氯吡苯脲浸泡處理延緩采后芒果成熟和軟化的生理機制

張業歆，劉家糧，潘永貴，高兆銀，胡美姣，張正科,

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 海口 570228；2.中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所，海南 海口 571101）

芒果（Mangifera indicaL.）屬漆樹科常綠喬木果樹，因其果實風味獨特且富含膳食纖維、有機酸、胡蘿卜素、維生素、礦物質、多酚等多種營養物質而具有較高的經濟價值，被譽為“熱帶水果之王”[1]。然而，芒果屬呼吸躍變型果實，采后在常溫條件下可快速成熟，之后啟動衰老并引發品質劣變，嚴重制約芒果產業的發展[2]。因此，開發安全、高效的保鮮技術用以延緩采后芒果的成熟和衰老，對于延長果實貨架壽命至關重要。眾所周知，乙烯對果實成熟過程起關鍵調控作用。芒果果實在響應乙烯的過程中，涉及到葉綠素分解、類胡蘿卜素合成、淀粉水解和細胞壁修飾等代謝的一系列編碼基因協同表達，導致果實色澤由綠轉黃、質地變軟以及形成風味和香氣[3]。長期以來，人們通過各種采后處理技術抑制果實乙烯生物合成來降低乙烯釋放量，從而實現延緩果實成熟衰老的目的。Razzaq等[4]報道，1-甲基環丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）熏蒸處理可降低‘Kensingtong Pride’芒果果實的乙烯釋放量和呼吸速率，同時抑制多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和內切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucanase，EGase）活性升高，使果實的成熟和軟化得到有效延緩。另據報道，外源一氧化氮（nitric oxide，NO）熏蒸處理可通過抑制‘Kensington Pride’芒果1-氨基環丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）合成酶（ACC synthase，ACS）和ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）的活性來降低ACC累積和乙烯生成水平，同時抑制了PG、果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、EGase對細胞壁多糖的水解作用，從而延緩了果實的成熟過程[5]。然而，上述氣體熏蒸處理存在耗時長、成本高、藥劑濃度控制不精確等缺點，因此在芒果采后生產中仍需開發簡便易行的處理措施。

氯吡苯脲（forchlorfenuron，CPPU）是一種具有細胞分裂素功能的植物生長調節劑，能夠與玉米素競爭性結合細胞分裂素氧化酶，在維持內源細胞分裂素水平中發揮重要作用[6]。CPPU作為一種國家批準使用的植物生長調節劑，其安全性已得到考證，且生理活性高于一般嘌呤型細胞分裂素，具有促進植物細胞分裂與增大、抑制衰老等生物學功效[7-8]。已有研究證據表明，CPPU在改善園藝作物品質方面發揮著重要作用。例如，采前應用CPPU可增加葡萄產量，維持漿果采后品質，延長貯藏期[9]；Retamales等[10]報道，采前CPPU噴施處理能夠提高藍莓產量，并顯著降低果實采后質量損失與腐爛率。此外，采后CPPU處理對抑制花椰菜葉綠素降解所導致的菜體黃化也表現出較好的作用[11]。張魯斌等[12]研究發現，采后CPPU處理可延緩‘紅芒6號’芒果的成熟并可維持較高的果實品質，表明CPPU在芒果采后保鮮上具有潛在的應用價值。然而，目前仍然缺乏關于CPPU抑制芒果果實成熟和軟化的生理生化機制研究。為此，本研究分析了CPPU對芒果果實在采后貯藏過程中成熟和軟化的影響及其相關的乙烯生物合成與果膠多糖代謝變化，以期為CPPU用于芒果采后保鮮提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試‘貴妃’芒果（綠熟期）采自海南省三亞崖城某商業果園，當日運抵海南大學食品科學與工程學院采后實驗室，選擇大小、形狀、色澤、無機械傷的果實作為實驗用果。

CPPU（分析純） 生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

FT-327型手持硬度計（探頭直徑6 mm） 意大利Effegi公司；MASTER-M手持折光儀 日本Atago公司；CR-400色差儀 日本柯尼卡-美能達公司；GXH-3010E便攜式紅外氣體分析器 北京華云分析儀器研究所有限公司；T18高速勻漿機、RV10旋轉蒸發儀 艾卡（德國）儀器設備有限公司；DBS-160F電腦自動部份收集器上海精科實業有限公司；6890N氣相色譜分析儀（配備二苯基甲基硅氧烷色譜柱、氫火焰離子化檢測器） 美國安捷倫科技公司；UV-5500PC紫外-可見分光光度計上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料采后處理

將芒果果實浸泡于質量分數0.5%次氯酸鈉溶液（有效氯質量分數≥10%）中消毒處理3 min，然后用清水沖洗干凈。將晾干后的芒果果實隨機分成2 組，分別置于清水（對照）和10 mg/L CPPU溶液中浸泡10 min[11]，自然晾干。所使用CPPU溶液質量濃度通過預實驗結果確定。將晾干后的對照組與CPPU處理組果實置于保鮮盒（0.32 m×0.22 m×0.1 m，盒側面有12 個直徑8 mm的孔以避免果實無氧呼吸，盒內底部墊有軟紙避免果實擦傷），于常溫（（25±1）℃）下貯藏8 d。每日每組處理設3 次重復，每重復用6 個果實。果實的硬度、色澤、乙烯釋放量、可溶性固形物質量分數（soluble solids content，SSC）和可滴定酸質量分數（titratable acidity content，TAC）每2 d測定一次，呼吸速率每日進行測定。同時，每2 d取果肉樣品1 次，液氮冷凍后于－80 ℃保存待測。

1.3.2 果實硬度、色度、SSC和TAC測定

硬度：將果實赤道軸中心處果皮削去，使用手持式硬度計測定果實正反兩面削皮處的硬度。單位為N。

色度：選擇黃度（b*）值作為本研究中芒果果肉色澤的特征參數，使用色差儀在果實切片切面中心測定b*值，每果設2 個對稱測量點。b*值由低到高代表顏色由藍變黃，正值越大表示黃色越深。

SSC：取1 g果肉勻漿，勻漿液在8 000×g條件下離心10 min，取一滴上清液用手持折光儀測定。結果以可溶性固形物在果肉中的質量分數表示。

TAC：參考周志強等[13]的滴定方法測定，以檸檬酸計，單位為%。

1.3.3 果實呼吸速率測定

呼吸速率：使用便攜式紅外氣體分析器測定呼吸速率。將每組處理的18 個果實（6 個果實/重復）分別置于2.25 L塑料容器中，密封，室溫下放置20 min，然后將探頭插入容器內，記錄CO2濃度。以每秒每千克鮮樣生成的CO2質量表示呼吸速率，即為μg/（kg·s）。

1.3.4 乙烯釋放量、ACC含量及ACS和ACO活力測定

乙烯釋放量：采用氣相色譜法進行測定。將每組處理的18 個果實（6 個果實/重復）分別置于2.25 L塑料容器中密閉1 h，然后用注射器抽取容器內1 mL氣體注入氣相色譜儀中，進樣溫度、柱溫和檢測器溫度分別設置為120、60 ℃和250 ℃，N2（載氣）、H2和空氣流速分別為0.023、0.67 mL/s和6.67 mL/s。以每秒每千克鮮樣生成乙烯的質量表示乙烯釋放量，即為ng/（kg·s）。

ACC含量：參考Li Li等[14]的方法，通過ACC標準品確定理論ACC轉化率，然后根據反應液容器內乙烯氣體釋放量和理論ACC轉化率計算每千克鮮樣中ACC物質的量，單位表示為nmol/kg。

ACS和ACO活力：分別參照Amornputti[15]和Zaharah[5]等的方法進行，ACS和ACO活力均以每秒每千克鮮樣的乙烯釋放量表示，即為nmol/（kg·s）。

1.3.5 水溶性果膠和螯合劑溶性果膠含量測定

參考Jeong等[16]的方法，取10 g芒果果肉制備乙醇不溶性固形物（ethanol insoluble solids，EIS），取30 mg EIS分別溶解于蒸餾水和50 mmol/L環己烷二胺四乙酸（1,2-cyclohexylenedinitrilotetraacetic acid，CDTA）溶液中，通過間羥基聯苯法測定兩種溶液中的糖醛酸（uronic acid，UA）含量，其分別代表水溶性果膠（water-soluble pectin，WSP）和CDTA溶性果膠（CDTAsoluble pectin，CSP）含量，以每千克EIS所含UA質量表示，單位均為g/kg。

1.3.6 WSP和CSP分子質量分布分析

參照Zhang Zhengke等[17]的方法將WSP與CSP濃縮至質量濃度約為500 mg/L（以UA當量計），將2 mL濃縮液注入填充瓊脂糖凝膠CL-2B-300的分離柱（300 mm×16 mm）進行凝膠層析，以0.2 mol/L醋酸銨作為洗脫緩沖液，流速40 mL/h，使用部分收集器收集層析洗脫液，每管收集2 mL，共45 管。每管取0.2 mL洗脫液測定其中UA含量。柱空體積（V0）和總體積（Vt）分別由藍色葡聚糖2000和葡萄糖的洗脫體積確定。各洗脫餾分中的果膠相對含量以其UA絕對含量占樣品總UA含量的比例表示。UA含量較高表明在該洗脫體積下果膠分子聚集較多，根據其洗脫體積大小確定洗脫順序，從而確定分子質量分布。

1.3.7 果膠水解酶活力測定

PG活力：按照Ren Yuanyuan等[18]的方法，取2 g果肉進行粗酶液提取，采用氧化還原法測定。PG活力表示為每秒每千克果蔬組織催化果膠生成半乳糖醛酸的物質的量，單位為μmol/（kg·s）。

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）活力：參照周曉輝[19]的方法，取2 g果肉通過鄰硝基苯半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyranosides，ONPG）水解法測定β-Gal活力。β-Gal活力表示為每秒每千克鮮樣在37 ℃催化ONPG水解生成鄰硝基苯酚的物質的量，單位為μmol/（kg·s）。

PME活力：參照Garciabetanzos等[20]的方法，取2 g果肉用于粗酶液提取，以柑橘果膠作為底物，記錄反應溶液在620 nm波長處的吸光度變化情況。PME活力表示為每秒每千克樣品在620 nm處吸光度的變化值，即為ΔA620nm/（kg·s）。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行分析，結果以平均值±標準差表示。采用獨立樣本t檢驗比較均值并進行顯著性分析（以P＜0.05表示差異顯著）；用Origin 9.1軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 CPPU處理對采后芒果果實外觀、果肉色澤、硬度的影響

由圖1A可知，對照與CPPU處理的芒果果實在貯藏過程中，其外觀色澤逐漸由紅綠色轉變為紅黃色，但CPPU處理果實的轉色進程明顯遲于對照果實。由圖1B可知，對照組果肉色度b*值持續升高，表明果肉顏色不斷轉黃；CPPU處理果實的b*值在貯藏2～6 d內極顯著低于對照果實（P＜0.01），表明CPPU處理可有效抑制芒果果實在成熟過程中果肉色澤變化。如圖1C所示，對照與CPPU處理果實的硬度在貯藏前2 d輕微下降，隨后對照果實快速軟化，至貯藏8 d時降低至（4.16±0.19）N；CPPU處理有效抑制了果實軟化，其處理果實的硬度在貯藏4 d和6 d時分別較對照果實高158.9%和129.6%（P＜0.05）。

圖1 CPPU浸泡處理對采后芒果果實外觀（A）、果肉色度b*值（B）、硬度（C）的影響Fig. 1 Effect of CPPU treatment on appearance (A), pulp b* value (B)and firmness (C) in postharvest mango fruit

2.2 CPPU處理對采后芒果果實SSC和TAC的影響

如圖2A所示，芒果果實SSC初始值為（8.18±0.30）%，對照果實SSC在整個貯藏過程中不斷升高，在貯藏8 d時達到（14.71±0.11）%；CPPU處理可抑制果實SSC升高，CPPU處理組果實的SSC在貯藏4 d和6 d時分別較對照果實低13.6%和5.0%，差異顯著（P＜0.05），表明CPPU處理可有效抑制采后芒果果實淀粉向可溶性糖的轉化。

如圖2B所示，對照芒果果實TAC初始值為（1.19±0.11）%，經8 d貯藏后下降至（0.23±0.03）%；與對照相比，CPPU處理果實TAC下降速率較慢，其中在貯藏4、6 d和8 d時分別較對照高89.7%、126.8%和64.5%，差異極顯著（P＜0.01），結果表明CPPU處理能夠有效減少芒果果實有機酸的呼吸消耗和氧化。

圖2 CPPU處理對采后芒果果實SSC（A）和TAC（B）的影響Fig. 2 Effect of CPPU treatment on SSC (A) and TAC (B) in postharvest mango fruit

2.3 CPPU處理對采后芒果果實呼吸速率的影響

由圖3可知，對照果實呼吸速率在貯藏開始后持續升高，在貯藏5 d時達到峰值，為（44.72±0.72）μg/（kg·s），之后呈迅速下降趨勢。CPPU處理果實的呼吸峰值推遲至貯藏第6天出現，但峰值與對照相比無明顯差異，表明CPPU處理可有效推遲芒果果實的呼吸躍變。

圖3 CPPU處理對采后芒果果實呼吸速率的影響Fig. 3 Effect of CPPU treatment on respiration rate in postharvest mango fruit

2.4 CPPU處理對采后芒果果實乙烯釋放量和ACC含量的影響

由圖4A可知，對照果實的乙烯釋放量在貯藏開始后迅速增加，在貯藏6 d時達到最大，其值為（24.91±0.72）ng/（kg·s），之后隨果實衰老而快速下降；CPPU處理果實的乙烯釋放量變化趨勢與對照果實相似，但其在貯藏4 d和6 d時極顯著低于對照果實（P＜0.01）。芒果果實ACC含量初始值為（1.21±0.07）nmol/kg，貯藏6 d后上升至（4.88±0.24）nmol/kg，隨后迅速下降（圖4B）；與對照果實相比，CPPU處理果實在整個貯藏期間ACC水平均顯著低于對照果實（P＜0.05、P＜0.01）。上述結果表明CPPU處理有效抑制了ACC累積與乙烯生成。

圖4 CCPU處理對采后芒果果實乙烯釋放量（A）和ACC含量（B）的影響Fig. 4 Effect of CPPU treatment on ethylene production (A) and ACC content (B) in postharvest mango fruit

2.5 CPPU處理對采后芒果果實ACS和ACO活力的影響

由圖5可知，對照果實ACS和ACO活力在貯藏過程中均呈現先上升后下降的趨勢，在貯藏6 d時達到最大，活力峰值分別為（2.40±0.13）nmol/（kg·s）和（3.90±0.22）nmol/（kg·s）；CPPU處理果實的ACS和ACO活力在貯藏6 d時僅分別達到（1.70±0.06）nmol/（kg·s）和（2.79±0.23）nmol/（kg·s），分別較對照果實降低了29.2%（P＜0.01）和28.5%（P＜0.05），表明CPPU處理可有效抑制芒果果實成熟中乙烯生物合成關鍵酶活力的變化。

圖5 CPPU處理對采后芒果果實ACS（A）和ACO（B）活力的影響Fig. 5 Effect of CPPU treatment on ACS (A) and ACO (B) activity in postharvest mango fruit

2.6 CPPU處理對采后芒果果實WSP與CSP含量的影響

如圖6所示，芒果果實在貯藏初始時的WSP和CSP含量分別為（9.33±2.02）g/kg和（8.69±1.07）g/kg；對照果實的WSP和CSP含量在貯藏過程中持續上升，在貯藏8 d時分別達到（133.53±11.88）g/kg和（98.55±9.71）g/kg，分別增長了12.31 倍和9.34 倍；CPPU處理果實的WSP和CSP含量在貯藏2～6 d中均顯著低于對照果實（P＜0.05、P＜0.01），結果表明CPPU處理可有效推遲芒果果實成熟過程中果膠的增溶過程。

圖6 CPPU處理對采后芒果果實WSP（A）與CSP（B）含量的影響Fig. 6 Effect of CPPU treatment on water-soluble pectin (A) and CDTA-soluble pectin (B) contents in postharvest mango fruit

2.7 CPPU處理對采后芒果果實WSP和CSP分子質量分布的影響

圖8 CPPU處理對采后芒果果實CSP分子質量分布的影響Fig. 8 Effect of CPPU treatment on molecular mass distribution of CDTA-soluble pectins in postharvest mango fruit

如圖7、8所示，芒果果實在貯藏第0天時尚未開始軟化，兩種果膠主要以高分子質量聚合物形式分布，對照果實開始軟化后，兩種果膠主要以中間分子質量聚合物形式聚集；在貯藏8 d時，對照果實WSP和CSP洗脫體積已接近總洗脫體積（Vt＝74 mL），即兩種果膠已解聚為低分子質量UA片段，表明果實已完全軟化；與對照果實相比，CPPU處理果實在貯藏4 d和8 d時有較多的高分子質量果膠聚合物存在，表明CPPU處理有效延緩了WSP和CSP的解聚。

圖7 CPPU處理對采后芒果果實WSP分子質量分布的影響Fig. 7 Effect of CPPU treatment on molecular mass distribution of water-soluble pectins in postharvest mango fruit

2.8 CPPU處理對采后芒果果實果膠水解酶活性的影響

如圖9A所示，對照果實PG活力在貯藏前6 d呈逐步上升趨勢，在貯藏6 d時PG活力達到最大，為（3.90±0.18）μmol/（kg·s），隨后下降；CPPU處理抑制了芒果果實PG活力的增加，在貯藏4 d和6 d時分別較對照低32.0%和23.4%（P＜0.05）。

圖9 CPPU處理對采后芒果果實PG（A）、β-Gal（B）、PME（C）活力的影響Fig. 9 Effect of CPPU treatment on activities of PG (A), β-Gal (B) and PME (C) in postharvest mango fruit

如圖9B所示，對照果實β-Gal活力在貯藏過程中呈不斷上升趨勢，在貯藏8 d時達到（6.49±0.21）μmol/（kg·s）；CPPU處理果實的β-Gal活力在貯藏前2 d與對照果實無顯著差異，但貯藏4 d之后，CPPU處理果實的β-Gal活力顯著低于對照果實，在貯藏8 d時僅為（4.57±0.16）μmol/（kg·s），較對照果實低29.7%（P＜0.01）。

如圖9C所示，對照果實的PME活力在貯藏過程中穩步下降，在貯藏8 d時降低至（338.33±19.22）ΔA620nm/（kg·s），較第0天低34.09%；CPPU處理果實有效抑制了PME活力的下降，在貯藏4 d和6 d時分別較對照果實高19.8%（P＜0.01）和18.2%（P＜0.05）。上述結果表明CPPU有效抑制了芒果果實成熟過程中3 種果膠水解酶活力的變化，進而延緩了果膠的降解。

3 討 論

芒果果實在采收后易快速成熟和軟化，導致其貨架期相對較短，并使產品供應鏈及物流受到嚴重限制[21]。因此，開發芒果果實成熟軟化調控技術成為生產中亟待解決的重要問題。目前已有報道顯示，氣體熏蒸（如臭氧、1-MCP、NO）、可食性涂膜和化學藥劑浸泡（如水楊酸、硝普鈉、褪黑素）等多種處理技術可有效控制芒果采后成熟[22-28]。然而，大多技術仍處于實驗室研究階段，工業化應用尚有距離。

本研究發現，10 mg/L CPPU浸泡處理不僅明顯推遲‘貴妃’芒果果實在常溫貯藏過程中的色澤轉黃、硬度下降及SSC和TAC變化，還可推遲芒果果實的呼吸躍變和抑制乙烯生成，表明CPPU處理能夠有效延緩芒果果實的成熟和軟化進程，這對于改善果實貯藏品質具有顯著作用。本實驗結果與張魯斌等[12]在‘紅芒6號’芒果及Huang Hua等[29]在香蕉中的報道一致。

芒果作為一種典型的呼吸躍變型水果，其在成熟過程中的生理生化變化可通過乙烯的自我催化反應及信號感知來引發和調控[3]。在高等植物乙烯生物合成途徑中，首先通過ACS作用將S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）轉化為乙烯合成前體ACC，其在ACO催化下進一步合成乙烯。一般而言，植物體ACS和ACO的活性可決定乙烯的生物合成速率。在本研究中，盡管CPPU處理并未推遲芒果果實貯藏過程中ACC與乙烯釋放量峰值出現時間，但顯著降低了二者的生成水平，這可能與果實ACS和ACO活性受到CPPU抑制有關。與此不同，蘇苗等[30]研究發現，采前噴施CPPU對采后獼猴桃果實的乙烯生物合成具有明顯促進作用，使果實成熟軟化加快，故對果實的貯藏帶來不利影響。上述研究結果表明，CPPU與果實體內乙烯的相互作用較為復雜，其可能受到果實種類與品種、CPPU劑量、處理時期、處理方式及貯藏條件等多種因素影響。

果實在采后成熟過程中，細胞壁中的果膠與半纖維素分子通過酶促反應不斷解聚并增溶，使細胞壁結構變得松弛而導致果實軟化[31]。在本研究中，WSP和CSP含量在芒果果實軟化過程中不斷升高；與此同時，WSP與CSP分子質量呈現由高到低的分布變化趨勢，這與鱷梨果實成熟過程中果膠分子解聚的模式[32]相似。相比較發現，CPPU處理的芒果果實果膠分子解聚和增溶的過程遲于對照果實，從而顯著延緩果實軟化。在蓮子中也發現CPPU處理抑制果膠的增溶作用[33]。

大量研究表明，果實細胞壁果膠的解聚與增溶作用受果膠酶的催化而實現，其中PG、PME和β-Gal是最常見的果膠酶[31]。PG可水解多聚半乳糖醛酸的α-(1,4)-糖苷鍵，從而參與果膠的降解，導致果實軟化[34]。本研究中，對照果實的PG活力在貯藏6 d時達到峰值，之后呈現快速下降的趨勢，這與乙烯釋放量變化趨勢相近，其相關系數r＝0.85，故推測采后芒果PG活性變化可能受內源乙烯調控。CPPU處理延緩PG介導的芒果果實軟化可能與乙烯生物合成受到抑制有關。Razzaq等[4]發現，‘Kensington Pride’芒果果實在成熟過程中PG活性被外源乙烯誘導，但被1-MCP處理所抑制，繼而影響了果實軟化，該結果證明了本研究的觀點。

PME能夠催化果膠分子去甲氧基化，其產物果膠酸可作為底物參與PG的解聚反應，使果實逐步軟化[35]。本研究中，對照芒果果實PME活力在貯藏過程中持續下降，而CPPU處理明顯減緩了PME活力的下降速率。CPPU處理果實具有較高的PME活力意味著其果膠鏈上有更多的甲氧基被移除，去甲酯化后的果膠酸可與游離鈣離子結合而形成凝膠，故有助于維持果實硬度。β-Gal作為修飾果膠的關鍵酶之一，能夠通過催化果膠分子半乳聚糖側鏈的水解而參與果膠的溶解過程，使果實軟化。本研究中，β-Gal活力在‘貴妃’芒果果實貯藏過程中呈現持續升高的趨勢，表明β-Gal在芒果后熟軟化中發揮重要作用，這與在‘Harumanis’‘Nam Dokmai’‘臺農1號’等芒果品種中獲得的結果[36-38]一致。CPPU處理較大程度地抑制了β-Gal活性上升，因此能較好地維持果膠穩定性并抑制芒果果實軟化。

綜上所述，采后CPPU處理可有效延緩‘貴妃’芒果果實在貯藏過程中成熟相關生理指標變化，這與CPPU對果實乙烯生物合成及果膠降解的抑制作用密切相關。因此，適當質量濃度的CPPU處理有助于延長采后芒果果實貯藏期，這為芒果采后保鮮提供了新的思路。