不同新型冠狀病毒核酸檢測試劑（熒光PCR法）的選擇和臨床應用

沈默 周武 梁敏 王忠永

隨著對新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019,COVID-19）的不斷了解，人們對于新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARSCoV-2）核酸檢測的認識也逐步深入。實時熒光PCR檢測SARS-CoV-2核酸陽性是COVID-19確診患者的主要診斷標準之一[1-3]。但在臨床實際應用中，核酸檢測“假陰性”的質疑也使核酸檢測試劑盒的質量和性能備受關注。核酸檢測容易受到各種因素，如病程、實驗方法學、人員因素、采樣、運送及保存及病毒本身變異等影響，檢測試劑性能也是重要的影響因素之一[4]。本研究對早期取得注冊證并已在臨床使用的幾種熒光PCR法SARS-CoV-2核酸檢測試劑進行性能比較，發現不同品牌試劑間存在一定差異，提示臨床診療過程中需對試劑性能差異造成的結果不同引起高度重視，實驗室應加強對不同品牌、不同批號試劑的評估，選擇適宜的檢測方案，以利于SARSCoV-2核酸檢測結果更好地應用于臨床。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2020年1月24日至3月20日溫州醫科大學附屬第一醫院檢測樣本共3 284例，以咽拭子和糞便標本為主，陽性樣本數180例，陽性率為5.48%。利用1例隔離病房確診COVID-19患者采集的咽拭子陽性標本提取的RNA模板，對市場上華大生物科技（武漢）有限公司（批號：6020200209）、上海之江生物科技有限公司（批號：P20200205）、上海伯杰醫療科技有限公司（批號：20200202A）、上海捷諾生物科技有限公司（批號：COV2020008）4種不同品牌試劑（分別為A、B、C、D試劑）進行評價分析。以選用C試劑為主，A試劑作為復檢備用試劑的檢測方案在國家衛生健康委員會臨床檢驗中心的12個室間質評樣本檢測中的應用進行分析。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 EX3600全自動核酸提取儀、MVR01核酸提取試劑（上海之江生物技術有限公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司），4種不同品牌的SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒均為國家藥品監督管理局審批通過的熒光PCR法檢測試劑；病毒采樣管（友康恒業生物科技有限公司，型號MT0301-1）。

1.2.2 檢測方法

1.2.2.1 標本采樣 用病毒采樣管中拭子適度用力拭抹咽后壁部位，應避免觸及舌部；迅速將無菌拭子放入采集管中，在靠近頂端處折斷無菌拭子桿，旋緊管蓋封閉[5]。

1.2.2.2 核酸提取 核酸提取嚴格按照試劑說明書操作。提取試劑貨號：Z-ME-0044，型號：MVR01，批號：P20200104。本研究主要評估核酸擴增試劑的性能，故統一采用上海之江生物科技股份有限公司的自動提取儀器和提取試劑進行核酸提取，利用提取后的核酸模板進行平行試驗驗證。

1.2.2.3 標本稀釋 確診患者標本核酸模板采用DEPC 水進行 1×、10×、100×、1 000×、10 000×的梯度稀釋（各稀釋度樣本分別用a～e表示），備用。

1.2.2.4 核酸擴增 根據不同品牌試劑說明書，在ABI 7500熒光定量PCR儀設置相應反應程序后擴增檢測。不同試劑檢測目的基因靶標不同（包括了ORF1ab/RdRp、N和E基因），評估的4種試劑中1種試劑檢測單靶標，2種試劑檢測雙靶標，1種試劑檢測三靶標；3種試劑含內標。擴增體系中模板加樣量1種試劑為10 μl，其余均為5 μl。最低檢測限1種試劑為100 copies/ml，1 種試劑為 500 copies/ml，2 種試劑為1 000 copies/ml。陽性判讀標準參考各試劑說明書。質量控制：每批試驗均帶陰性和陽性對照，陰性和陽性對照檢測結果在控，則該批次試驗有效，反之無效。所有檢測均進行3次重復，取平均循環閾值（cycling threshold,Ct）進行計算。

1.3 國家衛生健康委員會臨床檢驗中心室間質評標本檢測 使用本實驗室常規配套使用的兩種檢測試劑（C+A）對2020年3月下發的編號為202001-202012的12個樣本進行檢測，樣本提取方法見1.2.2.2，檢測過程完全按照C試劑和A試劑的說明書進行。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。對SARS-CoV-2 ORF1ab/RdRp基因的A～D試劑擴增組Ct值比較采用隨機區組設計的秩和檢驗。不同品牌試劑的批內重復性用變異系數（CV）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4種試劑重復檢測結果比較 4種試劑的基本情況見表1。4種試劑目標靶基因ORF1ab/RdRp的重復檢測結果Ct值見表2。SARS-CoV-2 ORF1ab/RdRp基因的A～D試劑擴增組Ct值比較差異有統計學意義（P＜0.001）。進一步進行兩兩比較，除了B試劑與D試劑差異無統計學意義（P＞0.05），其余試劑兩兩比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。按照4種品牌試劑說明書的陽性判斷標準，A試劑5個稀釋度標本檢測結果均為陽性，其余試劑1×、10×、100×稀釋度檢出陽性結果，低濃度RNA模板標本檢測結果均為陰性，見表3。

表1 4種品牌試劑基本情況表

表2 不同品牌試劑重復檢測結果（ORF1ab/RdRp基因）Ct值

表3 不同稀釋度標本用4種品牌試劑檢測的結果

2.2 4種品牌試劑靈敏度比較 各選取每個稀釋度中1次ORF1ab/RdRp基因擴增曲線，檢測結果見圖1。其中A試劑5個稀釋度均呈現陽性擴增（最后一個稀釋度3次重復試驗出現2次陽性擴增），B和C試劑有3個稀釋度呈現陽性擴增，后2個稀釋度為陰性，D試劑ORF1ab/RdRp基因5個稀釋度均無陽性擴增（該試劑N基因3個稀釋度有陽性擴增）。結果顯示A試劑靈敏度最高，B、C靈敏度類似，D試劑ORF1ab/RdRp基因檢出存在較大問題，未見陽性擴增曲線。通過4種品牌試劑的ORF1ab/RdRp基因Ct值比較，A試劑比C試劑提早1～2個循環，C試劑比B試劑提早1～3個循環。

圖1 4種品牌試劑ORF1ab/RdRp基因5個稀釋度擴增的曲線圖（a：A試劑；b：B試劑；c：C試劑；d：D試劑）

2.3 重復性試驗 4種品牌試劑每個稀釋度重復檢測3次，ORF1ab/RdRp基因（D試劑采用N基因）擴增重復性見圖2，A試劑重復性最好，C試劑次之。不同品牌試劑重復檢測結果的Ct值變化CV見表4。

表4 4種品牌試劑ORF1ab/RdRp基因Ct均值和重復檢測結果的CV

圖2 4種品牌試劑ORF1ab/RdRp基因不同稀釋度重復性試驗擴增曲線圖（a：A試劑；b：B試劑；c：C試劑；d：D試劑N基因）

2.4 A、B、C 3種品牌試劑除ORF1ab/RdRp基因外，D試劑除N基因外其他靶標基因檢出情況 A試劑為單標靶，無其他靶標基因；B試劑為三標靶，其N基因與E基因的檢測曲線見圖3；C試劑為雙標靶，其N基因檢出見圖3；D試劑為雙靶標，其除N基因外的ORF1ab/RdRp基因所有稀釋度標本中均無擴增。B試劑的E基因和C試劑的N基因擴增曲線要優于B試劑的N基因擴增，見圖3。

圖3 B、C兩種品牌試劑其他靶標基因擴增曲線圖（a：B試劑N基因；b：B試劑E基因；c：C試劑N基因）

2.5 國家衛生健康委員會臨床檢驗中心室間質評標本的檢測結果 C試劑為主要檢測試劑，A試劑作為復檢備用試劑，檢測結果見表5。

表5 C試劑和A試劑檢測國家衛生健康委員會臨床檢驗中心室間質評標本結果

3 討論

COVID-19疫情屬于突發公共衛生事件，傳播迅速且廣泛，給人民的生命健康帶來了極大的威脅，這使得SARS-CoV-2短時間內成為全球關注的焦點。2020年1月7日，研究人員從1例武漢患者體內成功分離出病毒并進行了全基因組測序[6-7]，疫情形勢嚴峻的特殊情況下，各廠家在較短時間內完成了核酸檢測試劑盒的研發，不可否認，核酸檢測試劑盒應用于臨床給COVID-19的診療提供了強有力的支持，但短時期內多種試劑通過應急審批上市，各核酸檢測試劑的質量和性能參數可能并不盡如意，而且在應用過程中試劑也在不斷更新和優化，導致部分品牌試劑存在較大的批次間差異，臨床使用過程中發現，部分試劑不同批次間的差異甚至非常之大。本研究僅針對各品牌試劑的某一個批號試劑進行評估，對不同批號試劑可能存在的性能差異未進行研究，但根據實驗室工作經驗，仍提醒實驗室人員在進行SARS-CoV-2核酸檢測時務必關注試劑批號變更可能帶來的檢測結果誤差，應按規定做相應的性能驗證，以滿足實驗室檢測的要求[8]。

本研究比較了4種品牌試劑對同一例COVID-19患者咽拭子標本提取的核酸模板不同稀釋度樣本的檢測結果，研究發現，不同品牌試劑檢測ORF1ab/RdRp基因的結果 Ct值存在差異；4種試劑檢測ORF1ab/RdRp基因的靈敏度也不同；A試劑批內重復檢測結果優于其他3種試劑。基于以上研究結果，不同品牌試劑之間檢測能力存在明顯差異，4種試劑的靈敏度、重復性均存在一定差別，究其原因，存在以下幾種可能：（1）與試劑的引物、探針設計有關；（2）與引物、探針的穩定性有關；（3）不同試劑的不同靶標基因檢測能力存在一定的差異。相對而言，高濃度核酸模板不同試劑檢測定性結果一致性較好，隨著核酸模板稀釋度加大，不同試劑檢測結果不一致，試劑盒的最低檢測限如果不能滿足低濃度樣本的檢測，可能會導致假陰性結果[9]。雖然目前SARS-CoV-2熒光PCR試劑均為定性試劑，且各廠家均在試劑說明書中列出了各自的最低檢測限，但由于臨床實驗室很難做到采用定量標準物質評估其靈敏度，故采用梯度稀釋方法對不同品牌的試劑進行相對比較仍不失為一個簡單有效的評估方法。4種SARS-CoV-2核酸擴增檢測試劑的檢測能力有差異，尤其對于弱陽性標本的檢測差異明顯，部分試劑的準確性、靈敏度及重復性欠佳，亟需進一步優化，提高其性能，以便更好地適應臨床篩查的需求，減少假陰性結果的出現。

基于對不同品牌試劑的評估，結合試劑本身的特性和臨床需求，本研究采用C試劑作為主要檢測試劑，A試劑作為復檢備用試劑的SARS-CoV-2核酸檢測方案。采用該方案檢測國家衛生健康委員會臨床檢驗中心室間質評標本，結果全部符合預期結果。國家衛生健康委員會臨床檢驗中心發布的《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告》對除202003和202009外的10個樣本進行了統計，公布的樣本信息顯示：樣本 202001、202005、202006、202007、202012 不含SARS-CoV-2核酸，預期結果應該為陰性，本研究選用的兩種試劑檢測結果與預期結果完全一致，其中樣本2020001含有SARS，2020012含MERS和OC43等其他冠狀病毒成分，C試劑和A試劑均未檢出陽性結果，選用試劑的特異性符合要求；202002、202004、202008、202010、202011均為SARS-CoV-2陽性樣本，核酸濃度分別為 640、3.2×103、1.6×104、128、8.0×104copies/ml，按照說明書標明的陽性判斷標準，C試劑檢測樣本202002 和 202004（濃度為 640 和 3.2×103copies/ml）出現了假陰性結果，A試劑復檢得出陽性結果，保證了低濃度檢測結果的準確性。樣本202010由于核酸濃度只有128 copies/ml，兩種試劑均未檢出陽性結果，國家衛生健康委員會臨床檢驗中心的評價原則500 copies/ml以上的樣本要求檢出，因此該標本的陰性結果不作為假陰性判定，統計結果也顯示，該樣本的總體符合率只有0.6%（931份結果中6份陽性）。樣本2020028和202011兩種試劑均檢測陽性結果，與預期結果符合。A試劑作為復檢試劑，對C試劑起到一定的補充作用，能夠大大減少低濃度樣本的漏檢率，減少假陰性結果的出現。兩種試劑組合的臨床應用基本滿足需求。

本研究僅針對部分品牌的某一批號試劑性能進行簡單評估，并不一定能全面反映試劑性能。另外，本研究僅針對SARS-CoV-2核酸擴增試劑進行比較，未對不同試劑間的提取方法和效率進行評估。作為疫情下最為重要和常用的實驗室判斷手段，熒光PCR病毒核酸檢測具有極其重要的作用，實驗室人員應重視不同試劑間的性能差異，選用高性價比試劑。實驗室在充分評估試劑性能的基礎上，在臨床實際應用中最好在常規使用試劑的基礎上準備1～2種備用試劑，作為對與臨床或影像學特征不符的可疑結果的補充驗證試劑，以避免出現假陰性或假陽性結果。