抗菌肽BCp12對大腸桿菌壁膜及DNA損傷的作用機(jī)制

楊 昆，王 歡，高 潔，李鈺芳，趙 瓊，施婭楠，黃艾祥

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

大腸桿菌（Escherichia coli）是人和多數(shù)動物體內(nèi)常見的腸道共生革蘭氏陰性菌[1]，并且廣泛存在于動植物產(chǎn)品中[2-3]，肉制品在加工過程中極易受到大腸桿菌污染，從而引發(fā)食源性疾病[4]。因此，有效抑制動植物產(chǎn)品中的大腸桿菌的增殖生長，對提高食品的安全性顯得尤為重要。

抗菌肽是一類天然的具有抗細(xì)菌或真菌作用的活性肽，作為新型天然食品防腐劑而備受關(guān)注[5]。作為天然來源的抗菌肽，與傳統(tǒng)的抗菌劑相比，其在發(fā)揮抑菌作用的同時不易產(chǎn)生耐藥性，因此其抑菌機(jī)理已成為廣大學(xué)者的研究熱點(diǎn)[6]。抗菌肽BCp12是本課題組從檳郎江水牛酪蛋白中分離出的新型抗菌肽，一級結(jié)構(gòu)為YLGYLEQLLRLK，分子質(zhì)量為1 508.82 Da，屬于熱穩(wěn)定性高的疏水性陽離子抗菌肽，且對大腸桿菌具有良好的抑菌效果[7]。謝海偉等[8]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽首先作用于細(xì)胞膜，隨著作用時間和濃度效應(yīng)變化，細(xì)胞膜通透性增加，胞膜裂解，這表明細(xì)胞膜是其首要和重要作用靶點(diǎn)。王梓源等[9]研究發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸能夠增強(qiáng)大腸桿菌細(xì)胞表面疏水性及細(xì)胞內(nèi)、外膜的通透性，并且改變菌體細(xì)胞膜內(nèi)外電勢，使其細(xì)胞內(nèi)容物如核酸、蛋白質(zhì)等大量滲出，從而實(shí)現(xiàn)對菌體的殺菌作用。陳旋等[10]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽P7能特異性地結(jié)合rnhA序列，引起大腸桿菌DNA的損傷，并抑制大腸桿菌的DNA復(fù)制。

目前，抗菌肽BCp12的研究主要集中在純化、鑒定及性質(zhì)方面，并沒有對其抑菌機(jī)制進(jìn)行研究。因此，本實(shí)驗(yàn)從抗菌肽BCp12對大腸桿菌的生長繁殖、壁膜損傷機(jī)制及DNA的影響3 個方面來揭示BCp12對大腸桿菌壁膜及DNA的損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種與試劑

抗菌肽BCp12是用本課題組自主研發(fā)的貫筋藤蛋白酶對檳榔江水牛酪蛋白進(jìn)行酶解，利用活體大腸桿菌親和吸附法聯(lián)合反相高效液相色譜（reverse phase highperformance liquid chromatograph，RP-HPLC）技術(shù)從酶解液中靶向分離得到的，利用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）預(yù)測分析酪蛋白的功能活性，發(fā)現(xiàn)該序列來源于牛αS1-酪蛋白，屬于新抗菌肽，由安徽國平藥業(yè)有限公司合成，純度為95%以上。

大腸埃希氏菌CICC10003 中國工業(yè)菌種保藏中心。

正十六烷 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；溴化乙錠（ethidium bromide，EB） 山東西亞化學(xué)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊寶生物科技有限公司；0.02 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS） 賽國生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy HI全波長熒光酶標(biāo)儀 美國Biotek公司；GR85DA高壓滅菌鍋 美國Zealway公司；DW-HL388－86 ℃冰箱 中科美菱低溫科技有限公司；UV-6100紫外-可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZQZY-85CS振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；NEXUS 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司；FlexSEM1000 HITACHI落地式掃描電子顯微鏡 日本日立公司；JEM-1200EX透射電子顯微鏡 日本JEOL公司；Gel-Doc XRS免疫電泳成像系統(tǒng) 美國Bio-Red科技公司。

1.3 方法

1.3.1 BCp12對大腸桿菌生長繁殖影響的測定

1.3.1.1 最小抑菌濃度及抑菌曲線的測定

參照文獻(xiàn)[11]的研究方法，取對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液，用0.02 mol/L pH 7.4 PBS稀釋至106CFU/mL，使用96 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每孔加入190 μL新鮮Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基、10 μL菌液和50 μL抗菌肽BCp12溶液，BCp12的終質(zhì)量濃度分別為0、1、1.6、2、3.2 mg/mL。以等體積無菌水為空白對照組，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，用酶標(biāo)儀測定OD600nm。能完全抑制病原菌生長的最低質(zhì)量濃度作為最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。然后，參照Cirioni等[12]的研究方法，測定不同質(zhì)量濃度的BCp12對大腸桿菌的抑菌效果。每小時測一次OD600nm，測7 次并計算出平均值，以時間為橫坐標(biāo)、OD600nm為縱坐標(biāo)，繪制抑菌曲線。

1.3.1.2 大腸桿菌生長曲線的測定

參照孟兆麗[13]的研究方法，并稍作修改。取對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液，用0.02 mol/L pH 7.4 PBS稀釋至106CFU/mL，實(shí)驗(yàn)組加入等體積BCp12溶液并使其終質(zhì)量濃度為MIC，空白對照組和四環(huán)素對照組分別加入等體積的無菌水和四環(huán)素溶液（2 mg/mL）代替BCp12溶液。37 ℃、120 r/min連續(xù)培養(yǎng)24 h，每2 h取樣1 次，用酶標(biāo)儀測定OD600nm，每個時間點(diǎn)重復(fù)3 次，取平均值繪制生長曲線。

1.3.2 BCp12對大腸桿菌壁膜損傷的機(jī)制研究

1.3.2.1 菌體細(xì)胞壁表面疏水性分析

參照文獻(xiàn)[14]的方法，取對數(shù)生長期的大腸桿菌菌液，10 000 r/min離心2 min，收集菌體沉淀，加入等體積PBS將菌體沉淀重懸，10 000 r/min離心2 min，收集菌體沉淀加入等體積的0.02 mol/L pH 7.4 PBS，重復(fù)上述離心洗滌操作，洗滌3 次后，將菌體沉淀重懸于0.1 mol/L的KNO3溶液，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL備用，并測定該菌懸液于405 nm處的光密度，記為OD0。然后取1.2 mL菌懸液，加入200 μL的一定質(zhì)量濃度的BCp12溶液，使其終質(zhì)量濃度為MIC；KNO3組加入200 μL 0.1 mol/L KNO3溶液；正十六烷組加入200 μL正十六烷分別于室溫孵育10 min，漩渦振蕩2 min，使各溶液充分的混合，靜置15 min后，快速吸取上清液置于96 孔板中，每組重復(fù)3 次，測定405 nm處的光密度（OD405nm）。菌體壁膜表面疏水性與吸附率相關(guān)，因此可用大腸桿菌吸附率來反應(yīng)菌體壁膜表面疏水性的變化，大腸桿菌吸附率按下式進(jìn)行計算。

1.3.2.2 菌體細(xì)胞膜通透性的測定

參照Al-Adham等[15]的研究方法，取1.3.2.1節(jié)用PBS洗滌3 次的菌體沉淀，用PBS重懸得到1.0×106CFU/mL的大腸桿菌菌懸液，并加入等體積BCp12溶液，使BCp12終質(zhì)量濃度分別為MIC、1/2 MIC，對照組添加等體積的無菌水，于37 ℃恒溫孵育一定時間，分別在培養(yǎng)的2、4 h取樣，10 000 r/min離心2 min，取上清液于260 nm和280 nm測定其光密度，分別用于檢測胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的泄漏情況。

1.3.2.3 流式細(xì)胞儀分析菌體細(xì)胞膜的完整性

參照文獻(xiàn)[16]并稍作修改。取1.3.2.1節(jié)用PBS洗滌3 次的菌體沉淀，用PBS重懸得到1.0×106CFU/mL的大腸桿菌菌懸液，并加入等體積BCp12溶液，使BCp12終質(zhì)量濃度為MIC，對照組添加等體積的無菌水。均勻混合后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，孵育結(jié)束后，用PBS洗滌菌體沉淀3 次，以終止抗菌肽繼續(xù)發(fā)揮作用。上機(jī)前加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液，用流式細(xì)胞儀分析PI著染陽性細(xì)菌數(shù)[17]并分析菌體細(xì)胞膜的完整性。

1.3.2.4 BCp12對菌體壁膜組分的影響

參照文獻(xiàn)[18]并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。取1.3.2.1節(jié)用PBS洗滌3 次的菌體沉淀，用PBS重懸得到1.0×106CFU/mL的大腸桿菌菌懸液，并加入等體積BCp12溶液，使BCp12終質(zhì)量濃度分別為MIC、1/2 MIC，對照組添加等體積的無菌水。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)一定時間后，取10 μL于透明光學(xué)晶片（KBr）上，立即置于裝有硅膠的減壓干燥器中，將其干燥成透明的膜狀物。按中華人民共和國藥典的方法校準(zhǔn)儀器。取出空白KBr晶片，立即置于樣品窗口中，測定吸收后紅外光譜圖，用于矯正空白。測量參數(shù)：分辨率4 cm－1、掃描次數(shù)32 次、掃描范圍400～4 000 cm－1。用同樣方法和參數(shù)測定載有透明膜狀物的KBr晶片[19]。

1.3.2.5 對菌體壁膜超微結(jié)構(gòu)的觀察

取1.3.2.1節(jié)用PBS洗滌3 次的菌體沉淀，用新鮮LB培養(yǎng)基重懸為1.0×106CFU/mL菌懸液，加入BCp12使其終質(zhì)量濃度為MIC，對照組添加無菌水，對照組于37 ℃培養(yǎng)5 h、BCp12處理后于37 ℃培養(yǎng)5、10、15 h時分別取樣，在10 000 r/min下離心5 min，加入等體積PBS按照1.3.2.1節(jié)方法洗滌3 次，收集菌體沉淀。向菌體沉淀中加體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液固定12 h，將固定好的菌體于室溫10 000 r/min離心2 min，除去固定液，PBS洗滌3 次后得到菌體沉淀。依次用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液梯度脫水，每次脫水時間為10 min，其中100%乙醇脫水2 次，并用100%乙醇重懸。最后，吸取一定量的重懸液在載樣臺上烘干，并進(jìn)行鍍金，上樣，用掃描電子顯微鏡觀察[20]。

菌液處理同上，于37 ℃培養(yǎng)10、12 h時分別取樣。參考文獻(xiàn)[21]，取PBS洗滌3 次后的菌體沉淀，加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%戊二醛溶液固定12 h；然后，離心收集菌體，用PBS沖洗，并加入體積分?jǐn)?shù)為1%鋨酸溶液固定2～4 h；接著用不同梯度濃度的乙醇脫水，并將菌體沉淀用包埋劑進(jìn)行處理，72 h后對包埋樣品進(jìn)行超薄切片、染色；最后，用透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照[21]。

1.3.3 BCp12對大腸桿菌DNA影響的分析

1.3.3.1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析BCp12與菌體DNA的結(jié)合情況

參照Bandyopadhyay等[22]的研究方法，將大腸桿菌接種至無菌的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床培養(yǎng)，直至對數(shù)生長期，然后通過麥?zhǔn)媳葷岱ù_定原菌液的濃度，取1.3.2.1節(jié)用PBS洗滌3 次的菌體沉淀，用PBS重懸得到1.0×106CFU/mL的大腸桿菌菌懸液1 mL，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。所獲得的DNA溶液用紫外分光計檢測其核酸濃度和純度，測定OD260nm和OD280nm。所提取的細(xì)菌基因組DNA純度均達(dá)到實(shí)驗(yàn)的要求：1.7≤OD260nm/OD280nm≤1.9。取5.0 μL基因組DNA溶液與不同質(zhì)量濃度（0、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL）的抗菌肽等體積混合，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中作用30 min。反應(yīng)結(jié)束后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠跑電泳，觀察和分析基因組DNA的遷移結(jié)果。

1.3.3.2 熒光光譜實(shí)驗(yàn)分析BCp12與菌體DNA的作用方式

參照文獻(xiàn)[23]和文獻(xiàn)[24]，用1×TE緩沖液將菌體DNA稀釋為50 μg/mL，然后，在96 孔板的每個孔中加入5 μL的DNA溶液和10 μL 100 μg/mL的EB溶液，混勻后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中，避光孵育10 min。接著加入50 μL不同質(zhì)量濃度（0、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL）的BCp12溶液，對照組用50 μL超純水代替，混勻后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，用多功能酶標(biāo)儀測定樣品在激發(fā)波長535 nm及發(fā)射波長550～750 nm范圍內(nèi)的熒光光譜。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 19 軟件與GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Duncan法進(jìn)行顯著差異性比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BCp12對大腸桿菌生長繁殖的影響

2.1.1 BCp12對大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量濃度及抑菌曲線

如圖1A所示，BCp12質(zhì)量濃度越高，OD600nm越小，表示對大腸桿菌的抑菌效果越強(qiáng)。當(dāng)BCp12的終質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，幾乎完全抑制了菌體的生長，由此確定BCp12的MIC為2 mg/mL。由圖1B可知，BCp12的抑菌菌效果與抗菌肽的質(zhì)量濃度成正比關(guān)系。與空白對照組（添加無菌水）相比，添加BCp12的菌液，其生長繁殖受到了不同程度的抑制。當(dāng)BCp12終質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL及以上時，其菌體生長被明顯抑制。

圖1 BCp12對大腸桿菌的MIC（A）和抑菌曲線（B）Fig. 1 Minimum inhibitory concentration (A) and time courses (B) of anti E. coli effect of BCp12 at different concentrations

2.1.2 對菌體生長曲線的影響

如圖2所示，BCp12對菌體的生長具有明顯的抑制作用。在0～14 h期間，空白對照組的菌體生長繁殖速度快，14 h之后趨于平緩，菌體的生長進(jìn)入相對穩(wěn)定的時期。添加BCp12的菌液，菌體在0～14 h生長速率也比較快，14 h以后呈現(xiàn)快速下降的趨勢，直至最終趨于穩(wěn)定，但與空白對照組相比，菌體總量明顯降低。添加四環(huán)素的菌液，菌體生長被明顯抑制。通過對3 組的對比，可以看出BCp12有良好的抑菌效果。

圖2 BCp12對大腸桿菌生長曲線的影響Fig. 2 Effect of BCp12 on the growth curve of E. coli

2.2 BCp12對大腸桿菌壁膜損傷的機(jī)制

2.2.1 對菌體細(xì)胞壁表面疏水性的影響

從圖3可見，BCp12能夠明顯降低菌體細(xì)胞壁的表面疏水性。BCp12處理1 h后大腸桿菌吸附率為79.8%，顯著低于相同作用時間的正十六烷組（84.3%）；作用5 h時，正十六烷組和BCp12處理組大腸桿菌吸附率分別為79.95%和64.73%，BCp12處理組大腸桿菌吸附率表現(xiàn)出顯著低于相同時間的其他組（P＜0.05）。相同作用時間下，正十六烷組大腸桿菌吸附率顯著低于KNO3組（P＜0.05）。孫宜君[25]在螺旋藻抗菌肽的純化鑒定及其抑菌機(jī)理的研究中提到，正十六烷是一種有機(jī)相，大腸桿菌在水相和有機(jī)相中的吸附率是不同的，因此，細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性可由吸附率的大小來反映。另外，阿琪瑪[14]對于疏水性的理解為細(xì)菌對于有機(jī)溶劑的吸附效果，疏水性越大則代表對有機(jī)溶劑的黏附效果越強(qiáng)。

圖3 BCp12對大腸桿菌細(xì)胞壁表面疏水性的影響Fig. 3 Effect of BCp12 on the surface hydrophobicity of E. coli cell wall

綜上所述，BCp12可以引起大腸桿菌細(xì)胞親水性增加。這是因?yàn)锽Cp12是陽離子抗菌肽，可與菌體細(xì)胞表面帶負(fù)電的脂多糖結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞表面疏水性降低，最終起到破壞細(xì)胞壁膜的作用。郭文杰等[26]的研究結(jié)果也表明，細(xì)胞表面疏水性降低可能是因?yàn)榭咕呐c菌體細(xì)胞表面相互作用，吸引電負(fù)性基團(tuán)造成重排，從而導(dǎo)致菌體細(xì)胞表面電負(fù)性增強(qiáng)，疏水性下降。

2.2.2 對菌體細(xì)胞膜通透性的影響

如圖4所示，正常條件下，培養(yǎng)液中的核酸和蛋白質(zhì)基本穩(wěn)定在較低的水平。與對照組（添加無菌水）相比，菌體在1/2 MIC和MIC的BCp12下作用2 h，培養(yǎng)液中的核酸含量無顯著變化（P＞0.05），蛋白質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05）。作用4 h后，培養(yǎng)液中的核酸及蛋白含量均顯著增加（P＜0.05）。

圖4 BCp12對大腸桿菌細(xì)胞膜通透性的影響Fig. 4 Effect of BCp12 on cell membrane permeability in E. coli

Bajpai等[27]研究表明，核酸作為細(xì)胞內(nèi)重要的大分子物質(zhì)，當(dāng)菌體細(xì)胞完整性受到破壞時，正常狀態(tài)下不能透過細(xì)胞膜的大分子物質(zhì)（核酸）通過“蛋白孔道”釋放出胞外，泄漏到菌懸液中，由于核酸在260 nm處有強(qiáng)吸收，所以可通過檢測菌懸液中核酸泄漏（260 nm處吸光度）的變化來評價細(xì)胞膜是否完整。Long Men等[28]的研究表明，核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子貫穿于整個細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)之中，是細(xì)胞的重要組成結(jié)構(gòu)，大腸桿菌細(xì)胞膜被破壞時，核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)就會泄漏到胞外。另外，抗菌肽也能通過改變細(xì)胞膜的通透性使細(xì)胞死亡[29]。

因此，通過測定菌懸液在260、280 nm處吸光度的變化，可分析細(xì)胞壁膜的受損情況。上述結(jié)果表明：大腸桿菌胞內(nèi)核酸及蛋白質(zhì)的泄漏量與BCp12的質(zhì)量濃度、作用時間呈正比關(guān)系；BCp12通過破壞大腸桿菌細(xì)胞膜的完整性，致使其通透性增加，引起胞內(nèi)核酸及蛋白質(zhì)的滲漏，從而達(dá)到抑制菌體增殖的目的。

2.2.3 流式細(xì)胞儀分析菌體細(xì)胞膜的完整性

如圖5所示，M1和M8表示收集的50 000 個大腸桿菌細(xì)胞中完整細(xì)胞所占的百分比。由圖5A可知，未經(jīng)BCp12處理的菌液在培養(yǎng)6 h后，細(xì)胞膜的損傷率幾乎為0。由圖5B可知，經(jīng)過MIC BCp12處理的菌液，在培養(yǎng)6 h后，細(xì)胞膜的損傷率為25.1%，兩者相比差異較大。

圖5 BCp12對大腸桿菌細(xì)胞膜完整性的影響Fig. 5 Effect of BCp12 on cell membrane integrity in E. coli

研究表明，PI是一種可對DNA染色的核染色試劑，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整時，PI染料無法進(jìn)入細(xì)胞，但當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜完整性遭到破壞后，該染料可穿過破損的細(xì)胞膜而對核酸染色，流式細(xì)胞儀檢測其為紅色熒光，PI熒光信號強(qiáng)弱能夠反映細(xì)胞膜完整性破壞程度[30]。由此可知，經(jīng)BCp12處理后，菌體的細(xì)胞膜發(fā)生損傷，即細(xì)胞膜不完整，通透性增強(qiáng)。

2.2.4 BCp12對菌體細(xì)胞壁膜組分的影響

傅里葉變換紅外光譜技術(shù)可用來分析微生物細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)膜的組成成分，通常可分為5 個區(qū)域來描述不同的細(xì)胞成分信息[18]：1）3 000～2 800 cm－1：脂肪酸信息區(qū)；2）18 00～1 500 cm－1：蛋白和多肽酰胺信息區(qū)；3）1 500～1 200 cm－1：混合信息區(qū)域（蛋白質(zhì)和脂肪酸）；4）1 200～900 cm－1：細(xì)胞壁多糖的信息區(qū)；5）900～500 cm－1：指紋信息區(qū)。如圖6所示，與對照組相比，BCp12在以上5 個區(qū)間的吸收峰強(qiáng)度出現(xiàn)明顯變化，這表明BCp12對大腸桿菌菌體的脂肪酸、蛋白和多肽酰胺、多糖、指紋信息區(qū)都有影響。另外，不同質(zhì)量濃度的BCp12對大腸桿菌壁膜組分的影響，如MIC處理的菌體在3 600～2 500 cm－1區(qū)間的其吸收峰強(qiáng)度明顯高于1/2 MIC處理組。

圖6 BCp12對大腸桿菌細(xì)胞壁膜組分的影響Fig. 6 Effect of BCp12 on main components of the cell wall and membrane of E. coli

綜上所述，抗菌肽BCp12可以影響大腸桿菌細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)上的組分，與文獻(xiàn)[31]和文獻(xiàn)[19]報道的結(jié)果相似，也驗(yàn)證了前述BCp12對大腸桿菌細(xì)胞壁膜的損傷作用。

2.2.5 對菌體壁膜超微結(jié)構(gòu)的影響

如圖7A所示，未經(jīng)BCp12處理過的菌體，其細(xì)胞表面圓潤光滑，飽滿。而經(jīng)BCp12處理5 h的菌體，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，變得粗糙皺縮，無飽滿感，少部分細(xì)胞具有完整性（圖7B）。作用10 h，部分細(xì)胞發(fā)生自溶，甚至黏連在一起（圖7C）。作用15 h，菌體細(xì)胞大部分自溶，只有少數(shù)的幾個細(xì)胞保持桿狀形態(tài)（圖7D）。

圖7 掃描電子顯微鏡觀察抗菌肽BCp12對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 7 Effect of the antimicrobial peptide BCp12 on the ultrastructure of E. coli observed by SEM

張子越[32]在水煎液體外抑制大腸桿菌和痢疾桿菌的作用機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，對照組的菌體形態(tài)正常飽滿，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，經(jīng)1/2 MIC藥物作用6 h后，與對照組相比，有些菌體形態(tài)開始變得不規(guī)則，菌體變長，有的菌體皺縮變圓發(fā)生死亡。Matsuzaki[33]、Sebe[34]等關(guān)于抗菌肽作用機(jī)制的研究報道也證明了這一結(jié)論。由此確定，BCp12主要通過破壞菌體的細(xì)胞壁膜，致使胞內(nèi)物質(zhì)流出來，引起壁膜發(fā)生皺縮，變得凹凸不平，產(chǎn)生自溶現(xiàn)象，進(jìn)而達(dá)到抑制菌體生長的效果。

如圖8所示，用無菌水處理的大腸桿菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)光滑完整，無破損，細(xì)胞內(nèi)容物充實(shí)致密（圖8A、C）。與對照組相比，MIC BCp12作用菌體10 h，菌體細(xì)胞膜有明顯的孔洞、撕裂及受傷情況，且胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)生泄漏（圖8B）；作用菌體12 h，部分細(xì)胞壁膜、細(xì)胞器和細(xì)胞核區(qū)消失，甚至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空化現(xiàn)象（圖8D）。石偉[35]通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，蜂毒肽melittin作用于水稻白葉枯病菌細(xì)胞膜后，細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，內(nèi)容物被完全釋放出來，且呈囊泡狀結(jié)構(gòu)。這與本研究結(jié)果相似，也證實(shí)了BCp12能夠破壞菌體的細(xì)胞膜，且使菌體細(xì)胞器消失，進(jìn)而出現(xiàn)空化現(xiàn)象，以達(dá)到抑制菌體生長繁殖的作用。

圖8 透射電子顯微鏡觀察抗菌肽BCp12對大腸桿菌超微結(jié)構(gòu)的變化Fig. 8 Effect of the antimicrobial peptide BCp12 on the ultrastructure of E. coli observed by TEM

2.3 BCp12對大腸桿菌DNA的影響

2.3.1 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)分析BCp12與菌體DNA的結(jié)合情況如圖9所示，BCp12可以與EB競爭性結(jié)合大腸桿菌的DNA，且使DNA在泳道中出現(xiàn)拖尾和偏移。當(dāng)BCp12的終質(zhì)量濃度在0～2.5 mg/mL時，BCp12與大腸桿菌DNA出現(xiàn)一定程度的結(jié)合，泳道中出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，同時有部分DNA被阻滯在凝膠孔中。當(dāng)BCp12質(zhì)量濃度為5 mg/mL時，DNA的遷移幾乎完全受阻，無法看到DNA的遷移條帶。謝海偉等[8]的研究表明，抗菌肽在較低質(zhì)量濃度時結(jié)合到DNA表面，起到阻滯DNA遷移率的作用；高質(zhì)量濃度的抗菌肽通過靜電作用力結(jié)合到DNA雙螺旋表面，競爭并阻礙EB和DNA的結(jié)合，從而在凝膠電泳中未發(fā)現(xiàn)電泳條帶。另外也有研究表明，DNA是最重要的遺傳物質(zhì)之一，DNA的損傷會影響基因的表達(dá)，導(dǎo)致酶和受體蛋白質(zhì)等合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[36]。由此可知，BCp12使菌體DNA在遷移過程中發(fā)生拖尾和偏移，影響DNA的正常復(fù)制，進(jìn)而起到抑制菌體生長繁殖的作用。

圖9 BCp12與菌體DNA結(jié)合的凝膠阻滯分析Fig. 9 Gel retardation analysis of BCp12 binding to bacterial DNA

2.3.2 熒光光譜實(shí)驗(yàn)分析BCp12與菌體DNA的作用方式

如圖10所示，BCp12促進(jìn)DNA-EB復(fù)合物的熒光強(qiáng)度降低，且BCp12的質(zhì)量濃度越高，其下降趨勢越明顯。與對照組相比，添加BCp12的菌液熒光強(qiáng)度明顯降低。研究表明，EB為靈敏度高、選擇性好的熒光探針，其本身的熒光很弱，能夠與雙鏈DNA以兩種方式結(jié)合[37]。EB可以通過靜電作用與雙鏈DNA的磷酸骨架結(jié)合，此時其熒光性質(zhì)不變；但當(dāng)它以較高親和力嵌入DNA的雙鏈內(nèi)部的堿基對之間后使熒光強(qiáng)度大幅度增強(qiáng)，此外，當(dāng)它與能產(chǎn)生相似作用的分子共存時，便相互競爭與DNA的結(jié)合，使EB-DNA復(fù)合體系的熒光發(fā)生變化[38]。劉莎[39]和Li Lirong[40]等也得到了相似的結(jié)論，抗菌肽能夠與EB相互競爭結(jié)合位點(diǎn)，并以嵌入方式結(jié)合DNA。由此可知，BCp12也是以嵌插的方式與EB競爭性地結(jié)合DNA，致使DNA-EB復(fù)合物的熒光強(qiáng)度明顯下降，進(jìn)而影響DNA的正常復(fù)制，使菌體的生長繁殖受到抑制。

圖10 BCp12與EB競爭性結(jié)合菌體DNA的熒光光譜Fig. 10 Fluorescence spectra showing competitive binding of BCp12 and EB to bacterial DNA

3 結(jié) 論

BCp12通過降低大腸桿菌壁膜的表面疏水性，對菌體壁膜脂肪酸、蛋白、多肽酰胺、多糖及指紋信息區(qū)都有明顯影響，致使菌體壁膜損傷，從而引起胞內(nèi)紫外吸收物質(zhì)滲漏，菌體呈現(xiàn)自溶及空化現(xiàn)象，且以嵌插方式與DNA結(jié)合，產(chǎn)生凝膠阻滯現(xiàn)象，影響DNA正常復(fù)制，從而起到抑制菌體增殖的作用。