蜜柚果肉膳食多酚的結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化機(jī)理

李 汀，鄒 波，吳繼軍，徐玉娟，余元善，李 璐，傅曼琴，程麗娜

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510630）

柚（Citrus maxima）原產(chǎn)于中國(guó)，屬于蕓香科柑橘屬，栽培選育品種及野生品種多樣，柚果實(shí)俗稱柚子，富含多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎等作用。膳食多酚是柚子的主要活性成分，以類黃酮研究最多，其中柚果皮中的類黃酮含量顯著高于果肉，現(xiàn)有的研究也主要集中于不同品種柚子果皮中類黃酮的結(jié)構(gòu)鑒定及含量分析。研究表明，不同品種的柚子果皮，類黃酮的組成和含量也不盡相同，如廣西沙田柚等柚子以柚皮苷為主，常山胡柚等柚子以柚皮苷和新橙皮苷為主，而雜交柚果則以蕓香柚皮苷、橙皮苷含量最高[1]。柚果肉中膳食多酚的組成和含量與果皮存在較大的差異。研究發(fā)現(xiàn)，重慶地方名柚成熟果實(shí)中囊衣的類黃酮含量高于汁胞，囊衣中類黃酮以地奧司明含量最高；而汁胞中總酚和酚酸含量較高，以沒(méi)食子酸為主[2]。

近年來(lái)，關(guān)于柚子膳食多酚的研究已有較多的報(bào)道，但對(duì)于以鮮食為主的蜜柚，可食用的果肉研究較少[2]。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，我國(guó)廣東省梅州市已成為全國(guó)重要的柚果商品生產(chǎn)基地，梅州蜜柚果肉質(zhì)量占比達(dá)到70%，酸甜多汁，美味可口[3-4]，已成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一[5]，但其果肉多酚及抗氧化能力鮮有報(bào)道。

本研究采用高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole-time

of-flight mass spectrometry，HPLC-QTOF-MS）對(duì)梅州蜜柚果肉膳食多酚粗提物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)其進(jìn)行定量分析，并在HepG2細(xì)胞體系探討果肉膳食多酚是否通過(guò)激活核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)從而發(fā)揮抗氧化活性。本研究可為梅州蜜柚果肉資源的綜合利用提供數(shù)據(jù)支持，也為蜜柚營(yíng)養(yǎng)、醫(yī)藥和保健價(jià)值的開(kāi)發(fā)研究提供了依據(jù)，具有一定的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梅州蜜柚：采摘于廣東梅州。

甲酸、乙腈（均為色譜純） 德國(guó)Meker公司；香草酸、新西蘭牡荊苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、野漆樹(shù)苷、阿魏酸、甲基橙皮苷 上海源葉生物科技有限公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）、最低必需培養(yǎng)基（minimum essential medium，MEM）、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsin-ethylene diamine tetraacetic acid，Trypsin-EDTA）溶液、雙抗（青霉素10 kU/mL、鏈霉素10 mg/mL）溶液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒 南京建成生物工程研究所；2’,7’-二氯二氟熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate，DCFH-DA）熒光探針 上海博宇生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SCA-165DS型二氧化碳培養(yǎng)箱 日本ASTEC公司；5810R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendrof公司；TS2-S-SM型普通光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司；LightCycler?96型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 瑞士Roche公司；DP73型倒置相差熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；LC-20A HPLC儀 日本島津公司；HPLC-QTOF-MS儀 美國(guó)安捷倫公司和ABSCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 柚果肉膳食多酚分離提取

蜜柚剝皮，去除囊衣和籽后，稱取500 g的柚果肉，打漿，用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液500 g和果漿500 g混合均勻，于超聲功率40 W超聲30 min，提取溫度40 ℃的條件下提取20 min，過(guò)濾，收集濾液，得到的濾渣再與80%乙醇溶液按上述步驟超聲提取，重復(fù)提取3 次，合并濾液后35 ℃減壓蒸發(fā)濃縮至無(wú)乙醇，然后參考文獻(xiàn)[6]采用AB-8大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行初步分離純化，得到膳食多酚粗提物。

1.3.2 HPLC-QTOF-MS法鑒定膳食多酚和HPLC法定量分析膳食多酚

HPLC-QTOF-MS色譜條件：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，2.6 μm），流動(dòng)相A：乙腈（含體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸），流動(dòng)相B：體積分?jǐn)?shù)0.6%甲酸溶液。梯度洗脫程序：流動(dòng)相A初始體積分?jǐn)?shù)為0%，10 min后升至10%，30 min時(shí)升至15%，保持10 min，50 min升至20%，60 min升至30%并保持5 min，66 min降至5%，保持4 min。進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280、330 nm，流速0.600 mL/min，柱溫保持40 ℃。

MS條件：電噴霧電離離子源，正負(fù)離子掃描模式，毛細(xì)管電壓4.5 kV；霧化器壓力1.5 bar；干燥溫度300 ℃，干燥氣體流速9.0 L/min，質(zhì)量掃描范圍100～1 000m/z。

用體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇配制1 mg/mL的柚子果肉多酚粗提物，0.2 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后待測(cè)。HPLC條件：C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)4.5%甲酸溶液，流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫程序：流動(dòng)相B的初始體積分?jǐn)?shù)為5%，10 min后升至10%，30 min時(shí)升至15%，保持10 min，50 min升至20%，60 min升至30%并保持5 min，70 min降至5%保持16 min。流速0.430 mL/min，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為280、330 nm。蜜柚果肉中7 種膳食多酚標(biāo)準(zhǔn)品HPLC定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示。

表1 蜜柚果肉中7 種膳食多酚標(biāo)準(zhǔn)品HPLC定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table1 Linear calibration equations for quantitative high performance liquid chromatography analysis of seven polyphenol standards

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

將HepG2細(xì)胞接種于含胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)10%）、含雙抗（體積分?jǐn)?shù)1%）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合度時(shí)，棄掉舊培養(yǎng)基，用含有1.54 mmol/L KH2PO4、155.17 mmol/L NaCl、2.71 mmol/L Na2HPO4的pH 7.4磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗1 次。加入適量0.25%胰酶，37 ℃消化3～5 min，加入新鮮完全培養(yǎng)基終止消化。收集細(xì)胞于15 mL離心管，1 000 r/min離心3 min。棄掉舊培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按需傳代或鋪板。

1.3.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞進(jìn)行消化、離心、重懸，按每孔200 μL細(xì)胞懸液（4×104個(gè)/mL），即8 000個(gè)/孔將細(xì)胞接種至96 孔板。放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去96 孔板內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入用MEM稀釋培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)1% PBS）溶解的不同質(zhì)量濃度膳食多酚粗提物稀釋液，每孔200 μL。空白組加入200 μL MEM稀釋培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)1% PBS）。陽(yáng)性對(duì)照組加200 μL含5%二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和1% PBS MEM培養(yǎng)基。37 ℃孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，加入200 μL PBS洗一次，每孔加入200 μL MTT工作液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h。孵育結(jié)束后，小心棄去MTT工作液，每孔加入200 μL DMSO，室溫振蕩溶解5 min，于570 nm處測(cè)定實(shí)驗(yàn)組的吸光值ODA和空白組的吸光值ODB，并按式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.5 膳食多酚對(duì)HePG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組：未經(jīng)過(guò)樣品或H2O2處理的細(xì)胞樣本；實(shí)驗(yàn)組：先后經(jīng)過(guò)樣品和H2O2處理的細(xì)胞樣本；模型組：僅經(jīng)過(guò)H2O2處理的細(xì)胞樣本。

根據(jù)H2O2損傷細(xì)胞模型情況，篩選出3 個(gè)不同濃度的H2O2：0.9、1、1.5 mmol/L，稀釋劑為無(wú)血清MEM培養(yǎng)基。篩選膳食多酚粗提物對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯毒性3 個(gè)質(zhì)量濃度：20、100、500 mg/mL，溶劑為含一定量溶劑的1% FBS MEM培養(yǎng)基。

按8 000 個(gè)/孔將細(xì)胞接種至96 孔板，每孔200 μL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去96 孔板內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的膳食多酚粗提物稀釋液，每孔200 μL。空白組、模型組及陽(yáng)性對(duì)照組加入200 μL不含膳食多酚的稀釋液，孵育24 h。棄掉培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組和模型組每孔加入200 μL不同濃度的H2O2溶液，空白組加入200 μL無(wú)血清MEM培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照組加入200 μL 5% DMSO溶液，繼續(xù)孵育6 h。孵育結(jié)束后，棄掉培養(yǎng)液，加入200 μL PBS清洗一次，再加入200 μL MTT工作液，培養(yǎng)箱孵育4 h，小心棄去MTT工作液，每孔加入200 μL DMSO，室溫振蕩溶解5 min，于570 nm處測(cè)量吸光度。

1.3.6 細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放率的測(cè)定

一旦肝細(xì)胞膜的完整性被破壞，細(xì)胞中LDH就會(huì)被釋放到培養(yǎng)基中。在此研究中，使用LDH釋放率檢測(cè)細(xì)胞損傷情況。將HepG2細(xì)胞（每孔2×105個(gè)細(xì)胞）接種到12 孔板中。1 d后，將細(xì)胞與膳食多酚粗提物稀釋液（質(zhì)量濃度20、100 μg/mL）孵育24 h，然后用1.0 mmol/L H2O2處理6 h。收集培養(yǎng)基和細(xì)胞，分別用LDH試劑盒測(cè)定LDH活力，按式（2）計(jì)算細(xì)胞LDH釋放率。

1.3.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧積累情況觀察

DCFH-DA是一種熒光探針，經(jīng)常被用來(lái)監(jiān)測(cè)氧化應(yīng)激水平，以了解實(shí)驗(yàn)樣品對(duì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的敏感性。HepG2細(xì)胞（每孔2×105個(gè)細(xì)胞）在12 孔板中培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞用膳食多酚粗提物預(yù)處理24 h，然后暴露于1.0 mmol/L H2O2中6 h。隨后，向每個(gè)孔中添加10 μmol/L DCFH-DA，并在黑暗中孵育30 min。然后通過(guò)借助DP73型倒置相差熒光顯微鏡獲取圖像來(lái)觀察細(xì)胞內(nèi)ROS累積情況。

1.3.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定抗氧化相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量

細(xì)胞鋪板：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞消化后離心收集，重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4.5×105個(gè)/mL，取1 mL鋪入6 孔板（即每孔4.5×105個(gè)細(xì)胞）。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，加入2 mL培養(yǎng)基于空白組和模型組，實(shí)驗(yàn)組則加入2 mL不同質(zhì)量濃度膳食多酚粗提物。將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后棄去培養(yǎng)基，空白組加入1 mL培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組和模型組加入1 mL含H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育6 h或24 h。

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：孵育結(jié)束后，分別收集各組細(xì)胞，采用TAKRA Minibest universal RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。隨后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作參考試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：反應(yīng)體系為T(mén)B Green?Premix Ex TaqTMII 10 μL；正向引物0.8 μL，反向引物0.8 μL，引物序列如表2所示；cDNA 2 μL；DEPC水6.4 μL；總體系20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃、10 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s；熔解曲線分析的反應(yīng)條件為儀器默認(rèn)程序。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table2 Primer sequences used for real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction

1.3.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法分析Nrf蛋白表達(dá)量

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞消化后離心收集，重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為4.5×105個(gè)/mL，取1 mL鋪入6 孔板（即每孔4.5×105個(gè)）。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。小心棄去舊培養(yǎng)基，空白組和模型組加入2 mL培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入2 mL不同質(zhì)量濃度膳食多酚粗提物。將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基，空白組加入1 mL培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組和模型組加入1 mL 含H2O2的無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育6 h或24 h。

細(xì)胞核蛋白細(xì)胞漿蛋白的提取根據(jù)試劑盒所提供的方法進(jìn)行操作。按照BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，分離膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、10%、12%、15%、18%和20%。采用電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法顯色。用顯影、定影試劑對(duì)曝光后的膠片進(jìn)行顯影和定影。調(diào)整曝光條件。將膠片掃描存檔，通過(guò)Photoshop軟件整理去色。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析，通過(guò)Duncan多重比較進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并用Origin 8.5、Photoshop和Alpha軟件進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜柚果肉膳食多酚的定性與定量結(jié)果

采用總黃酮和總酚測(cè)定方法[7]，測(cè)定出蜜柚果肉膳食多酚粗提物中多酚的純度較低，分別為10.25%和9.56%，多酚純度較低可能由于粗提物中含有其他雜質(zhì)，以及方法中選用的單寧和沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)物不能充分表征粗提物中多種多酚類物質(zhì)含量，具有一定局限性，所以本研究采用HPLC-QTOF-MS定性、HPLC法定量來(lái)表征。柚果肉中純化后膳食多酚粗提物HPLC-QTOF-MS圖的總離子流圖和HPLC圖如圖1所示。

圖1 柚果肉中純化后膳食多酚粗提物負(fù)離子流圖譜（A）、正離子流圖譜（B）、330 nm液相色譜圖（C）和280 nm液相色譜圖（D）Fig. 1 Total ion current chromatograms in the negative (A) and positive ion modes (B), and liquid chromatograms at 330 nm (C) and 280 nm (D) of purified dietary polyphenols from pomelo pulp

多酚類物質(zhì)是柑橘果實(shí)中常見(jiàn)的一類抗氧化生物活性物質(zhì)，在二級(jí)質(zhì)譜中很容易能找到多酚母核發(fā)生逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)產(chǎn)生的特征碎片離子[8]。通過(guò)質(zhì)譜信息、特征吸收波長(zhǎng)、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比、文獻(xiàn)查閱，從柚果肉中共鑒定出7 種可用已知標(biāo)準(zhǔn)品精確定量分析的膳食多酚，其中化合物2和化合物6為首次從蜜柚果肉中被鑒定，HPLC-QTOF-MS圖分別如圖2、3所示。

圖2 化合物2的HPLC-QTOF-MS圖Fig. 2 High performance liquid chromatography-quadrupole-time-offlight mass spectrometry (HPLC-QTOF-MS) spectra of component-2

如圖2所示，在23.636 min處出峰的化合物2的負(fù)離子模式準(zhǔn)分子離子峰m/z593，碎片峰m/z473推測(cè)為雙糖環(huán)裂解脫去C4H8O4（120）得到，碎片m/z383、m/z353推測(cè)為繼續(xù)裂解脫去C3H6O3（90）和C4H8O4（120）。正離子模式準(zhǔn)分子離子峰為m/z595，碎片m/z457推測(cè)為六碳環(huán)的O－C1鍵和C2－C3鍵斷裂并脫水（C4H10O5）所致；碎片峰m/z379推測(cè)為準(zhǔn)分子離子峰m/z595脫去糖苷和3H2O所致，碎片峰m/z325為m/z379繼續(xù)脫去3H2O所致。根據(jù)以上結(jié)果，推測(cè)化合物2為新西蘭牡荊苷。再根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和紫外-可見(jiàn)光譜圖，判斷其為新西蘭牡荊苷[9]，通過(guò)HPLC定量分析得到其含量為6.43 mg/g（表3）。

表3 蜜柚果肉膳食多酚的鑒定及其含量Table3 Identification and quantification of dietary polyphenols in pulp of pomelo

如圖3所示，在48.158 min處出峰的化合物6，在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰為m/z579，碎片峰m/z433和m/z271分別為［M＋H—鼠李糖］＋和［M＋H—新橙皮糖］＋的碎片離子[10]。在負(fù)離子模式下其母離子的質(zhì)荷比為m/z577，m/z269是野漆樹(shù)苷主要碎片離子，可能為野漆樹(shù)苷脫去一分子新橙皮糖產(chǎn)生的碎片離子[11]。再根據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和紫外-可見(jiàn)光譜圖，判斷其為野漆樹(shù)苷[9]，經(jīng)過(guò)HPLC定量后，得到含量為8.45 mg/g（表3）。

圖3 化合物6的HPLC-QTOF-MS圖Fig. 3 HPLC-QTF-MS spectra of component 6

香草酸、阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷和甲基橙皮苷是柑橘類水果中較為常見(jiàn)的多酚類物質(zhì)，其鑒定過(guò)程與上述兩種化合物的鑒定類似[9,12]。經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品HPLC定量分析后，得到含量分別為0.80、0.16、2.63、50.54、23.58 mg/g。由表3可知，柚皮苷含量顯著高于其他6 種多酚，7 種多酚含量之和為92.56 mg/g，即占總粗提物質(zhì)量的9.26%，如圖1C、D可知，粗提物中還有多種多酚類物質(zhì)未被鑒定出來(lái)，且市面上還未有對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品用來(lái)定量分析，所以還需進(jìn)一步研究。

2.2 對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)毒性的膳食多酚粗提物質(zhì)量濃度篩選結(jié)果

由圖4可知，膳食多酚粗提物質(zhì)量濃度在0～500 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，可能在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的膳食多酚粗提物能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，隨著質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，從而導(dǎo)致HepG2細(xì)胞存活率下降。質(zhì)量濃度為0～500 μg/mL膳食多酚粗提物的作用下，細(xì)胞存活率均在80%以上，且不同質(zhì)量濃度之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明膳食多酚粗提物在這個(gè)質(zhì)量濃度區(qū)間對(duì)細(xì)胞沒(méi)有特別明顯毒性作用，所以選擇質(zhì)量濃度20、100、500 μg/mL來(lái)研究膳食多酚粗提物的對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用。

圖4 蜜柚果肉膳食多酚粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig. 4 Effect of dietary polyphenols in pomelo pulp on the survival rate of HepG2 cells

2.3 膳食多酚粗提物對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

通過(guò)本課題組前期對(duì)H2O2濃度的初步篩選，選取0.9、1、1.5 mmol/L的H2O2來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷。如圖5所示，隨著H2O2的濃度升高，模型組的細(xì)胞存活率均呈下降趨勢(shì)。當(dāng)H2O2濃度為1 mmol/L時(shí)，模型組細(xì)胞存活率為47.66%，接近50%。當(dāng)H2O2濃度為0.9 mmol/L和1.5 mmol/L時(shí)，模型組細(xì)胞存活率分別太高和太低，導(dǎo)致樣品對(duì)細(xì)胞的作用效果均不明顯，參考意義不大，故未做進(jìn)一步分析。

圖5 蜜柚果肉膳食多酚粗提物和H2O2對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig. 5 Effect of dietary polyphenols in pomelo pulp combined with H2O2 on cell viability

當(dāng)H2O2濃度為1.0 mmol/L時(shí)，質(zhì)量濃度為20、100 μg/mL的膳食多酚粗提物作用下的細(xì)胞存活率明顯高于模型組，而500 μg/mL的膳食多酚粗提物作用下細(xì)胞存活率明顯降低，說(shuō)明500 μg/mL膳食多酚粗提物對(duì)細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用明顯下降。由此可知，膳食多酚粗提物在20～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)能有效降低H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的氧化損傷作用，對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷有明顯保護(hù)作用，因此選擇質(zhì)量濃度為20、100 μg/mL的膳食多酚粗提物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 膳食多酚粗提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞LDH釋放率的影響

如圖6所示，與模型組相比，用20 μg/ mL和100 μg/mL膳食多酚粗提物預(yù)處理的HepG2細(xì)胞降低了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)LDH釋放率，這可能是由于H2O2使細(xì)胞膜受到損傷，通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞中LDH大量釋放到細(xì)胞外，而20、100 μg/mL膳食多酚粗提物預(yù)處理HepG2細(xì)胞LDH釋放率均比模型組低，說(shuō)明20、100 μg/mL膳食多酚粗提物能夠有效保護(hù)HepG2細(xì)胞。

圖6 蜜柚果肉膳食多酚粗提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞LDH釋放率的影響Fig. 6 Effect of dietary polyphenols in pomelo pulp on LDH release rate from HepG2 cells suffering from oxidative damage

2.5 膳食多酚粗提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞ROS積累的影響

DCFH-DA是一種靈敏、方便的熒光探針，可檢測(cè)活細(xì)胞中ROS的積累，熒光強(qiáng)度越高表示ROS積累越多。由圖7可知，H2O2單獨(dú)處理過(guò)的HepG2細(xì)胞中ROS積累量較多，與之相比，用20 μg/ mL和100 μg/ mL膳食多酚粗提物預(yù)處理明顯降低了氧化損傷HepG2細(xì)胞ROS積累量。結(jié)果表明，20 μg/ mL和100 μg/ mL的膳食多酚粗提物均可以抑制氧化損傷HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的積累。

圖7 蜜柚果肉膳食多酚粗提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞ROS積累的影響Fig. 7 Effect of dietary polyphenols in pomelo pulp on ROS accumulation in HepG2 cells suffering from oxidative damage

2.6 膳食多酚粗提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

抗氧化酶是細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的主要成分，細(xì)胞利用抗氧化酶可以抵消過(guò)量的ROS生成，以維持氧化還原平衡[13]。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶A2（recombinant glutathioneStransferase 2A，GSTA2）可以通過(guò)與谷胱甘肽（glutathione，GSH）結(jié)合來(lái)減少ROS的積累[14]。與空白組相比，H2O2處理的細(xì)胞GSTA2基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而采用20 μg/ mL和100 μg/mL膳食多酚粗提物預(yù)處理后，GSTA2基因相對(duì)表達(dá)量上升（圖8A）。血紅素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）是一種應(yīng)力誘導(dǎo)型酶，可以保護(hù)生物體免受氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)[15]。與空白組相比，H2O2處理的細(xì)胞HO-1基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而采用20 μg/mL和100 μg/mL膳食多酚粗提物預(yù)處理后，HO-1基因相對(duì)表達(dá)量上升（圖8B）。谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）作為抗氧化關(guān)鍵酶，可以減少ROS積累帶來(lái)的氧化損傷[16]。與空白組相比，H2O2處理的細(xì)胞GCLC基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而采用20 μg/mL和100 μg/mL 膳食多酚粗提物預(yù)處理后，GCLC基因相對(duì)表達(dá)量上升（圖8C）。醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1，NQO1）是抗氧化酶之一，可以與NAD（P）H為受體催化醌類及其衍生物發(fā)生還原反應(yīng)而無(wú)單電子產(chǎn)物及自由基生成，從而避免了組織細(xì)胞受氧化應(yīng)激損傷[17]。與空白組相比，H2O2處理的細(xì)胞NQO1基因相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而采用20 μg/mL和100 μg/mL膳食多酚粗提物預(yù)處理后，NQO1基因相對(duì)表達(dá)量上升（圖8D）。由此可見(jiàn)，膳食多酚粗提物能提高HepG2細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量水平。

圖8 蜜柚果肉膳食多酚粗提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞抗氧化基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 8 Effect of dietary polyphenols in pomelo pulp on relative expression levels of antioxidant enzyme genes in HepG2 cells suffering from oxidative damage

2.7 膳食多酚粗提物對(duì)氧化損傷HepG2細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)的影響

Nrf2相關(guān)通路是抗氧化應(yīng)激中關(guān)鍵的信號(hào)途徑。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，Nrf2會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)節(jié)NQO1、HO-1、GSTA2和GCLC等抗氧化酶的基因表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[18]。從圖9可以看出，與空白組相比，膳食多酚粗提物預(yù)處理組和模型組細(xì)胞經(jīng)H2O2處理6 h后，細(xì)胞質(zhì)中Nrf2的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，但細(xì)胞核中Nrf2的表達(dá)量均有所增加，說(shuō)明H2O2對(duì)細(xì)胞有明顯的損傷，使Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核。與空白組相比，經(jīng)H2O2處理24 h后，模型組的細(xì)胞質(zhì)中Nrf2表達(dá)量明顯下降，而細(xì)胞核中Nrf2表達(dá)量與空白組相差不大，膳食多酚粗提物預(yù)處理組的細(xì)胞質(zhì)中Nrf2表達(dá)量比模型組高，其中100 μg/mL的膳食多酚粗提物預(yù)處理組細(xì)胞核中Nrf2表達(dá)量明顯高于20 μg/mL的膳食多酚粗提物預(yù)處理組和模型組，這說(shuō)明較高質(zhì)量濃度的膳食多酚粗提物預(yù)處理，能夠促進(jìn)Nrf2從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，并保持較高且較長(zhǎng)時(shí)間的激活狀態(tài)。

圖9 蜜柚果肉膳食多酚粗提物對(duì)細(xì)胞漿和細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)的影響Fig. 9 Effect of dietary polyphenols in pomelo pulp on Nrf2 protein expression in cytoplasm and nucleus

3 討 論

機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)ROS產(chǎn)生過(guò)多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)動(dòng)態(tài)失衡，從而導(dǎo)致組織損傷，表現(xiàn)出如糖尿病、衰老等癥狀[19-21]。在細(xì)胞中，H2O2是內(nèi)源性ROS的主要來(lái)源之一[22]。細(xì)胞具有多種抗氧化防御機(jī)制，例如用于使ROS排毒并恢復(fù)氧化還原穩(wěn)態(tài)的酶和分子。正常生理情況下，Nrf2主要與其抑制劑Keap1結(jié)合，以其非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，在泛素蛋白酶體途徑作用下迅速降解，以保持在生理狀態(tài)下Nrf2的低轉(zhuǎn)錄活性[23]。當(dāng)細(xì)胞受到ROS刺激后，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，活化的Nrf2轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，與Maf蛋白結(jié)合成異質(zhì)二聚體后與ARE結(jié)合，激活靶基因表達(dá)，如NQO1、HO-1、GSTA2和GCLC，從而發(fā)揮抗氧化作用[24-28]。因此，Nrf2信號(hào)通路在增強(qiáng)抗氧化防御和保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激中起著至關(guān)重要的作用。

蜜柚果肉膳食多酚粗提物中的物質(zhì)成分復(fù)雜多樣，其他成分也可能會(huì)影響多酚的抗氧化活性[29]。另外，蜜柚果肉膳食多酚粗提物中測(cè)得的多酚含量不一定能代表對(duì)人體有效的物質(zhì)含量，因?yàn)槎喾拥纳锢枚韧ǔ：艿停瑧?yīng)詳細(xì)研究多酚在胃腸道消化期間和消化后的生物可及性[30-31]。而且如果這些多酚被吸收，有時(shí)目標(biāo)組織中的濃度不足以使抗氧化活性成為主要的保護(hù)機(jī)制[32]。

由于個(gè)體的腸道菌群是獨(dú)特的，因此不能僅基于體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果就假定“體內(nèi)功能”。腸道菌群的存在有可能會(huì)改變多酚的組成，例如，攝入藍(lán)莓后，血液中發(fā)現(xiàn)的酚類物質(zhì)并非全部直接來(lái)自果實(shí)[33]，有些是由腸道微生物的代謝作用產(chǎn)生的[34]。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)攝入漿果后血漿和尿液中酚酸的濃度和持續(xù)時(shí)間存在變化[35]。因此，蜜柚果肉中的抗氧化活性物質(zhì)和生物體存在各種內(nèi)在和外在復(fù)雜作用，僅使用體外中的簡(jiǎn)單化學(xué)反應(yīng)就無(wú)法預(yù)測(cè)到這種相互作用。

體外細(xì)胞抗氧化保護(hù)實(shí)驗(yàn)雖然不能完全證明體內(nèi)有效保護(hù)，但可以通過(guò)體外細(xì)胞抗氧化保護(hù)實(shí)驗(yàn)來(lái)篩選優(yōu)秀的抗氧化劑，發(fā)現(xiàn)潛在的抗氧化劑來(lái)源[36]。

4 結(jié) 論

在梅州蜜柚柚果肉中共鑒定出7 種可精確定量的膳食多酚：柚皮苷、蕓香柚皮苷、野漆樹(shù)苷、香草酸、甲基橙皮苷、新西蘭牡荊苷和阿魏酸。其中柚皮苷含量為50.54 mg/g，顯著高于其他6 種多酚含量。新西蘭牡荊苷和野漆樹(shù)苷為首次在蜜柚果肉中發(fā)現(xiàn)。質(zhì)量濃度20 μg/mL和100 μg/mL的膳食多酚粗提物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2肝癌細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，降低了LDH的釋放量和ROS的積累，細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白水平降低，能夠促進(jìn)Nrf2從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，并保持較高且較長(zhǎng)時(shí)間的激活狀態(tài)，NQO1、HO-1、GSTA2和GCLC抗氧化酶相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量明顯增加。綜上，梅州蜜柚果肉膳食多酚具有良好的抗氧化活性，是潛在的抗氧化劑來(lái)源，可作為中國(guó)居民膳食多酚良好的攝入來(lái)源。