛子Cor a 1與樺樹Bet v 1會有交叉反應，以Cor a 9和Cor a 14取代榛子粗提物可以幫助判斷患者是因榛子還是樺樹花粉引起的過敏。Flores Kim等通過匯總分析有關牛乳、雞蛋、花生和蝦等過敏食物的CRD研究發現，選用特定致敏原取代原有粗提物可顯著提升診斷的特異性，但靈敏度卻有所降低；此外由于各項研究結果的差異性，CRD的進一步應用需要確定合適的診斷閾值、風險評估控制和方法成本效益等[133]。另一方面，肥大細胞和嗜堿性粒細胞是IgE型變態反應的效應細胞，經與致敏原結合發生脫顆粒，釋放活性介質引起過敏癥狀（原理詳見2.2.2節敘述）。Ford等研究發現牛乳過敏與耐受患者嗜堿性粒細胞表面CD203的表達存在顯著差異，且與臨床過敏癥狀的嚴重程度有關[135]。Bahri等將人原代肥大細胞用于花生過敏的診斷，發現活化后細胞表面標志物的表達（CD63和CD107a）、前列腺素D2及β-己糖胺酶的釋放可顯著區分過敏患者，其診斷效果比CRD法更精確[136]。

隨著分子生物學、蛋白組學和基因組學的不斷發展，研究人員也提出了一系列可能輔助食物過敏診斷的新型標志物，主要涉及免疫細胞、體液和基因等方面，此處筆者不再贅述，部分內容可詳見Eiwegger等[132]的報道。值得指出的是，近年來，機器學習和人工智能在醫學領域顯示出了獨特的生命力，或可為食物過敏的精確診斷和處理提供有力方案。圖4匯總了食物過敏新型診斷方法及發展趨勢。

圖4 食物過敏新型診斷方法及其發展趨勢[132]Fig. 4 Novel approaches in diagnosing food allergy and future trends[132]

3.2 食物過敏的口服免疫耐受治療與限制

針對食物過敏的處理，臨床上沒有一致認可的治療手段，口服免疫療法（oral immunotherapy，OIT）是其中比較公認有效的治療措施。OIT是指通過有意的低劑量、長時間暴露于致敏原，不斷刺激機體對致敏原的耐受能力，誘導患者逐漸達到對特定食物致敏原的耐受或持續無應答的效果，屬特異性致敏原免疫治療（allergenspecific immunotherapy，ASIT）的一種。臨床OIT治療分為3 個階段：1）單日劑量遞增階段，在臨床監護下通過短時間內暴露梯度濃度致敏原，確定患者的個人最高耐受劑量；2）連續劑量遞增階段，保證受試者不發生嚴重不良反應的前提下，每1～2 周增加一次口服劑量，持續3～9 個月甚至更長時間，直至達到目標耐受劑量；3）維持階段，患者每日自行服用安全耐受劑量并定期追蹤復查，該階段通常持續數月到數年不等[137-138]。實際操作OIT時使用的食物和載體類型可能各異，有些使用現成的市售食品（如液態奶或花生粉），有些則使用特別處理的產品，如脫水蛋清或水解蛋白[138]。

臨床OIT治療后一般通過口服食物激發試驗評估其有效性，根據患者閾值提高的程度和維持的時長判定屬于暫時性脫敏還是持續無應答。大多數在治療期間實現脫敏的受試者停止治療后，只有少數能實現持續無應答[138]。目前有關OIT治療食物過敏的研究主要集中于花生、牛奶和雞蛋這3 類最常見的過敏食物。盡管多數報道指出，受試者經OIT治療后可在不同程度上提高其對目標致敏原的耐受性，但是有關OIT對過敏病人長期生活質量（quality of life，QOL）改善的數據并不一致。如Epstein-Rigbi 等追蹤了191 位4～12 歲接受OIT治療的兒童，通過食物過敏生活質量問卷調查發現，受試者在治療期間直至達到維持階段的QOL顯著提高，且在治療結束6 個月后持續有提升效果[139]；但另一項發表在《柳葉刀》上的研究卻發現花生過敏人群在OIT治療后發生過敏和不良反應的風險比未接收治療的患者高出3 倍，且在少數評估QOL的實驗中，兩組患者并不存在差異[140]。

2020年1月底，美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準了全球首個治療食物過敏的OIT制劑——Aimmune Therapeutics公司的PALFORZIA，適用于4～17 歲診斷出花生過敏的兒童，可減輕意外攝入花生后的不良反應，包括過敏性休克。目前，大多數OIT療法仍然處于臨床研究階段，且有許多問題尚未解決：首先，口服抗原的劑量和療程時間難以確定，維持期后患者依賴于食物的長期攝入，耐受程度可能隨時間的延長逐漸下降，另外，某些致敏原的耐受劑量與致敏劑量間范圍較窄，掌握不當可能引發嚴重不良反應；其次，OIT療法的免疫機制尚未明確，脫敏治療成功的生物標記物有待確定。初步認為Th1細胞的激活、Th2細胞的凋亡及失活以及Treg細胞的變化與OIT的機制有關，但是其深層次的脫敏過程及與健康狀態下免疫耐受的差別值得深究[4,141]；最后，OIT聯合療法是近年來出現的新熱點，例如OIT結合使用奧馬珠單抗或益生菌在部分研究中發現有理想的脫敏效果，但是其療效和安全性有待進一步確定[142-143]。

3.3 消減食物致敏原的新型加工技術

食品在加工過程中會經歷一系列物理、化學和生物學變化，引起包括蛋白質在內的各種成分發生改變。這一過程中，致敏原結構的變化可能引起表位的改變，原有的表位被破壞/掩蓋致敏性降低或者形成新的表位致敏性增強[144-145]。近年來，使用新型加工技術消減致敏原制備低敏性食品的研究備受關注。根據原理的不同，可將這些手段分為化學修飾、物理加工和生物處理方法。本文將主要圍繞其中的物理和化學修飾加工技術進行介紹（圖5）。

圖5 消減食物致敏原的新型加工技術及其優劣性Fig. 5 Classification, and pros and cons of novel processing techniques for reducing food allergens

化學修飾方法主要包括蛋白酶酶解、非酶糖基化和交聯酶處理等。其中蛋白酶酶解是最為廣泛使用的致敏原消減手段，利用酶的水解作用斷解肽鏈，破壞致敏原的線性和構象表位，生成的短鏈肽難以再與肥大細胞/嗜堿性粒細胞表面的sIgE發生交聯反應。在傳統酶解工藝的基礎上，研究人員近期發現，靶向酶解致敏原B細胞表位但保留其T細胞表位可能是一種理想的食物脫敏手段。Ueno等通過蛋白酶種類和酶解條件的摸索[146]，發現利用Alcalase在堿性條件下水解αS1-酪蛋白，得到的產物免疫原性被大幅消減，但其抗原性得到了部分保留，可以作為肽類口服免疫療法制劑使用。除蛋白酶酶解外，非酶糖基化也是一種有效的降敏加工方式，其原理是利用還原糖（或其降解產物）與蛋白質自由氨基間發生美拉德反應，通過側鏈接枝和共價交聯，改變致敏原結構、掩蓋致敏原表位[147]。如Fu Linglin等利用核糖、低聚半乳糖和殼寡糖與蝦原肌球蛋白發生美拉德反應，產物的抗原性最高可降低60%，且蛋白質接枝度、二級結構含量和產物的sIgE-結合能力具有一定相關性[148]。此外，谷氨酰胺轉移酶等交聯酶的使用能催化蛋白質發生鏈內/間交聯反應，也可在一定程度上改變蛋白質構象，達到消減致敏原的目的[149]。總體上，以上化學修飾方法具有易操作、成本低和效率高的優勢，但是其缺點也比較突出，例如酶解易產生苦味肽，也易造成蛋白質加工功能的損失，影響食品的感官和質構；糖基化和交聯反應較難控制，生成的有害伴隨產物（如晚期糖基化終末產物）存在潛在安全風險等。

另一方面，物理消減手段近年來逐漸受到研究學者們的重視，常見的如超聲、超高壓、低溫等離子體、輻照、微波和脈沖電場等[150-151]。從原理上看，物理加工方式多是利用某種物理場的作用，誘導蛋白質發生構象變化，進而影響致敏原的表位結構。例如大豆分離蛋白經低溫等離子體處理后，蛋白質與溶液中的活性粒子發生反應，二級結構和構象結構發生改變，經特定條件處理后蛋白的抗原性降低可達75%[152]。關于物理加工手段消減食物致敏原的報道請詳見Ekezie等的匯總[153]。物理加工方法因不涉及化學試劑安全性較高、使用集成化設備也更適合大規模生產，但是由于各種物理場-致敏原相互作用的機制尚未明確，處理過程中“曝露條件-構象變化-致敏性”的構效關系也尚未明晰，上述技術處理后產物的抗原性變化趨勢高低不一；此外，物理加工手段無法破壞蛋白質的線性表位，因而無法完全消除受試食品的致敏性。除了涉及物理場的加工技術外，近年來還出現了一類利用蛋白質-小分子互作構建低敏蛋白的報道，主要是致敏原與多酚間的相互作用，其原理是利用分子間的非共價作用力，如氫鍵、范德華力和疏水相互作用改變體系中致敏原的構象結構，進而影響其抗原性。已報道的“致敏原-多酚”低敏互作物如“花生Ara h 2-綠原酸”[154]、“乳清分離蛋白-茶多酚”[155]和“醇溶蛋白-越橘屬多酚”[156]體系等。

總之，食品加工是通過改變蛋白質結構（一級或構象結構）改變致敏原表位（表位結構或可及性），進而影響其抗原性的。不同的加工手段對致敏原造成的影響各異，作用的對象和機理也各不相同，需要根據處理對象和應用需求有針對性的選擇。另外，值得指出的是，目前有關各類加工技術，尤其是物理手段對致敏原免疫活性的影響研究較為初步，在不同處理過程中涉及的具體抗原表位和關鍵信息需要得到解析。

3.4 基于腸道菌群調控的食物過敏調控手段

近年來，越來越多的證據表明，腸道菌群可以通過與宿主黏膜免疫系統的復雜相互作用調節機體免疫。益生菌作為一類對宿主有益的活性微生物，經口服等方式攝入后，定植于人體腸道，改善機體微生態平衡和腸道菌群結構，具有治療和預防過敏性疾病的作用。目前有關益生菌緩解過敏的研究，多數關注于乳桿菌屬（Lactobacillusspp.）和雙歧桿菌屬（Bifidobacteriumspp.）[157]，并且主要集中在濕疹和哮喘兩類過敏性疾病，少數有涉及食物過敏人群的干預實驗[158]。Kuitunen等對891 名新生兒進行了長達5 年的隨訪，發現混合益生菌干預（含乳酸桿菌、雙歧桿菌和丙酸桿菌）在全隊列中沒有預防濕疹等過敏性疾病的效果，但在剖腹產嬰兒中可顯著降低IgE介導的濕疹和食物過敏反應的累積發病率[159]。另一項采用短雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌發酵的牛乳干預高風險兒童的研究發現（n＝129），干預1 年后幼兒牛乳過敏的發病率雖然沒有顯著變化，但是SPT的陽性率和發生呼吸道和消化道不適癥狀的幾率有所降低[160]。Tan-Lim等通過分析9 項利用益生菌干預牛乳過敏兒童（n＝895）的隨機對照實驗發現，食用益生菌可能起到緩解過敏性濕疹癥狀的作用，但是無法確定對口服耐受是否有影響，并且由于各項研究結果的異質性較高，該項Meta分析的結論有待進一步確認[161]。

益生菌調節黏膜免疫系統的機制主要涉及腸道黏膜屏障的修復、微生態結構的改變、調節性T細胞和輔助性T細胞平衡的調節、免疫細胞功能及表型的調控、sIgE抗體的類別轉換等[157,162-163]（圖6）。如Fu Linglin、趙淑淑等對蝦原肌球蛋白過敏的小鼠模型進行經口灌胃乳酸菌或雙歧桿菌處理，發現益生菌干預可在不同程度上緩解小鼠的過敏癥狀，改善腸道屏障狀態，降低血清中sIgE的水平等，其機制可能是通過誘導Treg細胞的形成抑制Th0細胞向Th2方向分化傾斜，達到將特異性抗體同型向耐受模式轉換的目的[164-167]。類似地，在對花生過敏的小鼠模型中，飼喂混合益生菌制劑VSL#3可誘導小腸上皮細胞產生TGF-β，調節FOXP3＋Treg細胞的產生，抑制Th2型細胞因子的釋放和炎癥反應，緩解食物過敏[168]。Schiavi等也發現VSL#3能夠減輕小鼠模型中對蝦原肌球蛋白引起的全身和局部性過敏反應[169]。盡管現有研究針對益生菌緩解食物過敏的機制進行了探索，但是有關益生菌調控腸黏膜免疫的機理還有許多問題沒有解決。例如，以上提及的理論似乎無法解釋不同益生菌菌株在作用效果上的差異，也無法說明不同體質人群攝入益生菌后緩解程度各異的原因。一方面，益生菌可能直接作用于免疫系統調節DCs的活性和T細胞類群的分化趨向發揮作用；另一方面，益生菌介導的腸道共生菌及其代謝物的改變，特別是短鏈脂肪酸（如乙酸鹽、丙酸、丁酸及其鹽類）含量的變化，在維持腸道固有層中FOXP3＋Treg細胞的比例和調節免疫應答等方面也有重要作用。針對“膳食成分-腸道微環境-宿主免疫”之間的復雜網絡關系還有許多問題尚未得到解答。

圖6 益生菌緩解食物過敏的潛在機制[157]Fig. 6 Potential mechanisms of probiotics in the regulation of allergic responses[157]

3.5 食物過敏標識的風險評估

食物致敏原是造成食物過敏風險的主要不可控因素，實施致敏原風險評估與管理對于保護食物過敏患者的權益和健康至關重要。簡要來說，致敏原風險評估的目的在于明確食品中有意加入和無意帶入的致敏原導致過敏患者發生不良反應的風險；而致敏原風險管理則是通過相關法律法規的制定、食物致敏原的標識與標準化以及污染食物的確證與控制等措施實現的[170]。標準化的風險評估流程分為4 個步驟，即危害識別、危害特征描述、暴露評估和風險特征描述[171]。危害識別指的是包含致敏原的食物，如前述的八大類以及各地區的其他常見致敏食物（基于流行病學調查確定）；危害特征描述，即需要確定人群的致敏閾值，這是風險評估的重要參考數據。其中比較公認的是由澳大利亞和新西蘭過敏原管理局制定的自愿附帶微量致敏原標簽體系（voluntary incidental trace allergen labeling，VITAL）。該體系是由專家組成員通過分析高質量的已發表文獻、未發表的臨床數據和FARRP開展的研究，經統計學建模后得出主要易致敏食物的劑量-反應效應，最后基于ED01（eliciting dose 01）（每100 位過敏患者中會有1 人發生過敏反應，即保護99%的消費者，下同）或ED05原則提出的參考劑量[172-173]。VITAL體系在2007年被首次提出，現已升級至3.0版本，其中不僅涵蓋了更新的致敏閾值清單，還包括風險審查等系列指導意見[174]。暴露評估是風險評估的第三階段，通過排查市售常見致敏食物及其加工產品中致敏原的含量，結合問卷調查中居民膳食的相關數據，明確易過敏人群可能攝入的各類致敏食物的劑量，并據此建立概率評估模型。最后，風險特征描述則是基于以上三部分的結果進行總結評估，為過敏食物標識清單等管理措施提供參考依據。

在我國，由于受到流行病學數據、致敏閾值和暴露評估數據的限制，食物過敏標識的風險評估還處在初步研究階段。不過相信，隨著我國普通人群流行病學數據的不斷補充、食物過敏臨床診斷的日益深入，以及食物致敏原評價和確證技術的逐漸改進，符合我國國情的食物致敏原標識與風險管理將逐步得到完善。

3.6 國內外低/無敏食品及產業展望

目前，國內外有關低敏或無敏食品的開發研究中，技術成熟且已實現產業化發展的主要有無麩食品和嬰幼兒食品兩類。其中，無麩食品是指不含麩質的食品，適用于乳糜瀉及麩質過敏患者，同時也被推薦給運動員和患有橋本病和自閉癥的人群食用。麩質，又稱谷蛋白，是一類存在于小麥、黑麥和大麥中的儲藏蛋白，主要由麥谷蛋白和麥醇溶蛋白組成，是小麥及其制品中的主要致敏原。天然存在的可用于制作無麩食品的原料主要來自于特定谷物、假谷和豆類，如大米、小米、玉米、木薯、蕎麥、藜麥和羽扇豆等[175-176]，此外也可添加蔬菜，如南瓜、胡蘿卜和菠菜等[177]。無麩食品在西方國家的普及度較高，但不同地區的標準有所差異，如美國FDA規定生產企業在其食品所含麩質低于20 mg/kg的情況下可標注“無麩質”（“gluten-free”或“no gluten”），歐盟（Commission Regulation (EC) No. 41/2009）、加拿大、阿根廷和國際食品法典委員會標準（Codex Standard 118-1979）對“無麩質”的限量要求與FDA相同，但澳大利亞和新西蘭（Australia New Zealand Food Standards Code-Standard 1.2.8）的規定更為嚴格，要求“無麩質”標簽產品“不得檢出”麩質，即含量低于已知方法的最低檢出限7 mg/kg。目前，我國尚未出臺有關“無麩質”的食品標準，但已有幾項關于麩質致敏原檢測的標準相繼發布（SN/T 1961.11—2013《出口食品過敏原成分檢測 第11部分：實時熒光PCR方法檢測麩質成分》和SN/T 4286—2015《出口預包裝食品麩質致敏原成分風險控制及檢驗指南》）。

據統計，乳糜瀉在歐美白種人中的發病率約為1%甚至更高，且在1990—2010年間呈逐年上升趨勢[178-179]；我國人群中乳糜瀉的發病率尚不明確，但部分省份16～25 歲群體血清學篩查的陽性率高達2%[180]，考慮到我國尤其是北方地區人群的基因易感性較高，且麩質過敏癥狀較為“隱性”不易察覺，我國人群中麩質過敏的暴露風險不容小覷[181-182]。除麩質過敏患者外，追求無麩質飲食的健康人群也在不斷擴張，這使得全球范圍內的無麩質食品產業迅速增長。據權威統計機構Statista公布的數據，2020年全球無麩質食品的銷售額約為56億 美元，2025年預計增長達到83億 美元[183]。目前，無麩飲食作為一種新興的飲食理念受到許多商家和消費者的推崇，但是與含麩食品相比，無麩食品在營養價值和感官品質上存在一定缺陷：首先，無麩食品一般抗性淀粉和膳食纖維含量偏低，且易存在VB、VD和鐵、鋅等礦物質的缺乏，加工后的無麩食品也可能含有較高的油脂、飽和脂肪酸和鹽[184-185]。如Allen等[185]通過調研英國零售市場上常見的無麩面包信息，發現僅有5%的產品按照要求進行了4 種營養素（鈣、鐵、煙酸和硫胺素）的強化，而28%的產品僅對鈣和鐵進行了強化。其次，由于不含面筋蛋白，無麩原料制成的面團在黏度、彈性、保水性和吸水率等物性特征上并不理想，導致最終產品在感官特性上存在不足[175]。如何開發出更加營養健康、安全美味的無麩食品是未來研發的主要方向：一方面，需要綜合關注無麩食品配方的營養素含量，對缺乏或過量的宏/微量營養成分進行補充和改良；另一方面，外源添加功能性成分（如多糖和蛋白膠體），同時控制好粉料性質、面團制作和發酵工藝，也是提高無麩質食品品質的有效手段[186]。

近年來，低敏/無敏嬰幼兒食品產業一直穩步發展，主要包括嬰幼兒配方奶粉和營養米粉等輔食。牛乳過敏是嬰幼兒最常見的食物過敏種類，低敏/無敏配方奶粉是通過將牛乳蛋白部分或全部水解為小分子肽段和氨基酸，破壞天然牛乳蛋白的表位結構，大大降低其致敏性。市面上常見的低敏嬰幼兒配方奶粉主要包括游離氨基酸型、深度水解型和部分水解型，也有采用（酶解）大豆蛋白替代乳清粉或全部乳粉的類型，但需注意這些產品可能在部分牛乳過敏兒童中發生免疫交叉[187-188]。此外，主打“低敏”概念的營養米粉等輔食則是通過使用不易過敏的食品原料進行生產，因此制得的產品致敏風險較低。

除了以上提及的兩類食品外，其他種類的低敏/無敏食品大多處于初步研究階段，離產業化發展還有一段距離，但是相信，隨著未來國內和國際食品市場的不斷細分和行業內對食物過敏問題的日益重視，專門為不同食物過敏患者和易感群體設計的低敏和無敏食品將會不斷涌現出來。

4 結 語

當前，食物過敏的發病率逐年攀升，這給社會、家庭及個人帶來了嚴重負擔。現代飲食習慣和生活方式的改變正潛移默化地影響著人群對過敏性疾病的易感性，同時，食品工業的快速發展，涉及的原料和產品日益增多，飲食規避對于食物過敏患者也將越來越困難。食物過敏已經成為食品行業必須面對和解決的食品安全問題。一方面，為了更好地了解我國食物過敏人群的特點，亟需開展針對全年齡段普通人群的流行病學調查，利用遺傳學、表觀遺傳學、微生物學和多組學技術，聯合生物信息學手段，系統研究可能誘發食物過敏的風險因素和免疫學機制；另一方面，為了進一步保障易感人群的健康和生活質量，相關人員應繼續探索各類致敏原的高效分析手段，建立體內外評價方式，開發靶向消減技術，并積極推進低敏/無敏食品產業的發展等等。此外，考慮到腸道菌群失調與食物過敏的密切關聯，有關腸道微生物調節食物過敏的機制，以及利用益生菌或益生元緩解食物過敏的功效研究也需進一步的探索、驗證與實踐。