乳酸菌作為生物保護菌的抑菌機理及其在食品中應用的研究進展

呂懿超，李香澳，王凱博，孔保華，陳 倩

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

由食品中有害微生物造成的食品腐敗和安全問題一直受到廣泛關注。為了有效抑制有害微生物的生長，延長食品保質期，提高食品安全性，食品工業中常通過物理保鮮、添加化學防腐劑或使用新型包裝方式等來抑制有害微生物[1]。近期研究發現，雖然化學防腐劑按照規定添加量單一添加時不會對人體造成損害，但防腐劑與增味劑和色素等多種添加劑混合添加時，會影響人體代謝，增加發生慢性病的風險[2]。另外，隨著生活水平的提高，消費者希望食品行業減少塑料等包裝材料的使用[3]。因此尋找天然、安全的保鮮方法成為近年來的研究熱點。近年來“生物保護菌”的提出滿足了消費者的這一需求。

生物保護菌是指可以添加到食品中的具有延長食品貨架期和（或者）抑制有害微生物生長的活的微生物[4]。乳酸菌因可以產生具有抑菌活性的代謝產物（有機酸、細菌素和環肽等）[5]，并可以通過微生物群體感應[6]和競爭作用[7]來抑制腐敗菌生長，成為生物保護菌篩選的重點。2016年，明串珠菌4010（Leuconostoc carnosum4010）被加拿大政府批準作為生物保護菌添加到真空包裝肉制品中[8]。隨著乳酸菌作為生物保護菌的合法化，將乳酸菌作為生物保護菌應用在食品領域中成為研究熱點。因此，近年來越來越多的研究人員將乳酸菌應用于不同食品的生物保護中。本文將主要從乳酸菌產生的抑菌物質、微生物群體感應以及競爭作用等方面介紹乳酸菌的抑菌原理，同時綜述了近些年乳酸菌作為生物保護菌在乳制品、肉制品、水產品和果蔬產品中的應用，并對生物保護菌未來的研究方向進行了展望。

1 乳酸菌的抑菌機理

對于乳酸菌抑菌機理的研究，早期一直關注其代謝產生的抑菌物質，如有機酸、細菌素等，這些物質主要通過增加微生物膜通透性來抑制有害微生物的生長[9]。隨著研究的進一步深入，近些年發現乳酸菌可以通過微生物群體感應作用有效抑制有害微生物的生長和生物膜的形成[6]。此外，研究還發現乳酸菌可以通過發酵產品產生抑菌蛋白或通過與有害微生物競爭[7]等方式來抑制有害微生物生長。

1.1 乳酸菌代謝產生有機酸類

乳酸菌代謝產生的有機酸，如乙酸、乳酸、碳原子數較多的脂肪酸和苯乳酸等可通過競爭作用（圖1機制一）、增加細菌外膜通透性（圖1機制二）、改變胞內滲透壓（圖1機制三），以及抑制大分子的合成（圖1機制四）等方式來抑制有害微生物生長[10]。

圖1 乳酸菌代謝產生有機酸的抑菌機制[10]Fig. 1 Antimicrobial mechanism of organic acids produced by lactic acid bacteria[10]

1.1.1 競爭作用

1.1.1.1 能量競爭

乳酸菌代謝產生的有機酸屬于弱酸，這些弱酸在細胞外液中以解離和未解離兩種狀態存在，而未解離的有機酸分子可以通過自由擴散進入到細胞內[11]。由于細胞內處于偏堿性環境，使得有機酸解離平衡向產生氫離子和酸根離子方向移動，進而產生兩種離子。但是這兩種離子不能通過自由擴散的方式擴散到細胞外[12]，所以為了維持細胞內環境的穩定，細胞需要消耗ATP，通過主動運輸的方式將氫離子轉運到胞外。然而這是一個額外耗能過程，需要同細菌正常代謝所需能量產生競爭[13]。與此同時，有機酸可以消除ATP和電子傳遞的偶聯作用，從而降低細菌的產能效率。乳酸菌通過這種能量競爭的方式可抑制微生物的生長。

1.1.1.2 營養競爭

除了對能量競爭外，有機酸還可以與微生物中營養物質發生作用，造成同微生物的營養競爭。Mani-López等[14]研究發現，乳酸在細胞外形成的乳酸鹽可改變沙門氏菌周圍水分活度，通過對水分子的競爭降低水分活度達到抑菌的目的。此外，一些有機酸可螯合金屬離子，與微生物生長所需的金屬離子形成螯合物，從而抑制微生物的生長[15]。

1.1.2 增加膜通透性

由于有機酸具有一定的脂溶性，可以作用于細胞膜，使得膜脂多糖和磷脂大量釋放造成細胞膜穩定性降低[16]。同時有機酸還可以通過膜表面的孔道蛋白，進入細胞外膜和細胞內膜之間的周質，并導致脂多糖羧基和磷酸基團質子化，從而使得細胞外膜被破壞，細胞內物質泄漏[17]。參與競爭機制模式的氫離子在被轉運到胞外的同時，鉀離子被泵入到細胞內，造成細菌跨膜質子動力勢能被破壞，胞內滲透壓升高，從而破壞細菌細胞膜，導致內容物外泄，從而起到抑制微生物生長的作用[16]。

1.1.3 改變胞內滲透壓

有機酸在胞內解離，以氫離子和酸根陰離子形式存在于細胞內。因此有機酸進入細胞質，不僅會導致胞內滲透壓升高，還會導致陰陽離子濃度升高。為了恢復胞內滲透壓，保持內外有機酸分子和陰陽離子濃度平衡，細胞需要釋放陰陽離子。但是釋放沒有選擇性，一些帶有負電的細菌生長所需前體物質及輔助因子會同酸根離子一起被釋放到胞外，導致微生物生長受阻[18]。Roe等[19]研究發現大腸埃希氏菌在乙酸作用下，胞內乙酸根濃度升高，為了降低胞內滲透壓，大腸埃希氏菌釋放谷氨酸根，最終導致大腸埃希氏菌生長速率減慢。

1.1.4 抑制大分子合成

有機酸可以通過影響微生物DNA的合成影響轉錄過程，進而影響合成相應蛋白質來抑制微生物生長。由于乳酸菌產生乳酸并在胞內聚集，原本糖酵解的中間產物丙酮酸由于反饋抑制不能繼續轉化成乳酸，而使得丙酮酸在細胞中積累。為了減少丙酮酸在細胞中的積累，細胞通過增強磷酸戊糖途徑所需要酶的轉錄能力，提高酶的含量，減少丙酮酸的積累，同時降低了細胞產能，從而抑制細菌生長[20]。此外，有機酸可抑制胞內酶的活性，導致細胞內代謝活動受阻。Roe等[21]研究指出乙酸可以抑制大腸埃希氏菌K-12（Escherichia coliK-12）中高半胱氨酸轉化為蛋氨酸時所需酶的活力，蛋氨酸的缺失影響了細菌的生長，同時高半胱氨酸由于不能及時轉化，在細胞內不斷積累，對細胞產生毒害作用。

1.2 細菌素類

細菌素是細菌在代謝過程中產生的多肽或蛋白質類抗菌物質，具有抗細菌和真菌的作用[22]。并且大部分細菌素具有膜活性，可通過連接、嵌入作用在細胞膜上形成孔道，使得胞內容物外泄，導致細胞死亡[23]。細菌素可分類4 類：I類是羊毛硫抗生素，II類是熱穩定、無修飾的小分子肽，III類為熱不穩定的大分子肽，IV類為蛋白質化合物[24]。

1.2.1 羊毛硫抗生素

I類細菌素由于結構不同可以被分為兩類，分別為帶正電且具有疏水基團，具有雙親性、螺旋狀肽鏈的A型和分子質量較小、含有很多小型環狀結構的B型[25]。乳酸菌產生的大多為A型羊毛硫抗生素。

A型羊毛硫抗生素對革蘭氏陽性菌具有較好的抑制作用，但對革蘭氏陰性菌、真菌和酵母基本沒有效果[26]。通過體外模擬A型羊毛硫抗生素對磷脂雙分子層的研究發現，細胞膜表面的孔道主要經過4 步形成（圖2）：1）細菌素通過靜電相互作用與靶細菌的細胞膜相結合；2）細菌素氮端與細菌細胞膜結合；3）細菌素碳端跨過細菌細胞膜；4）在細菌細胞膜上形成孔道，造成細胞膜通透性增加[27]。

以典型的A型羊毛硫抗生素乳酸鏈球菌素（Nisin）為例：Nisin作用于細菌細胞膜時，其碳末端首先通過靜電相互作用與帶負電的磷脂結合。革蘭氏陽性菌細胞膜含有大量的負電脂質（磷脂酰甘油和心磷脂），而革蘭氏陰性菌和酵母菌的細胞膜通常是兩性脂質，因此Nisin對革蘭氏陽性菌更為有效。由于Nisin的氮端與表面蛋白共享一個同源的氮環，因此Nisin的氮端可以與細胞膜通過肽聚糖前體脂質II相互作用特異性結合，使得Nisin分子平行貼在細胞膜表面。此外，肽聚糖是細菌細胞壁的主要成分，但是由于肽聚糖前體物質與Nisin結合，導致脂質II不能正常合成肽聚糖，從而干擾細菌細胞壁的正常合成和細胞正常分裂。Nisin在細胞膜表面通過兩種方式形成孔道，分別稱為“桶板”模型（圖2A）和“楔形”模型（圖2B）?！巴鞍濉蹦Ｐ椭赋鯪isin疏水殘基與脂質的酯?；嗷プ饔?，其極性殘基位于膜-水界面，由于大量聚集使得膜局部移位變薄，Nisin碳端以電勢依賴方式插入雙層膜疏水中心，最后由多個Nisin分子一起形成孔道。而另一種“楔形”模型中，質子能耗散，膜內外存在高跨膜電勢，導致磷脂膜表面彎曲，膜平面方向改變產生楔形孔隙[28]。

圖2 Nisin抑菌機制[27]Fig. 2 Antimicrobial mechanism of nisin[27]

1.2.2 肽類細菌素

II類細菌素是一類熱穩定、未修飾的小肽，分為4 類：IIa類（類乳酸片球菌素細菌素）是一類熱穩定性小肽，是通過兩個甘氨酸殘基加工形成的前體合成的，對單核細胞增生李斯特菌有強烈的抑菌活性，氮端具有共有序列YGNGVX-C；IIb類（雙肽、未修飾細菌素）是由兩個不同的肽組成一個具有抗菌活性的絡合物；IIc類（環狀細菌素）和IId類（未修飾、線性、非類乳酸片球菌素細菌素）[24,29-30]。

植物乳桿菌TN635（Lactobacillus plantarumsp.TN635）產生的IIa類細菌素BacTN635可以通過碳端α-螺旋結構吸附于細胞膜上，同樣通過在細胞膜形成孔道，使得細胞膜通透性增加，從而引起能量消耗，內容物外泄，導致細胞死亡（類似于圖1機制二）[31]。而IIb類細菌素一般需要兩個肽的相互作用，而IIb類細菌素也被分為兩類：一類是Lactococcin G，當這類細菌素的兩個肽分開時，就不具備抑菌活性，而兩個肽相互作用時可以消耗質子勢能，減少ATP的生成，同時抑制氨基酸的攝??；而另一類的代表則是由嗜熱鏈球菌產生的由兩個肽組成的Thermophilin13，其中一個是抗菌肽ThmA，而另一個肽是ThmB。這種嗜熱鏈球菌素可以抑制李斯特菌，并且ThmB可作為增強因子將ThmA的活性提高約40 倍[32]。IIc和IId細菌素都可以在細菌細胞膜表面形成孔道，從而增加細胞膜的通透性，且都對革蘭氏陽性菌敏感。格氏乳桿菌和腸球菌分別可以產生IIc細菌素Gassericin A、Enterocin AS-48，并且可以作用于膜表面ABC轉運蛋白，從而形成孔道[33-34]。而唾液乳桿菌和乳酸乳球菌分別產生的IId細菌素Bactofencin A和LsbB則是通過作用于金屬多肽酶來達到抑菌的目的[35-36]。

1.2.3 熱敏感大分子蛋白

III類細菌素是一種熱敏感大分子蛋白，分子質量一般大于30 kDa。這類細菌素也是通過在細菌細胞膜上形成孔道，從而導致細胞膜通透性增加，達到抑菌目的。但是與A型羊毛硫抗生素相比，III類細菌素有較好的廣譜性，可以有效抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的生長。但這類細菌素由于研究信息較少，還沒有具體作用受體的相關報告[37]。卷曲乳桿菌（Lb.crispatus）[38]、瑞士乳桿菌CNRZ450（Lb. helveticusCNRZ450）和瑞士乳桿菌481（Lb. helveticus481）[39-40]均可以產生III類細菌素Helveticin M和Helveticin J。Helveticin M可以破壞革蘭氏陽性菌細胞壁和革蘭氏陰性菌外膜的穩定性，因而對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用。

1.2.4 大分子復合物

IV類細菌素是由碳水化合物、蛋白質和類脂基團組成的大分子復合物，可以有效抑制真菌和革蘭氏陰性菌的生長[9]。趙娜等[41]發現瑞士乳桿菌AJT（Lb. helveticusAJT）可以產生對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和青霉有抑制作用抗菌物質。排除酸性物質和過氧化氫的影響后，抗菌物質經蛋白酶處理，發現抗菌活性下降但依然具有抗菌活性，從而表明抗菌物質是由蛋白和非蛋白物質復合而成，屬于IV類細菌素。同時，一些研究人員發現從埃及鹽腌發酵魚制品中分離出的糞腸球菌F4-9（Enterococcus faecalisF4-9）可以產生一種對蛋白酶敏感、pH值活性范圍較寬、耐熱性較好的細菌素，稱為Enterocin F4-9。該細菌素作用范圍較窄，對革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌JM109（E. coliJM109）有抑制作用[42]。此外，乳酸乳球菌L9（Lactococcus lactisL9）也可以產生此類細菌素Lactococcin GJ-9[43]。目前發現的細菌素Pediocin SJ-1[44]、Leuconocin S和Lactocin 27也屬于IV類細菌素[36]。

1.3 群體感應抑制劑

微生物群體感應是指微生物可以產生一類被稱為自誘導物的信號分子，信號分子濃度與微生物密度成正比，當信號分子積累到一定閾值時，開始通過激活并結合其受體蛋白來啟動相關基因的表達[45]。一些腐敗菌和致病菌的腐敗能力、遺傳能力、毒力以及生物膜的形成都與群體感應有關[46]。并且研究發現導致乳制品、肉制品、水產品和蔬菜等變質的微生物的腐敗能力都受到群體感應的調控[47-48]。因此抑制或阻斷細菌群體感應可以有效抑制腐敗菌或致病菌的生長和毒性，從而有效延長食品保質期，提高安全性。

群體感應抑制劑就是一類通過調控微生物群體感應系統來抑制腐敗菌的生長或者降低其對環境耐受性的物質[48]。群體感應抑制劑一般通過阻斷信號分子的合成（圖3A）、降解群體感應信號分子（圖3B）和降低或抑制信號分子受體蛋白的活性（圖3C）來抑制群體感應的進行，從而對腐敗菌或致病菌產生抑制作用。

圖3 群體感應抑菌機制[49]Fig. 3 Antimicrobial mechanism of quorum sensing[49]

1.3.1 細菌群體感應抑制劑

銅綠假單胞菌PAO1（Pseudomonas aeruginosaPAO1）毒力因子的產生和生物膜的形成依賴于細菌群體感應系統，植物乳桿菌產生的3-苯基乳酸可以作為細菌群體感應抑制劑抑制該菌的生長[49]。此外，水楊酸是一種乳酸菌代謝產物，可以通過抑制高絲氨酸內脂合成酶的活性，阻斷信號分子的合成，抑制腐敗菌的生長（圖3A）[48]。除了抑制信號分子的合成可以有效抑制細菌群體感應，降解信號分子也可以抑制細菌群體感應。林洋等[50]發現乳酸菌培養液的粗提取物可以通過降解細菌群體感應信號分子N-?；呓z氨酸內脂抑制嗜水氣單胞菌屬生物膜的形成（圖3B），由于粗提物經蛋白酶處理失去降解作用，猜測粗提物是一種酶類。Park等[51]從泡菜中篩選出一株清酒乳桿菌NR28（Lb. sakeiNR28），這種乳酸菌雖然不能抑制大腸埃希氏菌的生長，但是可以通過抑制革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌共同利用的呋喃酮酰硼酸二酯類信號分子（autoinducer-2，AI-2）轉導途徑，對大腸埃希氏菌ATCC-43894（E. coliATCC-43894）菌株的致病性有一定的抑制作用（圖3C）。此外，乳酸乳球菌LY3-1（L. lactisLY3-1）可以產生由10 個氨基酸（序列為：ALSLVKIHGR）組成的群體感應抑制劑，有效抑制哈維氏弧菌胞外多糖、生物膜和鞭毛的合成[48]。

1.3.2 真菌群體感應抑制劑

白念珠菌是一種常見的人類條件致病菌，通常以無治病作用的酵母相和具有治病作用的菌絲相兩種形式存在。白念珠菌可以通過群體感應在這兩種形式之間轉換，隨著數量的增長，白念珠菌會由菌絲相向酵母相轉移[52]。Okkers等[53]鑒定出一種戊糖乳桿菌中的長肽TV35b，這種肽可以通過群體感應系統使白念珠菌轉化為酵母相，誘導假菌絲的形成，從而降低白念珠菌致病性并抑制其生長。

1.4 蛋白類物質

乳酸菌產生的蛋白質類化合物一般分為兩類：一類是由核糖體合成的抑菌肽，上述提到的細菌素類就屬于此類；另一類是通過蛋白酶酶解產生的肽類，而非核糖體合成，以下提及的蛋白類物質就是通過細菌蛋白酶酶解作用產生的。

Niku-Paavola等[54]在植物乳桿菌VTT E-78076（Lb.plantarumVTT E-78076）培養濾液中發現了具有抑制革蘭氏陰性菌成團泛生菌（Pantoea agglomeransVTT E-90396）和燕麥鐮刀菌VTT D-80147（Fusarium avenaceumVTT D-80147）生長的抗菌物質，其中包括細菌蛋白酶酶解產物甘氨酸-L-亮氨酸環肽。除了對細菌的抑制作用，一些報道中也提到植物乳桿菌MiLAB 393可以通過酶解作用產生一種具有抑制真菌生長的環肽（L-Phe-L-Pro），同時清酒乳桿菌、冠狀乳桿菌和戊糖片球菌酶解產生的環肽（L-Phe-trans-4-OH-L-Pro）也具有抑制真菌生長的作用[55]。而Magnusson等[56]進一步研究發現，棒狀乳桿菌Si3（Lb. coryniformisSi3）通過酶解作用產生的抑菌環肽，可以通過其疏水性基團迅速吸附到真菌細胞上，或者形成自聚體從而對霉菌和酵母菌有一定抑制作用。乳鐵蛋白是一種具有抗炎、抗氧化和抗菌等活性的蛋白質，同時也是抗菌肽的重要來源[57]。而近期的研究發現乳酸菌可以酶解乳鐵蛋白，可以產生一種抗真菌肽——乳鐵素[58]，這種物質是帶有1 個二硫鍵、多個正離子、具有疏水性和18 個殘基環的多肽，可以通過破壞真菌細胞膜和膜上質子梯度達到抑制真菌的作用[59]。而另一種乳鐵蛋白肽是由乳鐵蛋白氮端酶解掉的前11 個氨基酸殘基組成，在結構上具有高度的陽離子性質并包含疏水性的纈氨酸和色氨酸，因此也可通過破壞細胞膜來抑制白念珠菌和煙曲霉的生長[60]。此外，從阿爾及利亞傳統發酵食品中發現一種抗菌肽SSSEESII，這種物質是通過乳球菌BR16菌株胞外絲氨酸金屬蛋白酶水解牛酪蛋白得到的。經鑒定，該肽是酪蛋白αs2亞基的24～31片段，并且經實驗發現該肽對兩種革蘭氏陽性細菌（李斯特菌ATCC 33090和黃體微球菌ATCC 4698）和兩株革蘭氏陰性菌（大腸埃希氏菌ATCC 25922和腸化沙門氏菌ATCC 13076）均具有抗菌活性[61]。

1.5 其他物質

1.5.1 胞外多糖

胞外多糖是乳酸菌的一種代謝產物，可分為只含單一類型單糖單體的同聚多糖和含多種不同類型單糖單體的雜聚多糖[62]。近些年的研究中發現胞外多糖具有抑菌活性，Bajpai等[63]發現植物乳桿菌8513和BT8513產生的胞外多糖可以有效抑制金黃色葡萄球菌的生長。同時Trabelsi等[64]發現乳酸桿菌Ca6產生的胞外多糖可以有效抑制常見致病菌的生長。此外，植物乳桿菌YW32胞外多糖可以有效抑制腐敗菌和致病菌生物膜的形成，從而提高食品安全性[65]。

1.5.2 二氧化碳

乳酸菌異型發酵可產生二氧化碳，二氧化碳可以有效抑制革蘭氏陰性需氧菌和霉菌。二氧化碳的抑菌機制通過以下途徑：二氧化碳的產生可以形成厭氧環境，從而使得需氧型微生物受到抑制；并且二氧化碳可以溶于細胞液中，導致pH值下降從而導致細胞內一些酶活性下降，不僅影響了細胞代謝，還降低了細胞膜的傳遞能力[40]。

1.5.3 過氧化氫

過氧化氫是由乳酸菌中黃素氧化酶在有氧條件下產生的，并且因為大多數乳酸菌中沒有過氧化氫酶，使得過氧化氫在環境中積累，而過氧化氫可以通過氧化作用破壞羥自由基，從而抑制微生物生長[66]。

1.5.4 羅氏菌素

3-羥基丙醛又稱羅氏菌素，是羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）、布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）等在厭氧條件下分解甘油產生的一種廣譜抑菌物質，可以有效抑制革蘭氏陽性菌和陰性菌、霉菌和酵母[67]。羅氏菌素可以抑制核糖核酸還原酶活性，而這種酶是DNA合成所必需的，因此羅氏菌素可以通過干擾細菌DNA復制，來抑制細菌增殖[68]（機制類似于圖1機制四中抑制DNA復制過程）。除此之外，一些研究也發現乳酸菌代謝產物2-丙烯基酯具有抑制真菌的活性[69]。同時，乳酸菌在檸檬酸發酵過程中產生的雙乙酰，在低pH值條件下也具有抑菌作用[70]。

1.6 競爭作用

雖然乳酸菌可以產生抑菌物質，但是生成量一般低于它們各自的抑菌濃度，所以除了產生抑菌物質，推測還存在其他的抑菌途徑。營養競爭是一種重要的競爭方式，通常是指乳酸菌同腐敗菌對營養物質進行競爭，其可通過較快的速度利用營養物質，造成腐敗菌失去營養，進而生長受到抑制。這種營養競爭既可以單獨作為一種作用機制，也可以與乳酸菌產生的抑菌物質協同作用[7]。Honoré等[71]監測3 種副乳桿菌對營養物質的消耗與生長抑制的關系時發現這些乳桿菌對葡萄糖和谷氨酰胺的消耗與腐敗霉菌的生長呈負相關，進而證明了乳桿菌可以競爭利用營養物質從而導致腐敗菌缺少營養而生長受到抑制。

2 乳酸菌作為生物保護菌在食品中的應用

2.1 乳及乳制品

乳制品因其具有較低pH值、中等水分活度和豐富的營養物質極易被微生物污染而腐敗變質，其中霉菌和酵母菌是造成乳制品變質的主要微生物[72]。霉菌屬中的青霉菌屬（Penicillium）、毛霉菌屬（Mucor）和枝孢菌屬（Cladosporium），酵母菌屬中的假絲酵母屬（Candida）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）和亞羅酵母屬（Yarrowia）都是乳制品中常見有害微生物[73]。近些年的研究發現多種乳酸菌不僅可以作為生物保護菌抑制乳制品中真菌的生長，還能作為一種發酵劑賦予乳制品特殊風味。

解脂亞羅酵母（Yarrowia lipolytica）被認為是一種乳制品中很難抑制的致腐微生物，而Mieszkin等[74]發現哈爾濱乳桿菌K.V9.3.1Np（Lb. harbinensisK.V9.3.1Np）產生的代謝產物尤其是有機酸如乙酸、乳酸、2-吡咯烷酮-5-羧酸、己酸和2-羥基苯甲酸，雖然不會改變酵母細胞膜通透性，但可通過誘導酵母細胞膜去極化的方式阻止解脂亞羅酵母的生長。而且哈爾濱乳桿菌K.V9.3.1Np在對酵母有良好的抑制作用的同時不會破壞發酵乳的感官特性，因此十分適合作為一種生物保護菌應用于發酵乳的生產[75]。而Garnier等[76]從發酵乳制品中分離出的3 株乳酸菌——詹氏丙酸桿菌CIRM-BIA1774（Propionibacterium jenseniiCIRM-BIA1774）、鼠李糖乳桿菌CIRM-BIA1952（Lb. rhamnosusCIRM-BIA1952）和Mucor lanceolatusUBOCC-A-109193也被發現具有抗真菌活性。通過對這3 株乳酸菌上清液的分離和鑒定，一共發現56 種具有抗真菌活性的物質，其中含量最多的抗真菌物質是詹氏丙酸桿菌發酵產生的丙酸和乙酸，鼠李糖乳桿菌發酵產生的乳酸和乙酸以及M. lanceolatus發酵產生的丁酸。除了通過產生有機酸抑制有害微生物的生長，最新的研究發現鼠李糖乳桿菌還可以發酵酪蛋白αs2產生含有9 個氨基酸且具有抗菌活性的多肽。通過體外實驗證實了這種抗真菌肽可以有效抑制葡萄狀白霉（Mucor racemosus）和膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）的生長[76]。此外，植物乳桿菌L244、哈爾濱乳桿菌L172、短乳桿菌L128和鼠李糖乳桿菌CIRM-BIA113被應用于乳制品中抑制青霉菌和毛霉菌的生長，這些乳酸菌可以通過代謝產生乙酸、羥基苯乳酸、苯乳酸、3-苯基丙酸、3-(4-羥基苯基)丙酸和5-氧吡啶-2-羧酸、二乙?；?、乙酰乙酸等達到抑制真菌的目的[77]。

2.2 肉及肉制品

肉及肉制品含有豐富的營養物質及大量的水分，因此在加工、貯藏和銷售環節很容易受到假單胞菌、大腸埃希氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等有害微生物的污染[78]。腸桿菌科、假單胞菌和熱殺索絲菌是真空包裝生牛肉切片在4 ℃貯藏過程中的主要腐敗菌，其中假單胞菌隨著貯藏時間的延長逐漸成為優勢腐敗菌，而Zhang Yimin等[79]發現在真空包裝牛肉切片中接種清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌可以顯著抑制腸桿菌科、假單胞菌和熱殺索絲菌3 種腐敗菌的生長，并且能夠有效降低生牛肉切片微生物的多樣性及貯藏過程中揮發性鹽基氮類物質的產生。Orihuel等[80]發現腸球菌CRL35（Enterococcus mundtiiCRL35）因產生一種蛋白類物質，可以抑制大腸埃希氏菌O157:H7 NCTC12900（E. coliO157:H7 NCTC12900）氨基酸和核苷酸的代謝和運輸，從而導致大腸埃希氏菌生長受阻，同時添加腸球菌也可以有效降低大腸埃希氏菌胞外基質蛋白的黏附能力，使大腸埃希氏菌致病性降低。此外，Li Peijun等[81]將發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）接種到灌腸原料中，發現發酵乳桿菌不僅可以有效抑制其中肉桿菌屬、熱殺索絲菌屬和糞腸球菌屬等腐敗菌的生長，還可以將高鐵肌紅蛋白轉化為紅色的亞硝基亞鐵肌紅蛋白，使肉色得到改善。正是因為發酵乳桿菌在灌腸原料中的抑菌作用和護色作用，其被認為是一種亞硝酸鹽的替代物在肉制品生產中具有潛在應用價值。乳酸菌作為生物保護菌除了可以應用于冷鮮肉和原料肉中還可以應用于熟肉制品中，徐梅[82]將生物保護菌清酒乳桿菌B2（Lactobacillus sakeiB2）和植物乳桿菌R2（Lactobacillus plantarumR2）噴涂于切片低鹽香腸表面，結果表明在貯藏期間兩種生物保護菌能明顯改善香腸的菌群結構，顯著抑制假單胞菌和熱殺索絲菌的生長，有效延長香腸的貨架期；同時，能有效緩解香腸貯藏過程中的脂肪氧化和蛋白氧化，提高了產品的感官品質。此外，Danielski等[83]在研究熟火腿保鮮時，發現將乳酸菌麥芽香肉桿菌作為生物保護菌添加到產品中，可以有效抑制單核細胞增生李斯特菌的生長，提高食品安全性。

2.3 水產品

與肉制品類似，水產品富含蛋白質和不飽和脂肪酸等營養物質，易受到微生物污染發生腐敗變質[84]。為了防止因水產品的腐敗而造成的浪費和安全問題，乳酸菌作為生物保護菌近幾年被廣泛用于水產品中。其中乳酸乳球菌是一種良好的生物保護菌，Ibrahim等[85]將乳酸乳球菌添加到真空包裝生三文魚中后發現乳酸乳球菌不僅可以顯著延長產品貨架期，而且不會改變產品原有感官特性。除此之外，一株可以產生細菌素的戊糖乳桿菌也被應用于生鮮三文魚片保鮮，其可以控制魚肉中嗜水氣單胞菌和單核細胞增生李斯特菌的生長，并且即使冷鏈遭到破壞也可以起到保護作用[86]。除了應用于生鮮水產品中，乳酸菌作為生物保護菌還被應用于加工后的水產品中。Saraoui等[87]將魚乳球菌CNCM I-4031（L. pisciumCNCM I-4031）和廣布肉桿菌V41（Carnobacterium divergensV41）應用于氣調包裝去皮熟蝦的8 ℃貯藏過程中，研究發現兩株乳酸菌作為生物保護菌可以有效抑制單核細胞增生李斯特菌、希瓦氏菌和腸桿菌的生長。并且魚乳球菌CNCM I-4031除了可以抑制微生物的生長，還可以有效消除不良風味物質，減緩去皮熟蝦貯藏過程中的品質劣變。此外，Aymerich等[88]研究表明清酒乳桿菌CTC494（Lb. sakeiCTC494）、彎曲乳桿菌CTC1742（Lb. curvatusCTC1742）和麥芽香肉桿菌CTC1741（Carnobacterium maltaromaticumCTC1741）在熏魚貯藏過程中可作為生物保護菌延長其貨架期。其中，雖然彎曲乳桿菌和麥芽香肉桿菌可以利用肉中蛋白產生類細菌素物質來增強抑菌能力，但這3 種乳酸菌中清酒乳桿菌保護作用最強，在貯藏期間可以有效抑制單核細胞增生李斯特菌的生長，而彎曲乳桿菌則只能減緩單核細胞增生李斯特菌的增長速度，相對以上兩種乳酸菌麥芽香肉桿菌作為生物保護菌應用范圍較窄，雖然在體外實驗中表現出了抗菌活性，但僅在熏魚產品中發現其抑菌性能，而在其他實際產品中還沒有呈現出顯著抑菌效果。

2.4 水果及蔬菜

新鮮果蔬由于富含有益于人體健康的物質（例如維生素、礦物質和膳食纖維等）深受消費者喜愛。但新鮮果蔬容易受到微生物污染，貨架期相對較短。而常用的熱加工處理和添加化學防腐的殺菌方法會破壞果蔬的感官和營養特性89]。相比之下，將生物保護菌——乳酸菌噴涂在果蔬表面因既不會破壞果蔬品質和營養，又可以起到抑制有害微生物的作用，而深受研究者青睞。Ma Jiahong等[90]將棲樹汁乳桿菌JT03（Lb. sucicolaJT03）和乳酸片球菌JY03（Pediococcus acidilacticiJY03）應用于防治柑橘霉菌病中，研究發現這兩種乳酸菌可以利用產生的蛋白類抑菌物質來抑制指狀青霉的生長。除了霉菌之外，單核細胞增生李斯特菌也是果蔬中常見的有害細菌。Trias等[91]在對10 株腸系膜明串珠菌（Ln.mesenteroides）和1 株檸檬明串珠菌（Ln. citreum）對抗單核細胞增李斯特菌的實驗中發現，這11 株明串珠菌一般通過產生有機酸、過氧化氫和細菌素等抑菌物質來抑制單核細胞增生李斯特菌的生長。而這11 株明串珠菌中的2 株腸系膜明串珠菌CM135和CM160因其可以產生IIa類細菌素而對單核細胞增生李斯特菌有更好的抑制作用。同時在模擬金冠蘋果和生菜葉被單核細胞增生李斯特菌污染的實驗中，這兩株腸系明串珠菌同樣表現出對單核細胞增生李斯特菌明顯的抑制作用。

3 結 語

乳酸菌作為生物保護菌可以通過多種機制抑制食品中細菌和真菌生長，降低食源性微生物腐敗和致病風險，可以有效延長食品保質期。并且大量的研究已經證實乳酸菌在食品中除了具有抑菌活性，還具有降解真菌毒素、降低不良風味、改良食品顏色和賦予食品特殊風味等作用。因此乳酸菌作為生物保護菌應用于食品中日益受到研究者青睞。

然而由于乳酸菌種類較多，代謝方式多樣，代謝物種類豐富，目前研究多集中在小分子代謝物及其抑菌機制，而對蛋白類物質研究較少，因此針對乳酸菌產生的蛋白類抑菌物質及其抑菌機理有待進一步的探究。與此同時，乳酸菌已被證實對很多細菌和真菌有抑制作用，但是很少有研究關注乳酸菌作為生物保護菌添加到食品中后，乳酸菌自身對食品感官、風味和營養等性質的影響，而這一問題將會成為乳酸菌作為商用生物保護菌必須考慮的問題。此外，乳酸菌作為生物保護菌通常被應用于發酵制品和原料食品保鮮中，擴展生物保護菌的應用范圍也是未來研究和應用中的重點。