牛乳中乳過氧化物酶活性的影響因素

花榜清

（乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436）

乳過氧化物酶是哺乳動物血紅素過氧化物酶家族的一員[1]，存在于哺乳動物的分泌液中，如乳汁、唾液、淚液等[2]。乳過氧化物酶是一種分子質量約80 kDa的單體糖蛋白[3]，主要通過過氧化氫催化硫氰酸根離子的氧化，從而生成具有廣泛抗菌活性的反應產物[4-6]，不同哺乳動物乳汁中的乳過氧化物酶含量不同。乳過氧化物酶還參與機體免疫防御[7-9]，降低某些癌癥風險[10-11]，在醫藥行業的應用上具有較大潛力。

乳過氧化物酶是牛乳中天然存在的酶，對熱的敏感性使其成為牛乳和乳制品熱處理是否過度的重要指標。原料乳中含有很多致病微生物，通過合適、有效的熱處理確保牛乳在保質期內沒有病原微生物至關重要[12]。 合適的巴氏殺菌工藝應在有效殺滅病原性微生物的同時，產生最低程度的化學、物理及感官變化，最大程度保證營養物質不被破壞。過強的熱處理往往會使牛乳中活性營養素失活，降低牛乳本身的營養價值[13]。乳過氧化物酶是牛乳中熱穩定性相對較強的酶，在巴氏殺菌（72 ℃、15 s）條件下，耐熱球菌、結核桿菌和大腸桿菌等病原性微生物被滅活的同時，乳過氧化物酶只會損失20%～30%的活性，并不會完全失活[14]。因此，乳過氧化物酶活性可以體現巴氏殺菌過程中是否存在過度熱加工、熱處理等現象，是乳品加工業一個非常重要的指標。

除了熱處理能有效殺滅病原菌外，早在1987年， Piot等[15]就將無機膜用于全脂牛乳的過濾除菌，并取得了良好的效果。由于牛乳中脂肪粒徑與細菌大小較接近，單用膜過濾進行除菌不能滿足商業化生產，因此目前采用的技術是先將乳脂肪分離出來，將脫脂乳進行膜過濾除菌，分離后的稀奶油單獨進行熱處理殺菌，最后將二者混合，該工藝的除菌率可以達到99.8%～99.9%，同時能保留更多的熱敏感性營養物質[16]。

本研究采用ISO/TS 17193：2011《乳過氧化物酶活性測定 光度法》[17]測定不同殺菌工藝的牛乳中乳過氧化物酶活性，并探究牛乳中乳過氧化物酶活性在不同貯藏溫度、時間下的變化，為乳品行業中更高品質的鮮乳加工開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品 光明牧業申豐牧場。

二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；質量分數30%過氧化氫溶液（分析純） 天津市天力化學試劑有限公司； 2,2’-聯氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）（生物技術級） 上海麥克林生化科技有限公司；實驗室用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

GNP-9270隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；TE612-L電子天平 美國Sartorius公司；Avanti J-301高效離心機 美國Beckman Coulter有限公司； pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Specord 205紫外分光光度計 德國耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 緩沖溶液的配制

將0.72 g二水磷酸氫二鈉和3.99 g磷酸二氫鉀置于燒杯中，加入約450 mL去離子水溶解，調節溶液pH值至6.00±0.03，將溶液轉移至500 mL容量瓶中，加去離子水定容。

1.3.2 過氧化氫溶液的配制

吸取100 μL質量分數30%的過氧化氫溶液至100 mL容量瓶中，定容。

1.3.3 ABTS溶液的配制

稱取55 mg ABTS于50 mL容量瓶中，加入約30 mL上述緩沖溶液溶解，再添加1.0 mL上述過氧化氫溶液，用上述緩沖溶液定容。

1.3.4 不同殺菌工藝對牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

取原料乳，分別經75、85、125 ℃加熱15 s的殺菌工藝以及低溫陶瓷膜過濾工藝處理，冷卻后冷藏備用。分別測定原料乳和經不同殺菌工藝處理后樣品的乳過氧化物酶活性。

1.3.5 濃縮或脫脂工藝對牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

取原料乳進行蒸發濃縮，再經75 ℃、15 s熱處理，冷卻后冷藏備用；取原料乳進行離心脫脂，再經75 ℃、15 s熱處理，冷卻后冷藏備用。分別測定原料乳和經不同濃縮或脫脂工藝處理后樣品的乳過氧化物酶活性。

1.3.6 貯藏溫度和時間對牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

分別取3 份原料乳，經75 ℃、15 s熱處理后分別放置于5、20、30 ℃條件下，再分別取不同溫度下放置0、6、12、24、48、72、96、168、240 h的樣品，測定乳過氧化物酶活性。

1.3.7 牛乳樣品稀釋液的制備

將待測牛乳樣品恢復至室溫，加入一定比例的水稀釋。其中將原料乳用水稀釋40 倍，鮮牛乳稀釋20 倍，高溫滅菌乳和超高溫滅菌乳不稀釋。

1.3.8 牛乳中乳過氧化物酶活力的測定

取2 mL 2 mmol/L ABTS溶液至塑料比色皿中，蓋上蓋子，置于25 ℃水浴鍋中，添加50 μL稀釋后的牛乳樣品，立即蓋上比色皿并混合，快速放入已經預熱至25 ℃的分光光度計中，15 s內測定420 nm波長處的吸光度（A1），2 min后再次記錄吸光度（A2）。牛乳中乳過氧化物酶活力按式（1）計算。

式中：V1為總待測體積（2.05 mL）；V2為牛乳樣品體積（0.05 mL）；ε為摩爾吸光系數（ε=43.2 L/（mol·cm））； d為比色皿的路徑長度（1.0 cm）；n為稀釋倍數；1 000為換算系數；2為化學計量系數。

1.3.9 牛乳中乳過氧化物酶活性損失率計算

牛乳中乳過氧化物酶活性損失率按式（2）計算。

式中：a1為生乳中乳過氧化物酶活力/（U/L）； a2為經過不同工藝處理后樣品中乳過氧化物酶活力/（U/L）。

1.4 數據處理

運用Excel軟件對實驗數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌工藝牛乳中乳過氧化物酶活性

實驗結果表明，原料乳經85 ℃或125 ℃加熱15 s后幾乎檢測不到乳過氧化物酶活性，而經75 ℃加熱15 s以及低溫陶瓷膜過濾處理后的牛乳均能檢測出較強的乳過氧化物酶活性。

由圖1可知，經低溫陶瓷膜過濾處理的牛乳乳過氧化物酶活性損失率明顯小于經75 ℃、15 s巴氏殺菌處理的牛乳，能保留更多的熱敏感性物質。

2.2 經濃縮或脫脂工藝后牛乳中乳過氧化物酶活性

由圖2可知，直接進行75 ℃、15 s巴氏殺菌后的全脂牛乳中乳過氧化物酶活性損失率集中在61%～65%，原料乳經降膜濃縮再進行75 ℃、15 s巴氏殺菌后的濃縮牛乳的乳過氧化物酶活性損失率集中在61%～65%和66%～70%，原料乳經部分脫脂或全部脫脂再進行75 ℃、15 s巴氏殺菌后的減脂牛乳的乳過氧化物酶活性損失率更多集中在71%～75%，可能過多的工藝流程會增加牛乳中乳過氧化物酶的損失。另外，零脂牛乳的乳過氧化物酶活性損失率在71%～75%的樣品數更多，這可能是由于乳脂離心過程中有部分乳過氧化物酶處于脂肪層，表明同樣的熱處理條件下，隨著工藝步驟增多，乳過氧化物酶的活性會有所降低。

圖2 經濃縮或脫脂工藝處理后牛乳中乳過氧化物酶活性損失率變化Fig. 2 Change of lactoperoxidase activity in milk after concentration or defatting

2.3 貯藏溫度和時間對牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

經過對樣品的氣味和外觀觀察發現：巴氏殺菌乳5 ℃條件下貯藏10 d未出現明顯的氣味和性狀改變；20 ℃條件下貯藏5 d時有輕微異味，未發現明顯結塊；30 ℃條件下貯藏5 d時有輕微異味和少量結塊。原料乳在5 ℃條件下貯藏10 d時出現輕微異味，部分結塊；20 ℃條件下貯藏3 d時就出現了輕微異味，同時有白色絮狀懸浮物，貯藏5 d時，則有較強烈的異味同時結塊變多，甚至有凝固現象；30 ℃條件下貯藏2 d時就出現了輕微異味同時伴有少量結塊。

圖4 貯藏溫度和時間對巴氏殺菌乳中乳過氧化物酶活力的影響Fig. 4 Effect of storage temperature and time on the activity of lactoperoxidase in pasteurized milk

由圖3～4可知，牛乳在不同貯藏溫度下，乳過氧化物酶活力變化較大，隨著貯藏時間的延長，乳過氧化物酶活力逐漸降低，牛乳中的微生物逐漸繁殖直至牛乳發生變質，無法食用。由于原料乳本身含有較多的微生物，因此在相同貯藏溫度下更容易變質，同時乳過氧化物酶活力降低也更快。因此，乳過氧化物酶的活性也能間接反映牛乳中微生物的生長狀況。原料乳和巴氏殺菌乳乳過氧化物酶活力在貯藏24 h內都出現了下降后上升的現象，這與Fonteh等[18]的研究結果一致，但具體的原因尚未明確，可能與乳過氧化物酶同工酶的存在有關系。

圖3 貯藏溫度和時間對原料乳中乳過氧化物酶活力的影響Fig. 3 Effect of storage temperature and time on the activity of lactoperoxidase in raw milk

3 結 論

近年來，隨著我國現代物流業的迅速發展及冷鏈的逐漸完善，人們的生活水平與消費水平也在不斷提高，從最初追求牛乳的香濃與口味再到現在逐漸回歸牛乳的自然屬性而更加傾向于選擇風味新鮮和奶味純正的巴氏殺菌乳。巴氏殺菌乳是采用低溫巴氏殺菌法加工而成的產品，既能夠達到安全的飲用標準，又能較好保留原料乳中的營養物質和風味，從而廣受消費者的喜愛[19-21]。

通過研究不同工藝下乳過氧化物酶的活性發現，經85 ℃或125 ℃加熱15 s后的牛乳幾乎檢測不到乳過氧化物酶活性，而經75 ℃加熱15 s以及低溫陶瓷膜過濾處理后的牛乳均能檢測出較強的乳過氧化物酶活性，經低溫陶瓷膜過濾處理后的牛乳中乳過氧化物酶活性損失率更低。原料乳經部分脫脂或全部脫脂再進行75 ℃、15 s巴氏殺菌后樣品中的乳過氧化物酶活性損失率比未經過脫脂的樣品更高；經巴氏殺菌處理后的牛乳中乳過氧化物酶活性在低溫貯藏條件下更易保留。

本研究通過測定不同工藝及不同貯藏條件下牛乳中乳過氧化物酶活性變化，為巴氏殺菌乳的品質提升提供一定的參考，從而為消費者帶來更好的產品。