基于網絡藥理學探討逍遙丸對心理應激性不孕免疫調節的可行性和潛在作用機制

張 冬，段彥蒼，陳景偉，賀 明，范麗潔，李 慧，孟 鑫，李 穎，杜惠蘭

有資料顯示，不孕癥已成為僅次于腫瘤、心血管疾病的第3大疾病[1]。美國生殖醫學學會和美國生殖內分泌協會發表的一項規范指出，心理應激是生育及性功能障礙的重要因素[2]。女性焦慮水平可以影響其自然受孕率，焦慮水平高的不孕癥患者經過放松治療能夠提升其受孕率[3]。研究表明，慢性心理應激條件下的女性機體自身免疫平衡狀態更易被破壞[4]。中醫藥治療不孕癥已取得很好的成效，且中藥具有免疫促進和免疫抑制的雙向調節作用。疏肝法已成為臨床治療不孕癥的主要治法之一，其代表方劑——逍遙丸具有促進卵泡發育及卵母細胞成熟，改善子宮內膜容受性，提高臨床受孕率等作用[5],同時在治療女性相關的焦慮癥和抑郁癥中效果顯著[6]。研究表明，逍遙丸可抑制慢性應激小鼠胸腺細胞凋亡，提高胸腺雙陽T細胞數量；降低人外周血Th1/Th2比率和Th17細胞數量，改善亞健康狀態[7]。逍遙丸不僅可改善母體受孕環境，緩解女性抑郁狀態，還具有潛在的免疫調節作用。網絡藥理學將網絡科學、生物信息學、計算機科學和數學等學科方法結合到中藥藥理研究中，通過多靶點與疾病關系角度構建藥物-藥物、藥物-靶標等網絡，來預測藥物的功效以及特定功效對應的藥物[8]。因此本研究擬基于網絡藥理學的研究原理和方法，探討逍遙丸對心理應激性不孕免疫調節的可行性和潛在作用機制，以期為后續的實驗研究和臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1藥材成分靶點 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)對逍遙丸中八味藥材：柴胡、薄荷、當歸、白芍、茯苓、白術、生姜、甘草分別進行化學成分搜集。根據ADME參數設置口服生物利用度(OB)≥30%及類藥性指數(DL)≥0.18為篩選條件，獲得具有較高活性的化合物成分以及對應的靶標蛋白。

1.2疾病靶點收集 分別以“psychological stress infertility”“immunoregulation”為關鍵詞在Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)和Genecards兩個數據庫檢索相關的基因靶點，然后將篩選結果合并，均保留唯一值。

1.3逍遙丸和疾病交集靶基因 使用在線工具Venn對逍遙丸和心理應激性不孕及免疫調節的靶基因繪制維恩圖。

1.4蛋白-蛋白互作(PPI)網絡構建 將逍遙丸與心理應激性不孕及免疫調節的共同靶點輸入STRING中的“multiple proteins”，選擇“Homo sapiens”檢索。最低相互作用得分設定為 0.7、并隱藏斷開連接的節點，得到PPI。下載蛋白相互作用的tsv文件，將其導入Cytoscape，根據節點自由度篩選重要靶點。

1.5功能富集分析 使用R語言cluster Profiler軟件包，對共同靶點進行GO和KEGG功能富集分析，以BH方法調整后的P< 0.05(p.adjust < 0.05)為標準篩選顯著富集的GO條目和KEGG通路，并以條形圖、氣泡圖和網絡圖對部分結果進行展示。

2 結果

2.1逍遙丸成分靶點收集結果 通過 TCMSP 數據庫共檢索收集到1357種成分，其中349種來自于柴胡，164種來自于薄荷，125種來自于當歸，85種來自于白芍，34種來自于茯苓，55種來自于白術， 265種來自于生姜，280種來自于甘草。以OB≥30%且DL≥0.18為條件，篩選出161種活性化合物，其中17種來自于柴胡、10種來自于薄荷、2 種來自于當歸、13 種來自于白芍、15 種來自于茯苓、7 種來自于白術、5 種來自于生姜、92 種來自于甘草。逍遙丸八味藥材通過Uni prot數據庫獲得基因名稱的靶點249個。逍遙丸部分潛在活性成分信息見表1。

表1 逍遙丸部分潛在活性成分信息

2.2逍遙丸與心理應激性不孕靶點的篩選結果 OMIM 數據庫中篩選到心理應激性不孕靶點194個、免疫調節靶點6個。Genecards 數據庫中找到心理應激性不孕靶點973個，找到關于免疫調節靶點569個。將兩個數據庫篩選到的靶點去除重復后心理應激性不孕相關靶點有1133個，免疫調節相關靶點有570個。將心理應激性不孕、免疫調節和逍遙丸的靶點基因繪制維恩圖，結果顯示心理應激性不孕和免疫調節交集靶基因226個，心理應激性不孕、免疫調節和逍遙丸三者交集靶基因53個。

2.3PPI網絡分析結果 將篩選的逍遙丸-心理應激性不孕-免疫調節共有的53個靶點上傳至STRING數據庫，組織(Organism)設置為“Homo sapiens”，以得到PPI。見圖1。此網絡中共包含50個節點，384條邊，連接節點邊的數目越多，成為核心基因的可能越大。去掉斷開連接的節點，網絡圖中共有節點50個。圖中不同顏色的線代表不同的相互作用類型。下載tsv文件將其導入Cytoscape，作出“逍遙丸-靶標-心理應激性不孕-免疫調節”網絡圖。見圖2。圖中橙色菱形代表逍遙丸，紫色倒三角代表心理應激性不孕，粉色正三角代表免疫調節。圓形節點代表基因，圓形越大、顏色越深表示自由度越大，該基因在網絡中越重要。節度值自由度前20的靶點蛋白包括白細胞介素6(IL6)、信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素1β(IL1β)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、血管內皮生長因子(VEGFA)、CC類趨化性細胞因子2(CCL2)、CXC類趨化性細胞因子8(CXCL8)、細胞間黏附因子1(ICAM1)、白細胞介素10(IL10)、腫瘤蛋白TP53(TP53)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、信號轉導與轉錄激活因子1(STAT1)、白細胞介素2(IL2)、表皮生長因子(EGF)、白細胞介素4(IL4)、重組人血紅素氧合酶-1(HMOX1)、重組蛋白(IFNG)，這可能是逍遙丸治療心理應激性不孕免疫調節中發揮作用的關鍵潛在靶點。

圖1 逍遙丸-心理應激性不孕-免疫調節靶蛋白相互作用

圖2 逍遙丸-靶標-心理應激性不孕-免疫調節網絡圖

2.4GO功能富集分析 為進一步明確所篩選靶點的作用機制，本課題組通過R語言cluster Profiler 包對逍遙丸、心理應激性不孕及免疫調節的53個交集靶基因進行GO功能富集分析，共富集到1868條生物過程(BP)條目，29條細胞成分(CC)條目，70條分子功能(MF)條目。對最顯著富集的前15條BP、CC、MF條目應用氣泡圖進行展示，見圖3。圖中橫軸為基因富集比例，縱軸為富集到的GO條目，氣泡大小代表富集到的基因數目的多少，氣泡的顏色代表調整后的P值。根據報告顯示，前述所篩選靶點，BP主要參與炎癥反應、T細胞激活、氧化應激反應等過程，CC主要涉及細胞膜、染色質、核染色質轉錄因子復合物等區域，MF主要包括炎性因子受體結合、炎性因子活性、蛋白酶結合、抑制轉錄因子結合、TNF結合等方面。

圖3 逍遙丸、心理應激不孕及免疫調節53個交集靶基因GO功能富集分析A.生物過程條目； B.細胞成分條目； C.分子功能條目

2.5KEGG功能富集分析 通過R語言cluster Profiler 包對逍遙丸、心理應激性不孕及免疫調節的53個交集靶基因進行KEGG功能富集分析共富集到154條KEGG通路，對最顯著富集的前15條結果應用柱狀圖展示，見圖4A。橫軸為富集到的基因數目，柱狀的長短代表富集到的基因數目的多少，條形顏色代表調整后的P值。對最顯著富集的前5條KEGG通路做靶點和通路的相互作用網絡圖，見圖4B。對最顯著富集的前15條KEGG通路做通路之間的調控網絡圖，見圖4C。圖中黃色的點代表通路，灰色的點代表靶點基因，此處基因用Uniport符號表示。其中信號通路主要集中在與糖尿病并發癥相關的AGE/RAGE、IL17、TNF和癌癥信號通路等。

圖4 逍遙丸、心理應激性不孕及免疫調節53個交集靶基因KEGG功能富集分析A.KEGG通路富集柱狀圖(前15)；B.KEGG通路靶點和通路相互作用網絡圖(前5)；C. KEGG通路間調控網絡圖(前15條)

3 討論

應激狀態時遵照生存優先的原則，機體的應激反應與生長發育和繁殖相關[9]。心理狀態是獨立于年齡、不孕時間等因素以外的，影響自然妊娠率及治療效果的重要因素[10]。激活下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸是應激時最主要的神經內分泌改變。在慢性應激條件下由于糖皮質激素的持續增高表現為免疫功能的抑制，女性自身免疫平衡狀態較男性更易破壞，可表現為向Th1/Th17促炎狀態的轉變[4]。大量臨床數據顯示，不孕癥患者外周血或復發性流產患者子宮內膜中Th1和Th17細胞比例顯著增加，Th1和Th17 型細胞因子亦相應增加[11]。通過調節對HPA軸作用可提高心理應激性不孕癥患者妊娠率[12]。正常妊娠時母體細胞免疫功能受到抑制，免疫反應以體液免疫為主，發生由Th1/Th17向Th2/Treg型反應漂移現象[13]，在IL17、IL6、TNF-α、IL1β等大量細胞因子的參與下，通過MAPK/STAT3/NF-κB等信號轉導通路，完成妊娠免疫耐受和免疫應答等過程[14]。逍遙丸調節作用廣泛，涉及機體神經內分泌、免疫等系統。因此本研究基于網絡藥理學平臺，應用相關數據庫及軟件，構建“逍遙丸-心理應激性不孕-免疫調節”的關鍵靶點和信號通路網絡，以探討逍遙丸對心理應激性不孕潛在的免疫調節作用及可能的機制。

本研究篩選出161種活性化合物，主要為黃芩苷、豆甾醇、β-谷甾醇、槲皮素、毛地黃黃酮、芍藥苷、圣草酚等。篩選出逍遙丸-心理應激性不孕-免疫調節相關靶點，如IL6、STAT3、TNF、IL1β、MAPK1、VEGFA、MMP9等，主要涉及炎癥反應、T細胞激活、氧化應激反應以及細胞膜、染色質、核染色質轉錄因子復合物等區域，與IL17、TNF等信號通路有關。文獻報道，黃芩苷可改善脂多糖誘導孕鼠的子癇前期癥狀，降低大鼠胎盤中促炎細胞因子的水平，具有強效抗抑郁作用[15-16]。豆甾醇和β-谷甾醇可顯著降低結腸組織IL1β、IL6水平[17]。槲皮素可降低創傷性腦損傷后IL6、TNF-α水平，改善神經功能缺損和認知功能[18]，同時對大鼠卵巢卵泡發育和成熟有一定的促進作用[19]。芍藥苷可通過MAPK/NF-κB 等通路，影響IL17等細胞因子的生成，發揮抗炎和免疫調節作用[20]。圣草酚具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤及神經系統保護等多種藥理活性[21]。在KEGG所篩選的較為集中的信號通路中，IL17的促炎特性是其宿主保護能力的關鍵，對宿主防御、組織修復、炎癥疾病的發生起重要作用，MAPK/NF-κB-TNF-α是與IL17密切相關的信號通路，生物學上，維持IL17信號的致病和保護作用的平衡是非常必要的[22-23]。 TNF-α是健康有機體和疾病條件下哺乳動物免疫反應的關鍵中介和調節因子，誘導NF-κB和MAP活性是其主要的生化功能，在誘導T細胞亞群的激活、分化和存活中發揮重要作用[24]。

綜上所述，逍遙丸有效成分黃芩苷、豆甾醇等在抗炎、免疫調節和神經系統保護方面發揮重要作用，涉及IL6、TNF等蛋白以及機體免疫調節關鍵的IL17信號通路和TNF信號通路等，具有多成分、多靶點和多途徑且相互調節的特點，為臨床應用逍遙丸對心理應激性不孕免疫調節的可行性和潛在作用機制提供了理論依據，后續將以此依據進行相關的實驗驗證。