四物湯防治動脈粥樣硬化分子機制的網絡藥理學研究及實驗驗證

張盟，孫麗萍，高文雅，趙丕文*（. 北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 0488；. 北京中醫藥大學 中醫學院，北京 0488）

根據世界衛生組織的相關統計，心血管疾病（cardiovascular diseases，CVDs）在近幾十年內已發展成為導致人類死亡的主要原因之一。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心肌梗死及腦卒中等心血管疾病的根本原因，典型特征是動脈壁上的AS斑塊，在冠狀動脈網絡、腦、外周動脈有不同程度的臨床表現，是心血管疾病發生的基礎[1]。

四物湯由熟地、當歸、白芍、川芎四味中藥組成[2]。中醫學既往并無AS對應病名記載，依據致病特點及臨床表現。AS歸屬于中醫學“脈痹、眩暈、胸痹心痛、中風、頭痛”等病癥范疇，主要證候為痰瘀互結證、氣虛血瘀證等，針對不同證型AS的主要治療藥物中，多數都包括了四物湯中的幾味藥物[3]。

為了能夠更加深入、全面地探討四物湯防治AS作用的分子機制，本研究首先采用網絡藥理學結合GEO數據庫挖掘，對其可能發揮作用的途徑和靶點進行探究；在此基礎上，應用血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）進行四物湯防治AS相關分子機制的體外實驗驗證。

1 方法

1.1 網絡藥理分析方法

1.1.1 四物湯中主要活性化合物的篩選與對應靶點的收集 采用TCMSP平臺（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以類藥性（drug-like property，DL）＞0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%為條件篩選主要活性化合物[4]。在Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）網站中獲取目標化合物SDF結構圖，將該結構圖導入Swisstarget平臺（http：//swisstargetprediction.ch/）[5-6]，對目標化合物相關靶點進行預測，以可能性Probability＞0.2篩選靶點，通過Cytoscape 3.8.0構建“四物湯-單味藥-化合物-靶點”的網絡[7]。

1.1.2 AS相關靶點的收集 以AS為關鍵詞，在DrugBank（https：//www.drugbank.com/）與OMIM數據庫（https：//www.omim.org/）中搜索該疾病相關靶點。在GEO數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜索AS疾病相關基因表達數據集；篩選目標數據集所測樣本有＞10個樣本數量的AS斑塊組織，同時具有＞10個樣本數量的正常血管組織作為對照。從選定的基因表達數據集中使用GEO2R工具分析，得到各基因的表達水平情況，生成樣本的基因火山圖；以P-value＜0.05和∣log2（fold change）∣＞1為標準篩選具有統計學意義的差異表達基因（differential expressed genes，DEGs），選取上升和下降最顯著的前20個基因繪制熱圖。

1.1.3 四物湯防治AS的靶點收集 將“1.1.2”項下獲得的AS相關基因取合集，與“1.1.1”項下獲四物湯主要活性化合物對應靶點同步導入Cytoscape 3.7.0中，取兩部分的交集，預測四物湯防治AS的靶點，并構建“化合物-靶點”的網絡。

1.1.4 GO與KEGG通路富集分析 將“1.1.3”中預測的四物湯防治AS的靶點導入David數據庫，進行基因本體論（GO）富集分析，分析四物湯對細胞生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cellular component，CC）和分子功能（MF）三個分類的作用[8]；對靶點進行京都基因百科全書（KEGG）富集分析，以P-value＜0.05為標準進行篩選。

1.1.5 PPI網絡構建與分析 將得到的四物湯防治AS的靶點輸入String數據庫（https：//stringdb.org），檢索“互作基因/蛋白質”，限定研究物種為智人，進行蛋白-蛋白相互作用網絡（protein-protein interaction，PPI）的構建，以PPI評分閾值＞0.4進行預測[9]。導入Cytoscape 3.8.0軟件對PPI結果進行可視化。

1.2 體外實驗方法

1.2.1 實驗材料 大鼠胸大動脈平滑肌A7R5細胞（上海中科院細胞庫）；熟地、當歸、白芍、川芎（經北京中醫藥大學劉啟福教授鑒定為正品，北京同仁堂藥店）；氧化低密度脂蛋白（廣東奕源生物）；DMEM 細胞培養液、胎牛血清、0.25%胰酶、青/鏈霉素（賽默飛世爾生物化學制品）；一氧化氮試劑盒（北京百瑞極生物）；TRITC熒光標記二抗（中杉金橋）；子α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、ERα抗體（Abcam）；eNOS抗體、GADPH抗體、山羊抗兔二抗（proteintech）。

1.2.2 制備四物湯凍干粉 精密稱取熟地30 g，當歸18 g，白芍18 g，川芎12 g（共78 g藥物），用8倍體積水浸泡30 min，煎煮2次，每次1 h，過濾后合并濾液，將溶液濃縮至約200 mL，12 000 r·min－1離心10 min后取上清液，置于圓底燒瓶裝至凍干機，以－80℃凍干過夜。制得中藥凍干粉40 g，每1 g凍干粉含有四物湯生藥1.95 g。

1.2.3 VSMCs培養 使用含有10%胎牛血清與1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，在37℃，5%CO2，100%濕度的培養箱中培養A7R5細胞。

1.2.4 VSMCs細胞的鑒定 免疫熒光檢測平滑肌細胞特異性標記分子α-SMA；將正常生長至70%密度以上的VSMCs細胞用4%多聚甲醛固定30 min，封閉后使用α-SMA抗體進行4℃孵育過夜；第二日，使用熒光標記二抗在室溫下避光孵育1 h，激光共聚焦顯微鏡（Olympus FV3000，Tokyo，Japan）下獲取圖像。

1.2.5 細胞增殖能力測定 將VSMCs以每孔8×104個細胞的密度接種于96孔板，培養24 h后進行處理；在四物湯對VSMCs增殖能力的影響實驗中，設置空白對照組與四物湯組（培養基稀釋藥物質量濃度分別為0、25、50、75、100、250、500、750、1000、1250、1500 μg·mL－1），空白對照組僅做基礎培養。在四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs增殖能力影響實驗中，設置空白對照組（基礎培養基）、模型組、四物湯低劑量組、四物湯中劑量組和四物湯高劑量組；根據文獻中所用劑量[10]，模型組與四物湯組加入氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）100 μg·mL－1進行誘導增殖，構建細胞AS模型，四物湯組同時加入100、500、1000 μg·mL－1四物湯，處理24 h后，加入CCK8試劑，37℃孵育2～3 h，使用酶標儀在450 nm處測定吸光度值，計算細胞增殖率。

1.2.6 一氧化氮含量測定 VSMCs按每孔3×105個細胞的密度接種至6孔板，培養24 h后進行處理，分組設置與處理同“1.2.5”中細胞增殖實驗。37℃ 5% CO2培養箱中孵育48 h后，收集細胞上清液，4℃，3000 r·min－1離心15 min去除上清中漂浮細胞。按一氧化氮（NO）檢測試劑盒說明書，制作NO含量標準曲線，根據吸光度值計算細胞上清中NO含量。

1.2.7 Western blot法檢測蛋白表達量 根據網絡藥理分析結果，選擇四物湯防治AS的關鍵靶點進行實驗驗證。VSMCs按每孔6×105個細胞的密度接種至T25培養瓶，培養24 h后進行處理，分組設置與處理同“1.2.5”項下，給藥48 h后，低溫下提取細胞總蛋白。蛋白樣品在SDS-PAGE凝膠上進行電泳，后將蛋白從凝膠轉電轉到PVDF膜，封閉后置于一抗中在4℃冰箱孵育過夜，將二抗在室溫搖床上孵育1 h，于凝膠成像儀（BIORAD化學發光凝膠成像系統）成像。

1.2.8 統計學方法 采用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料數據用均數±標準差表示，實驗數據分析均采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理分析結果

2.1.1 四物湯中主要活性化合物 從TCMSP數據庫中檢索到四物湯中共含有475個化合物，包括白芍85個、川芎189個、熟地76個、當歸125個，排除重復化合物得到438個，根據“1.1.1”項下所述OB與DL值篩選得到20個主要活性化合物（見表1）。

表1 四物湯中藥物所含主要活性化合物Tab 1 Main active compounds in SWT

2.1.2 四物湯中主要活性化合物對應靶點 在TCMSP與Swiss target數據庫中分別獲取20個化合物潛在作用靶點，TCMSP數據庫中獲得14個化合物對應的192個潛在靶點，Swiss target數據庫中獲得14個化合物對應的143個潛在靶點，有6個化合物在兩個數據庫中均未獲得預測靶點；所有潛在靶點去掉重復項后取合集，共得到203個潛在作用靶點。主要活性化合物與預測靶點關系網（見圖1），其中黃色為中藥名稱縮寫，橙色為主要活性化合物，綠色為預測靶點。

圖1 主要活性化合物-靶點網絡Fig 1 Major active compounds-target network

2.1.3 AS疾病相關基因 以AS為關鍵詞，在OMIM和Drugbank數據庫中進行檢索查詢，分別得到270個、62個靶點。在GEO數據庫中選取GSE100927數據集，其中包括69個AS斑塊樣本和35個正常動脈組織的基因組信息，以鑒定AS和健康動脈外周動脈之間的DEGs[11]。使用GEO2R工具進行基因表達差異分析，共得到54 674個基因的表達信息，其中表達上調基因27 237個，下調基因27 437個，生成樣本的基因火山圖見圖2：零點右側（log2FC＞0）為表達水平上調基因，零點左側（log2FC＜0）為表達水平下調基因，顯著上調的基因多于顯著下調的基因；紅色和綠色分別代表上調基因（log2FC＞1）和下調基因（log2FC＜1），即相比較于正常組織的表達水平，部分基因的表達水平高于或低于正常水平2倍，灰色表示差異不顯著。根據P＜0.05和∣log2（fold change）∣＞1標準篩選全部基因表達信息，共得到552個AS組織與正常動脈組織的DEGs。選取正常與AS動脈組織各20組樣本，與∣log2（fold change）∣＞1的基因中上調和下調最顯著的前20個基因繪制熱圖（見圖3）。將上述DEGs與Drugbank和OMIM數據庫中篩選的AS相關基因取合集，去除重復項，得到848個AS相關的基因。

圖2 GSE100927數據集中基因分布火山圖（P＜0.05）Fig 2 Volcano map of gene distribution in GSE100927 dataset（P＜0.05）

圖3 GSE100927數據集中差異表達基因聚類熱圖Fig 3 Heat map clustering of DEGs in GSE100927 dataset

2.1.4 四物湯防治AS的靶點 將所得四物湯主要活性化合物對應靶點與得到的AS相關基因取交集，得到四物湯防治AS的靶點共37個。山柰酚、兒茶酸、楊梅酮、川芎哚、β-谷甾醇、豆甾醇分別與22個、8個、8個、8個、7個、6個靶點相關。與四物湯主要活性化合物關系最密切的靶點是PTGS1、PTGS2、ALOX5、RXRA、F2和ESR1（見圖4）。

圖4 預測靶點與對應的主要活性化合物Fig 4 The predicted targets and corresponding main active compounds

2.1.5 GO及KEGG通路富集分析 GO富集分析結果顯示，四物湯防治AS的靶點參與影響176個BP，19個CC與33個MF，選擇GO分析各部分前10條繪制柱狀圖（見圖5）；其中四物湯對BP影響主要涉及炎癥反應、對血壓調節、對雌激素反應等方面；對CC影響主要涉及質膜、細胞外空間和細胞外區域等方面；對MF影響主要涉及蛋白質綁定、酶綁定、蛋白質同源二聚化活動、鋅離子結合、血紅素結合等方面。KEGG富集分析結果顯示，四物湯防治AS的靶點共涉及到51條信號通路，將KEGG富集分析的前10條通路繪制成氣泡圖見圖6；P值從大到小在圖上顯示為氣泡顏色從綠色到紅色；氣泡面積大小與通路涉及的基因數量正相關；橫軸表示該條通路涉及基因占總體輸入基因的比例。四物湯防治AS的靶點所參與的通路主要集中在腫瘤壞死因子（TNF）、NF-κB、非酒精性脂肪肝（NAFLD）、乙型肝炎（HBV）等通路。

圖5 預測靶點的GO功能富集分析Fig 5 GO enrichment analysis of the predicted targets

圖6 預測靶點的KEGG富集分析Fig 6 KEGG enrichment analysis of the predicted targets

2.1.6 PPI網絡構建及分析 PPI網絡共有37個節點和186個相互作用的邊（見圖7），網絡中節點（圓形）表示由基因編碼的蛋白質，邊線表示兩個節點間的相互作用。對于每對節點間的關聯強度的評價有多維度指標（如基因融合、共表達與大規模實驗的支持等），將多個維度指標計算整合形成綜合評分，可以提高對節點間關聯強度評價的可信度（在PPI網路圖中，邊線約寬，節點間關聯強度約高）[12]。從圖7中可以得出，根據Degree值排序，網絡中最重要的5個節點分別為IL-6、TNF、PTGS2、MMP9與NOS3等。

圖7 預測靶點的PPI 網絡Fig 7 PPI network of the predicted targets

IL-6、TNF、PTGS2與MMP9基因編碼產生蛋白均為可作為炎性標志物，提示炎癥水平。NOS3基因編碼產生蛋白是內皮型一氧化氮合酶（eNOS），可以調節血管張力和局部血流，抑制VSMCs細胞增殖以及調節白細胞-內皮相互作用等多種作用[13]；精氨酸在eNOS催化下合成NO，NO具有多種抗AS作用，包括抑制低密度脂蛋白氧化、防止白細胞黏附血管內皮，抑制血管平滑肌細胞增殖等[14]；并且NO還被認為是一種抗炎分子，其抗炎作用主要是通過抑制NF-κB 活性來抑制AS的形成[15]。根據綜合評分，在以NOS3為中心的PPI網絡中與NOS3節點關聯強度最高的節點為ESR1，編碼產生蛋白是雌激素受體α（ERα）（見圖8）。為了驗證四物湯對VSMCs更廣泛的抗AS作用，后續驗證實驗對四物湯處理的VSMCs進行NO水平檢測，并采用Western blot法對VSMCs的eNOS與ERα表達量進行檢測。

圖8 以NOS3為中心的PPI網絡Fig 8 A NOS3-centric PPI network

2.2 體外實驗結果

2.2.1 VSMCs生長形態與表型的鑒定 光學顯微鏡下觀察顯示，VSMCs形狀為梭形，平行排列，細胞生長呈“谷峰狀”（見圖9）。免疫熒光實驗染色顯示，TRITC標記的α-SMA呈紅色，胞質內存在大量平行于細胞長軸的紅色細絲（見圖10），表明該細胞具有VSMCs的表型特征。

圖9 光學顯微鏡下VSMCs形態與分布（20×）Fig 9 Morphology and distribution of VSMCs under light microscope（20×）

圖10 α-SMA免疫熒光染色（100×）Fig 10 α-SMA immunofluorescence staining（100×）

2.2.2 四物湯凍干粉對VSMCs增殖能力的影響通過CCK8法測試了不同質量濃度的四物湯（25～1500 μg·mL－1）對VSMCs活力的影響，如圖11所示，四物湯作用24 h后，對細胞增殖率無明顯影響，推測在這一質量濃度范圍內四物湯的處理對VSMCs生長無細胞毒性，故本實驗挑選其中具有一定質量濃度差的高、中、低3個劑量（分別為1000、500、100 μg·mL－1）進行后續實驗。

圖11 四物湯對VSMCs增殖率影響（±s，n＝3）Fig 11 Effect of different concentrations of Siwu decoction on VSMCs proliferation rate（±s，n＝3）

2.2.3 四物湯凍干粉對ox-LDL誘導VSMCs增殖能力的影響 如圖12 所示，與空白對照組相比，模型組VSMCs的增殖率顯著提高（P＜0.01）；與模型組相比，四物湯組細胞增殖率均降低（P＜0.05），對ox-LDL誘導的增殖有一定抑制作用，但三組間差異無統計學意義。

圖12 四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs增殖率的影響（x± s，n＝3）Fig 12 Effect of different concentrations of Siwu decoction on ox-LDLinduced VSMCs proliferation rate（x ±s，n＝3）

2.2.4 四物湯凍干粉對ox-LDL誘導VSMCs的NO水平的影響 如圖13所示，與空白對照組相比，ox-LDL處理的VSMCs的NO產生水平下降（P＜0.05），而高劑量與中劑量的四物湯處理VSMCs，均可明顯提升ox-LDL誘導的NO水平的下降（P＜0.01），并且呈現一定的濃度依賴性。

圖13 四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs中NO水平的影響（±s，n＝3）Fig 13 Effect of Siwu decoction on nitric oxide levels in ox-LDLinduced VSMCs（x ±s，n＝3）

2.2.5 四物湯凍干粉對ox-LDL誘導VSMCs的eNOS與ERα蛋白表達的影響 根據網絡藥理學分析結果，為了進一步驗證四物湯對VSMCs作用的具體分子機制，通過Western blot法觀察四物湯對eNOS和ERα在VSMCs中表達量的影響。如圖14所示，與對照組相比，ox-LDL可以明顯降低ERα、eNOS的表達量（P＜0.05），這一作用在加入四物湯的處理后被逆轉，并且均在四物湯劑量為500 μg·mL－1組效果最為明顯。

圖14 Western blot法檢測VSMCs的ERα、eNOS的表達水平（±s，n＝3）Fig 14 Expression level of ERα and eNOS analyzed by Western blot（±s，n＝3）

3 討論

藥用植物抗AS活性主要表現為抗炎、抗氧化、降壓、降脂、抗血栓等多種作用。此外，大多數藥用植物的特點是其多效抗AS作用。此外，藥用植物衍生的化合物具有相對安全、副作用少的特點，因此可作為抗AS的一類有效藥物[16]。本研究也證實了四物湯的主要活性化合物具有此類作用。

3.1 四物湯防治AS可能涉及的主要活性化合物

通過TCMSP和GEO數據庫獲得四物湯干預AS的37個靶點，靶點對應的四物湯中主要活性化合物按重要程度排序為：山柰酚、兒茶酸、楊梅酮、川芎哚、β-谷甾醇、豆甾醇。其中山柰酚是一種天然類黃酮，其抗炎、抗氧化和抗腫瘤的功效已被報道用于治療多種疾病[17]；在血管內皮細胞中，還可激活血紅素氧合酶1（HO-1）的表達，激活過氧化氫酶 （CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽 （GSH-Px）等，保護血管免受氧化應激和炎癥誘導的損傷[18]。兒茶素是常見于茶類中的一種黃酮類化合物，其攝入量與減少心血管疾病成正相關[19-21]；兒茶素可激活eNOS酶產生NO，以改善血管內皮功能障礙[22-23]；并且兒茶素可通過抑制基質金屬蛋白酶-2的表達，抑制凝血酶誘導的VSMCs的增殖[24]。楊梅酮具有良好的抗氧化及抗腫瘤等活性[25-27]，并且對氧化應激誘導的血管內皮細胞凋亡有保護作用[28]。川芎哚是中藥川芎、黨參中的活性物質之一，川芎哚及其類似物具有一定程度的抗凝血、減少紅細胞聚集、抗血栓與改善血液流變學的作用[29-31]。β-谷甾醇存在于多種中藥的甾體類化合物，富含β-谷甾醇的藥物在巨噬細胞中通過影響NO與活性氧（ROS）明顯減少小鼠的主動脈根部AS病變面積，并且阻止人單核細胞THP-1與VSMCs的黏附[32]。

3.2 四物湯防治AS預測靶點的富集分析

對四物湯防治AS的靶點進行GO富集分析發現，主要參與的BP為對炎癥反應、缺氧反應、血壓調節、雌激素反應、細胞因子分泌的正調控。眾多臨床與基礎實驗都已經證實AS是一種慢性血管炎癥反應，而近年來的研究也進一步證實機體免疫細胞的反應是AS斑塊形成的第一步，更是動脈粥樣斑塊不穩定的主要原因之一[33]；高血壓作為AS的重要風險因素，血壓升高狀態下對內皮細胞損傷與促進VSMCs過度增殖在形成AS的過程中也是必不可少的[34]；KEGG富集分析得到TNF、NF-κB、NAFLD、乙型肝炎、癌癥轉錄調控失調等信號通路。對于AS進展過程中分泌的眾多細胞因子的調節，也對AS的治療有非常重要的意義。細胞因子都是通過其所在信號通路來發揮作用[35]，其中TNF-α是最重要的促炎癥因子之一，可以誘導ROS的產生，使內皮功能出現障礙，并轉換VSMCs的細胞表型[36]；同樣在一個炎性因子主導的通路中，NF-κB參與激活內皮細胞黏附分子如E-選擇素、血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）等與單核細胞的黏附作用，并且轉換VSMCs表型，同時巨噬細胞的黏附增多，促進AS斑塊的發生[37]。

3.3 四物湯防治AS預測靶點的PPI網絡

在PPI網絡中，根據Degree值排序最重要的5個節點分別為IL-6、TNF、PTGS2、MMP9與NOS3等。除IL-6、TNF、PTGS2與MMP9均可編碼產生炎性標志物分子外；NOS3基因編碼產生的eNOS分子不僅有調節血管張力和局部血流等作用，其催化產生的NO可通過誘導和穩定NF-κB的抑制因子IκB而抑制 NF-κB的激活，從而控制黏附分子與炎癥介質的表達，對AS的病理發展起到抑制作用[38]。根據對蛋白互作強度的綜合評分（由基因融合、共表達與大規模實驗的支持等因素綜合計算），在以NOS3為中心的PPI網絡中與NOS3節點關聯強度最高的節點為ESR1（編碼產生ERα）；雌激素可以一種ERα依賴的方式快速激活MAPK通路，進而激活eNOS；并且雌激素與雌激素受體（ERs）結合，通過刺激熱休克蛋白90（HSP90）和AKT/蛋白激酶B（PKB）依賴的機制激活eNOS[39]。

3.4 四物湯對ox-LDL誘導的VSMCs細胞的作用

在動物模型和人類研究中，VSMCs的增殖導致血管內膜和動脈中層斑塊的生長，過度的VSMCs增殖已被證明在AS發生過程中非常重要[40]。CCK8實驗發現四物湯對未經處理的VSMCs增殖無明顯作用，但是在經過ox-LDL處理后，四物湯可抑制誘導后的VSMCs過度增殖，對AS的防治產生積極作用。四物湯可明顯提高經ox-LDL誘導的VSMCs的NO水平，而四物湯對VSMCs增殖的抑制作用可能通過對NO水平的調節來發揮。eNOS具有抗AS的作用，eNOS表達量的升高也提示了四物湯對防治AS的積極作用；課題組前期研究提示四物湯在多個維度顯示出了雌激素樣作用；研究顯示，雌激素和類雌激素化合物除了對eNOS作用的長期影響外，還存在對NO生物利用度的短期影響，雌激素可能通過經典雌激素核受體介導以調節eNOS的表達[41]；關于四物湯是否發揮雌激素樣作用調節eNOS水平，需要進一步的實驗探究。由于雌激素對心血管系統具有保護作用，雌激素替代療法已經作為臨床上防治女性絕經后AS的一種方案，但是由于其伴隨著婦科腫瘤發病風險的提高而一直備受爭議；本研究結果提示四物湯可能作為一種雌激素樣藥物對AS進行防治，為藥物的臨床應用提供了部分實驗依據。