利用基因芯片技術篩選氧化應激介導的阿爾茨海默病相關miRNAs并驗證

姜磊 張睿 馬笑影 高肇妤 崔冬生 許順江

(河北醫科大學第一醫院中心實驗室 河北省腦科學與精神心理疾病重點實驗室，河北 石家莊 050000)

miRNAs是一類長度為20～24個核苷酸的內源性非編碼小RNA，主要在轉錄后水平調控基因表達〔1〕。miRNAs在阿爾茨海默病(AD)等神經退行性疾病的發生發展中具有重要的調控作用〔2〕，且miRNAs可能作為AD診斷的標志及治療的新靶點〔3〕。miRNA芯片能夠克服單基因研究的缺點，在功能基因組學研究中有廣泛的用途，從整體上分析細胞或組織之間的差異。本實驗通過miRNA芯片技術，分別篩選原代培養的海馬神經元和氧化應激的海馬神經元及正常老化小鼠(SAMR1)和速老化小鼠(SAMP8)海馬組織差異表達的miRNAs，并對這些miRNAs進行qPCR驗證及生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1實驗材料 3月齡SAMR1和3月齡SAMP8購自北京大學醫學部動物中心。兩種小鼠飼養于河北醫科大學第四醫院動物中心。本實驗所有操作程序經河北醫科大學第一醫院倫理委員會批準。DMEM/F12培養基、胎牛血清、B27均購于美國Invitrogen公司。H2O2、胰蛋白酶、左旋多聚賴氨酸、Hoechst33258購于美國SIGMA公司。甲臜化合物(MTS)購于美國Promega公司。微管相關蛋白(MAP)-2一抗購于美國BD公司。驢抗鼠熒光二抗購于美國Abbkine公司。miRcute miRNA 提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒購于中國TIANGEN公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 使用75%乙醇浸泡消毒整個SAMR1新生鼠后，放入超凈工作臺的彎盤中斷頭取腦，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中快速分離海馬組織。將剔除腦膜和血管的海馬組織剪成1 mm3左右的碎塊。向碎塊中加入0.125% 胰酶，37℃作用10 min。加入含20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養基終止胰蛋白酶消化。接著加入含20% FBS的DMEM/F12培養基制成密度為1×106個/ml的細胞懸液，并放入由0.1 g/L多聚懶氨酸包被的培養皿中。細胞在95% 濕度和5% CO2培養箱中孵育。細胞貼壁后，將培養基換成含2% B27的neurobasal培養基，接著每3 d半量換液孵育7 d。

1.2.2免疫細胞化學 用4%多聚甲醛固定體外培養7 d的海馬神經元，使用0.3% TritonX-100改變細胞膜的通透性，用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉非特異性抗原。加入MAP-2(1∶200)一抗，4℃孵育過夜，PBS清洗。加入TRITC標記的熒光二抗，室溫孵育1 h。使用Hoechst33258復染核。使用熒光顯微鏡拍照。計算MAP-2陽性細胞占所有細胞的比率，確定細胞純度。

1.2.3MTS法檢測海馬神經元的相對存活率 接種于96孔板中培養7 d的原代海馬神經元，加入不同濃度H2O2(0、100、200、400和800 μmol/L)處理24 h后，每孔加入20 μl MTS試劑，在37℃、5% CO2的環境下孵育4 h。在酶標儀490 nm波長下讀取吸光度值。細胞存活率(%)=〔(As-Ab)/(Ac-Ab)〕×100%(As為實驗孔：含細胞的培養基+MTS+H2O2；Ab為空白孔：完全培養基+MTS；Ac為對照組：含細胞的培養基+MTS)。計算不同組別細胞存活率，實驗均重復3次，取其均值。

1.2.4miRNAs表達譜分析 使用miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取200 μmol/L H2O2處理的原代海馬神經元和未經H2O2處理的原代海馬神經元及3月齡SAMP8和3月齡SAMR1海馬組織總RNA(步驟按照說明書進行)。使用Nanodrop1000分光光度計對提取的總RNA進行定量。使用Affymetrix miRNAs芯片 GeneChip miRNAs 2.0 Array分析miRNAs的表達。

1.2.5實時定量PCR 使用miRcute miRNA 提取分離試劑盒提取200 μmol/L H2O2處理的海馬神經元和未經H2O2處理的海馬神經元及3月齡SAMP8和3月齡SAMR1海馬組織總miRNAs。使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進cDNA的合成，使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒進行qPCR檢測，以miRNA-U6作為內參。實驗步驟按照說明書進行：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，40個循環。反應產物經溶解曲線檢測特異性。

1.2.6生物信息學分析 使用miRDB數據庫(http://www.mirdb.org/)和Targetscan(http://www.targetscan.org/vert_72/)數據庫預測兩組芯片共表達的差異miRNAs的靶基因，取其合集，并利用DAVID生物信息學數據庫對預測的靶基因進行基于基因功能聚類(GO) 的功能富集分析及基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)的生物通路富集分析(P<0.05)，錯誤發現率(FDR)<0.001視為有價值)。

1.3統計學分析 以U6作為內參，采用2-ΔΔCT法計算miRNA的表達。采用GraphPad Prism version 5.0和Excel進行作圖。采用SPSS17.0軟件進行t檢驗，方差分析，SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1H2O2處理濃度依賴地抑制海馬神經元的存活率 免疫熒光染色結果顯示，原代培養的海馬神經元純度大于95%。細胞胞體飽滿，突起粗大相互交織成網絡狀，說明海馬神經元處于最佳狀態，適用于實驗(圖1)。用不同濃度(0、100、200、400、800 μmol/L)的H2O2刺激海馬神經元24 h，MTS結果顯示，海馬神經元存活率分別為(100.0±2.8)%、(89.6±4.8)%、(66.6±6.3)%、(60.0±4.9)%、(39.8±7.1)%。其中200 μmol/L 的H2O2處理海馬神經元24 h后，存活率顯著降低(P<0.01)。因此，在后續實驗中，以200 μmol/L H2O2誘導海馬神經元制備體外氧化應激模型。

圖1 免疫細胞染色分析原代海馬神經元純度

2.2氧化應激介導的AD相關miRNAs的篩選 miRNA芯片分析結果顯示，與原代培養的海馬神經元相比，氧化應激的海馬神經元中101個miRNAs表達改變，其中64 個表達上調，37個表達下調。與SAMR1鼠相比，SAMP8鼠海馬組織中294個miRNAs表達改變，其中131個表達上調，163個表達下調。其中有6個差異表達的miRNAs (miR-296、miR-20a、miR-329、miR-193b、miR-130b和miR-24)在體外氧化應激的海馬神經元和SAMP8鼠海馬組織中表達的miRNAs中表達均上調，而miR-376b則在兩種模型基因芯片結果中表達均下調。

2.3氧化應激介導的AD相關miRNAs的表達 與對照組相比，200 μmol/L H2O2處理的海馬神經元中miR-329(1.024±0.256 vs 2.244±0.742，P<0.05)、miR-193b(1.011±0.176 vs 3.611±0.329，P<0.01)、miR-20a(1.009±0.165 vs 3.470±0.297，P<0.01)、miR-296(1.023±0.235 vs 4.127±0.735，P<0.01)、miR-130b(1.003±0.083 vs 2.238±0.733，P<0.05)和miR-24(1.012±0.173 vs 2.508±0.355，P<0.01)表達量明顯上升，miR-376b(1.019±0.228 vs 0.448±0.062，P<0.01)表達量明顯下降。與SAMR1比較，SAMP8海馬組織miR-329(1.021±0.238 vs 2.562±0.839，P<0.05)、miR-193b(1.033±0.308 vs 2.369±0.253，P<0.01)、miR-20a(1.007±0.147 vs 3.098±0.550，P<0.01)、miR-296(1.017±0.208 vs 1.817±0.225，P<0.01)、miR-130b(1.010±0.166 vs 2.449±0.508，P<0.01)和miR-24(1.005±0.113 vs 2.185±0.842，P<0.05)表達量明顯上升，miR-376b(1.008±0.142 vs 0.385±0.107，P<0.01)表達量明顯下降。Real-time PCR 結果與miRNA芯片結果一致。

2.4差異表達miRNAs靶基因的GO富集分析和KEGG分析 miRDB數據庫和Targetscan數據庫預測顯示兩組芯片共同表達的差異miRNAs共調控1 443個靶基因。GO富集分析結果顯示，這些靶基因主要參與細胞核的組成、蛋白質的結合和DNA轉錄調控(圖2)。將預測的靶基因向KEGG數據庫映射，結果顯示這些靶基因可能參與神經發育、MAPK信號通路和內吞作用等(圖3)。

圖2 差異表達 miRNAs靶基因的GO分析

圖3 差異表達 miRNAs靶基因的KEGG分析

3 討 論

60歲以上的老年人中AD的發病率可高達2%～3%〔4,5〕。目前認為，氧化應激是公認的AD的發病機制之一，在AD的整個病程進展中中樞神經系統均暴露于氧化應激條件下。Feng等〔6〕發現氧化應激不僅直接參與了AD的發病，更重要的是通過級聯酶促反應放大了AD神經變性的發生。此外，氧化應激在AD發病和進展過程中可導致基因表達失調。其中包括miRNAs在內的非編碼RNA，在AD等中樞神經系統退行性疾病的發病過程中的調控作用逐漸成為近年來的研究熱點〔7,8〕。miRNAs主要通過調節其下游靶基因的方式，在AD的發病中發揮作用〔9〕。梁厚成等〔10〕發現，氧化損傷引起視網膜色素上皮細胞中 miR-31等17個miRNAs的表達隨H2O2濃度升高呈逐漸降低的趨勢。Ansari等〔11〕發現，miR-146a和miR-181a參與輕度認知障礙和AD的發生發展。

共表達可能來源于共調節，共表達分析可為研究不同miRNAs功能提供更重要的信息。SAMP8主要特征表現為與衰老相關的學習記憶障礙，具有β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積、腦萎縮生等病理變化，并且在行為學、神經遞質及分子水平方面均表現出一定的衰老變化，是目前研究腦老化理想的動物模型〔12〕。研究發現，SAMP8在4月齡時出現Tau蛋白異常磷酸化和Aβ沉積，7月齡時出現嚴重的認知功能受損，因此以SAMP8作為AD動物模型〔13〕。而利用H2O2處理細胞制備的體外模型已被廣泛應用氧化應激機制研究。本研究將動物模型和體外細胞模型結合起來分析共同表達的差異miRNAs，能更精確篩選出與氧化應激相關，并在AD的發生與發展中具有重要作用的miRNAs。有研究表明，miR-130b、miR-20a、miR-24和miR-329均對腦的發育和神經元的分化具有重要的調節作用〔14～17〕。同樣，本研究發現，氧化應激和AD動物模型海馬組織中miR-130b、miR-20a、miR-24、和miR-329均表達上調。劉辰庚等〔18〕發現在AD患者和輕度認知障礙患者血清外吐小體中miR-193b的表達較對照組降低。其結果與本研究中miR-193b在氧化應激和AD動物模型海馬組織中表達上調的結果不符，可能由于標本來源不同所致。此外，本研究篩選出的差異miR-296和miR-376b尚未見其在氧化應激、衰老和神經元變性疾病中發揮作用的報道。研究顯示，在AD患者腦神經元中表達下降的基因數目是表達上升基因數目的3倍〔19〕。由于miRNAs主要在轉錄后水平調控基因表達，因此上述AD患者腦神經元中表達下降的基因可能受某些上調miRNAs的調控。本研究篩選出的兩組芯片共同表達改變的miRNAs以上調表達為主，因此，推測這些上調miRNAs通過下調某些基因表達參與AD的發生發展。通過GO和pathway功能分析發現兩組芯片共同表達改變的miRNAs靶基因可能參與細胞核的組成、蛋白質的結合和DNA轉錄調控等多個生物學過程，并通過神經發育、p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路和內吞作用等通路進行調節。為闡明共同表達改變miRNAs的生物學功能及可能的通路提供有價值的信息。在AD發病中的作用機制提供實驗依據。