針灸對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及主要病理特征的影響

鄧曉妮，杜艷軍，2，劉欣媛，陶一鳴，王麗，吳文輝，葉成

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，占癡呆的50%～75%[1-2]。AD不僅給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，也是老年群體殘疾和死亡的主要原因之一，其確診后生存年限僅為3～11年[3]。據(jù)報(bào)道顯示AD死亡的人數(shù)從2000年到2013年增加了71%，而同一時(shí)期心臟病的死亡率降低了14%[4]。

AD病理特征以β淀粉樣蛋白(Amyloid-β，Aβ)異常沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles，NFTs)、神經(jīng)元丟失過(guò)多為主，此三大病理特征相互影響，推動(dòng)AD疾病的發(fā)生與發(fā)展。針灸是防治AD的有效手段，基于針灸治療AD取穴規(guī)律及目前臨床針灸醫(yī)生的實(shí)際運(yùn)用[5-6]，選取百會(huì)、神門(mén)、腎俞三穴，觀察針灸對(duì)SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力、海馬區(qū)β淀粉樣蛋白1-42(βamyloid protein 1-42,Aβ1-42)、細(xì)胞內(nèi)微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein Tau，Tau)水平以及神經(jīng)元特異性核蛋白(Neuronal nuclei，NeuN)表達(dá)的影響，為臨床針灸防治AD提供更多的實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6月齡SPF級(jí)雄性SAMP8小鼠12只，SAMR1雄性小鼠6只，體質(zhì)量20～25g，小鼠購(gòu)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0010。②主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：Aβ1-42(25524-1-AP)：武漢三鷹生物公司；Tau抗體(AF6141)：AFFINITY公司；Neun(ABN78)：美國(guó)Millipore公司；一次性無(wú)菌針灸針(0.18mmx13mm)：蘇州針灸用品有限公司；艾條(直徑0.4cm)：湖香艾生物科技有限公司；Morris水迷宮系統(tǒng)：成都泰盟科技有限公司；RM2016型病理切片機(jī)：上海徠卡儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.2 方法 ①實(shí)驗(yàn)分組：SAMP8小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和針灸治療組，SAMR1小鼠作為對(duì)照組，每組均為6只。②針灸干預(yù)：參照李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]，針灸治療組定取百會(huì)(頂骨正中)、神門(mén)(腕橫紋尺側(cè)處)、腎俞(第二腰椎下兩旁)。一次性針灸針(直徑0.18mm、長(zhǎng)13mm)針刺小鼠百會(huì)(向前平刺1～2mm)和神門(mén)(直刺1～2mm)，上述兩穴皆行平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)手法，360°/次，1次/s，運(yùn)針30s出針。出針后于雙側(cè)腎俞穴上方2～3cm處懸灸，使局部溫度維持在(41±0.5)℃,持續(xù)15min。上述干預(yù)方法每天1次，6d為1個(gè)療程，共計(jì)4個(gè)療程，療程間間隔1d。對(duì)照組、模型組在相同時(shí)間以相同方法束縛而不用針灸治療。

1.3 檢測(cè)指標(biāo) ①M(fèi)orris水迷宮實(shí)驗(yàn)：治療結(jié)束24h后進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。實(shí)驗(yàn)方法主要參照文獻(xiàn)[8]，包括：a.定位航行實(shí)驗(yàn)：測(cè)試時(shí)將小鼠分別從水池各個(gè)象限入水點(diǎn)面對(duì)池壁投入水中，記錄其在規(guī)定時(shí)間(60s)內(nèi)找到平臺(tái)所需時(shí)間(潛伏期)，如果小鼠在規(guī)定時(shí)間內(nèi)未找到平臺(tái)，引導(dǎo)上平臺(tái)，停留10s，時(shí)間記為60s，連續(xù)測(cè)試5d。b.空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤除平臺(tái)，將小鼠從原平臺(tái)所在象限的對(duì)位象限入水點(diǎn)面對(duì)池壁投入水中，記錄 60 s 內(nèi)原平臺(tái)象限停留時(shí)間和跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)。②免疫組化染色:Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束24h后，小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后用0.9%氯化鈉溶液快速?gòu)男募獬鲃?dòng)脈方向注入，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，肝臟發(fā)白后，將溶液換為4%多聚甲醛進(jìn)行固定，以脖子、尾巴僵硬為度，取全腦，放入4%多聚甲醛4℃固定備用。組織包埋，切片脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，運(yùn)用過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，血清封閉后滴加NeuN(1∶500)、Aβ1-42(1∶100)一抗工作液，滴加二抗，洗片，滴加新鮮配制的DAB顯色液、Harris蘇木素復(fù)染后，進(jìn)行脫水、中性樹(shù)膠封片，最后采集圖像，分析其平均光密度(optical density,OD)。③免疫蛋白印跡：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束24h后，小鼠用4%水合氯醛腹腔注射麻醉后立刻斷頭處理，于冰袋上開(kāi)顱取腦，分離出海馬組織放入凍存管，再置入液氮，保存于-80℃冰箱備用。取出組織，滴加細(xì)胞裂解液，收集上清，提取海馬蛋白，使用BCA法測(cè)定樣品蛋白濃度，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳、300mA恒流轉(zhuǎn)膜、滴加Tau、β-actin抗體4℃過(guò)夜，沖洗后滴加二抗，室溫孵育30min，滴加配制的ECL混合溶液然后曝光，最后將膠片進(jìn)行掃描存檔，運(yùn)用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 干預(yù)結(jié)束24h后Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，自第2天始，與對(duì)照組比較，模型組的潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01)；針灸治療組與模型組相比，潛伏期縮短(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 3組水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期比較

與對(duì)照組比較，模型組原平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短(P<0.01),穿越平臺(tái)次數(shù)較少(P<0.01)；與模型組比較，針灸治療組原平臺(tái)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)較多(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 水迷宮實(shí)驗(yàn)中3組穿越平臺(tái)次數(shù)與原平臺(tái)象限滯留時(shí)間比較

2.2 免疫組化染色 干預(yù)結(jié)束后，模型組海馬Aβ1-42陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)(P<0.01)；針灸治療組與模型組相比海馬Aβ1-42陽(yáng)性表達(dá)減弱(P<0.01)。見(jiàn)表3、圖1。

對(duì)照組 模型組 針灸治療組

模型組海馬NeuN陽(yáng)性表達(dá)較對(duì)照組降低(P<0.01)；針灸治療組與模型組相比海馬NeuN陽(yáng)性表達(dá)增加(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

對(duì)照組 模型組 針灸治療組

表3 3組海馬CA3區(qū)Aβ1-42、NeuN平均光密度值比較

2.3 免疫蛋白印跡 干預(yù)28d后，與對(duì)照組比較，模型組海馬Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.01)；與模型組比較，針灸治療組海馬Tau蛋白相對(duì)表達(dá)量相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖3。

表4 3組海馬Tau蛋白表達(dá)比較

圖3 各組小鼠海馬Tau蛋白表達(dá)

3 討論

AD是老年人群中最常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型[9]，分為家族性AD和遲發(fā)型AD，其中家族性AD在AD患者中占比不到5%，大多數(shù)AD患者則是與衰老密切相關(guān)，在遺傳以及環(huán)境等因素相互作用下所引發(fā)的遲發(fā)型AD[10]。SAMP8 AD模型小鼠是從AKR/J小鼠培養(yǎng)所得的自然變異小鼠，總共有12個(gè)自交系，包括9個(gè)快速衰老的的SAMP系和3個(gè)抗快速衰老的SAMR系。P系均表現(xiàn)出與老化相關(guān)特定疾病的表型，如表現(xiàn)出與老年淀粉樣變性病相關(guān)特征的SAMP1，與老年性骨質(zhì)疏松癥表征相同的SAMP6[11]，SAMP8則表現(xiàn)出與年齡相關(guān)的進(jìn)行性學(xué)習(xí)記憶功能障礙[12]，其具有的疾病表征與遲發(fā)型AD類(lèi)似的。也正因?yàn)镾AMP8是加速衰老且與遺傳以及環(huán)境等諸多因素相互作用所得的一種AD模型[13-14],而不是基因突變必然所致，與其他AD模型相比較更符合臨床實(shí)際，故本實(shí)驗(yàn)選取SAMP8作為研究模型。百會(huì)穴、神門(mén)穴、腎俞穴是目前針灸臨床治療AD首選的三個(gè)要穴，通過(guò)對(duì)古代文獻(xiàn)及現(xiàn)代研究運(yùn)用的相關(guān)數(shù)據(jù)挖掘與規(guī)律分析[5-6]，也已證實(shí)此三穴對(duì)AD防治的重要性、有效性。故本研究選取百會(huì)、神門(mén)、腎俞三穴。

Morris 水迷宮是英國(guó)心理學(xué)家Morris首次設(shè)計(jì)并長(zhǎng)期用于檢測(cè)空間認(rèn)知能力研究的首選經(jīng)典實(shí)驗(yàn)[15]，在中醫(yī)針灸防治各類(lèi)學(xué)習(xí)記憶障礙相關(guān)疾病研究中，也常常被用以評(píng)價(jià)治療效應(yīng)。本研究結(jié)果表明與模型組相比，針灸治療組小鼠潛伏期縮短、原平臺(tái)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)增加。證實(shí)針灸百會(huì)、神門(mén)、腎俞穴能夠促進(jìn)SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力恢復(fù)。

目前AD發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)眾多，但仍主要圍繞Aβ異常沉積、NFTs、神經(jīng)元丟失過(guò)多三大病理特征，因它們是導(dǎo)致認(rèn)知能力下降的直接原因。Aβ有Aβ1-40和Aβ1-42兩種亞型存在，Aβ1-42疏水性較Aβ1-40強(qiáng)，更容易沉積形成老年斑[16]。老年斑分為彌散性斑塊和核心斑塊，有研究表明在tgAPPSwe基因小鼠大腦彌散性斑塊中含有大量Aβ1-42，而Aβ1-40含量較少，隨著斑塊的逐漸成熟，Aβ1-40含量增加，可以推測(cè)在AD病理中Aβ1-42的疏水性能促進(jìn)Aβ1-40的沉積，Aβ1-42較Aβ1-40在AD疾病的發(fā)生與發(fā)展中起到了更重要的作用[17]。Aβ1-42是一種小分子(4 kDa)神經(jīng)毒性肽，是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，是在β-和γ-分泌酶的作用下從β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)水解而來(lái)[18]，在正常情況下其處于動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)APP在某些因素下使得產(chǎn)生和清除失衡，使得Aβ1-42大量增多并異常沉積，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生多種毒性作用[19]，包括氧化應(yīng)激和神經(jīng)元離子穩(wěn)態(tài)失衡[20-21]。同時(shí)沉積的Aβ1-42改變?nèi)缣窃铣擅讣っ?3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)、細(xì)胞周期素依賴(lài)蛋白激酶5(Cyclin—dependent Kinase 5,cdk5)、蛋白激酶 A(Protein kinase A,PKA)等激酶的活性，導(dǎo)致Tau蛋白的過(guò)度磷酸化，并最終導(dǎo)致NFTs的形成[22-24]。

微管是一種用于正向運(yùn)動(dòng)動(dòng)力蛋白和負(fù)向運(yùn)動(dòng)動(dòng)力蛋白輸送的重要細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在維持神經(jīng)元軸突微結(jié)構(gòu)及軸突運(yùn)輸中具有重要作用[25]。Tau蛋白作為一種磷蛋白用以組成微管，其生物活性受磷酸化狀態(tài)調(diào)節(jié)，異常磷酸化會(huì)使Tau蛋白失去其應(yīng)有的生物活性，從微管中脫落，并以雙股螺旋絲(Paired helical fliament,PHF)形成NFTs在細(xì)胞內(nèi)聚集，導(dǎo)致神經(jīng)元軸突運(yùn)輸障礙。此外有研究表明過(guò)度磷酸化的Tau蛋白對(duì)神經(jīng)新生起抑制作用，Houben[26]等研究發(fā)現(xiàn)Tau轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型小鼠相比，海馬齒狀回顆粒層體積以及顆粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少，同時(shí)未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物DCX和細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67表達(dá)明顯減少，而Tau基因敲除小鼠未出現(xiàn)上述情況，提示Tau蛋白過(guò)度磷酸化抑制海馬神經(jīng)新生。

神經(jīng)元的丟失是AD主要病理特征之一[27]，在AD患者腦內(nèi)廣泛存在，其中以海馬神經(jīng)元丟失最為嚴(yán)重，平均減少高達(dá)47%[28]。海馬分為齒狀回(Dentategyrus,DG)、CA1、CA2、CA3以及CA4五個(gè)區(qū)域，鐘炳武[29]等研究發(fā)現(xiàn)在AD模型大鼠中，海馬CA3區(qū)APP陽(yáng)性表達(dá)高于正常組，此外有研究表明在AD小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元中Aβ1-42陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)其他區(qū)域增加，表明Aβ1-42沉積在CA3區(qū)神經(jīng)元中最為嚴(yán)重[30]。成人神經(jīng)干細(xì)胞仍有增殖分化的潛能，彌補(bǔ)生理狀態(tài)下的神經(jīng)元丟失，但AD患者神經(jīng)新生的速度趕不上神經(jīng)元丟失的速度，致使神經(jīng)元大量丟失。神經(jīng)元是學(xué)習(xí)記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)，海馬是大腦中與認(rèn)知緊密相關(guān)的區(qū)域，神經(jīng)元大量丟失也是患者認(rèn)知障礙的重要因素。由此可見(jiàn)，Aβ1-42引發(fā)的毒性直接或間接誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞死亡，增強(qiáng)Tau蛋白的過(guò)度磷酸化抑制神經(jīng)新生、導(dǎo)致突觸功能障礙，使得神經(jīng)元大量丟失，最終導(dǎo)致認(rèn)知能力下降。本研究結(jié)果顯示與模型組相比，針灸治療組海馬CA3區(qū)Aβ1-42沉積減少，海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)量增加，海馬Tau蛋白水平降低，表明針灸百會(huì)、神門(mén)、腎俞三穴能夠降低海馬Aβ1-42沉積，降低神經(jīng)元毒性作用，減少神經(jīng)元死亡，同時(shí)Aβ1-42沉積減少降低Tau蛋白水平，減少其對(duì)海馬神經(jīng)元新生的抑制作用，從而發(fā)揮針灸抑制SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少的作用。

綜上所述，針灸百會(huì)、神門(mén)、腎俞三穴能明顯改善SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，其作用可能與減少Aβ1-42聚集，降低Tau蛋白水平，抑制神經(jīng)元數(shù)量減少有關(guān)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。