基于遷移芯片木蝴蝶總黃酮類對肝癌細胞遷移的影響研究

李楠楠，包永睿，2，3，4，鄭義博，王鶴辰，孟憲生，2，3，4*（. 遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連6600；2. 遼寧省組分中藥工程技術研究中心，遼寧 大連 6600；3. 遼寧省現代中藥研究工程實驗室，遼寧 大連6600；4. 遼寧中醫藥大學-安捷倫現代中醫藥多組學研究合作實驗室，遼寧 大連 6600）

木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶Orozylum indicum（L.）Vent.的干燥成熟種子，具有清肺利咽，疏肝和胃的功效[1]。黃酮是木蝴蝶的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[2-4]。微流控芯片（microfluidic chip）具有微量化、超高通量化、集成化等優點，廣泛應用于生命科學、疾病診斷與治療、藥物篩選等領域[5-7]。本研究應用微流控芯片技術研究木蝴蝶總黃酮類成分在體外對肝癌細胞轉移的抑制作用，不僅為木蝴蝶作為抗肝癌藥物的研究奠定基礎，也為中藥抗腫瘤藥物的體外藥理學研究提供新的方法。

1 材料

1.1 儀器

TG-2U型光刻機（北京中科同志科技有限公司）；LSP04-1A精密注射泵（保定蘭格公司）；ECLIPSE-TI 倒置熒光顯微鏡（日本NIKON 公司）；RT-PCR（Piko Thermol公司）；通用電泳儀（美國BD公司）；直拉單晶拋光硅片（哈爾濱特博科技有限公司）。

1.2 試藥

木蝴蝶藥材購自大連同仁堂藥房，經遼寧中醫藥大學翟延君教授鑒定為Orozylum indicum（L.）Vent.的干燥成熟種子；木蝴蝶總黃酮（由本實驗室制備，經紫外分光光度計測定純度大于90%）。10%胎牛血清、1%青鏈霉素、DMEM培養基（美國GIBCO公 司）；TRlzol Reagent（美國Life公司）；RIPA裂解液（美國ambion公司）；RT-PCR試劑盒、PMSF蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑（北京全式金生物技術有限公司）；SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒、飛克特超敏ECL發光液（大連美侖生物科技有限公司）；抗體Anti-p38 MAPK phosphor（Thr180/Tyr182）（美國Arigo公司）；抗體p38 MAPK、β-actin（美國Proteintech公司）。

1.3 細胞株

人肝癌細胞HepG2，由中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫提供。

2 方法

2.1 細胞培養

按常規貼壁細胞培養法接種于含體積分數為10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度的條件下常規培養。隔日換液、傳代，取對數生長期細胞做后續實驗。

2.2 藥品的配制

取適量木蝴蝶總黃酮，用DMEM培養液溶解，配制成1.0 mg·mL－1含藥培養液，過 0.22μm 微孔濾膜，4℃保存，備用。

2.3 芯片的設計及制作

基于實驗室較為成熟的芯片制作工藝，采用軟光刻法[8-9]制作陽模，采用澆注法[10]將彈性材料聚二甲基硅氧烷（PDMS）澆注于陽模上形成芯片的閥層及通道層，最后采用氧等離子不可逆鍵合的方法[11]將PDMS結構與載玻片鍵合在一起形成PDMS-玻璃復合型芯片即“遷移芯片”。該芯片由上至下分別為閥控層、通道層和玻璃層，包括3個培養液入口，3個閥控液體入口，2個細胞入口，8個廢液流出口。

2.4 芯片中細胞培養及給藥

取對數生長期的人肝癌HepG2細胞，用0.25%的胰酶消化后，用100 μL培養液制成單細胞懸液。先通入閥控液體，再通過微量注射器將細胞從芯片的細胞注入口注入，37℃培養箱中靜態培養，待細胞貼壁。培養12 h后使用精密注射泵以0.2 μL·min－1的流速向芯片中通入培養液，繼續流動培養24 h。將液閥關閉，使用精密注射泵以0.2 μL·min－1的流速向芯片中通入藥物，給藥作用48 h，用顯微鏡在遷移區域拍照，用IPP軟件進行細胞計數[12]，按照下面公式計算相對遷移率并進行統計學分析。相對遷移率（%）＝（實驗組遷移細胞數/空白組遷移細胞數）×100%。

2.5 孔板劃痕實驗

取對數生長期的人肝癌HepG2細胞，PBS清洗，0.25%的胰酶消化，調整細胞濃度為5×104個·mL－1，接種于6孔培養板，每孔1 mL，繼續培養24 h待細胞貼壁完全。使用1 mL槍頭在每組孔底部劃出“一”字形劃痕，然后棄去細胞培養液，使用PBS清洗3次，設空白對照組（加細胞，但不加藥物）、木蝴蝶總黃酮組（TF組，藥物干預48 h），用顯微鏡在遷移區域拍照。

2.6 PT-PCR法實驗

將處于對數生長期的人肝癌HepG2細胞接種于6孔板中，木蝴蝶總黃酮干預48 h 后消化收集細胞，TRIzol法提取總RNA[13]。應用RT-①PCR試劑盒明書操作，將總RNA逆轉錄成第一鏈cDNA并合成目的基因。引物序列如下：①β-actin：F 5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3'，R 5'-TTTGATGTCACGCACGATTT-3'； ②p38：F 5'-CGGCACACTGATGACGAAAT-3'，R 5'-CAACGTTCTTCCGGTCAACA-3'。

2.7 Western blot實驗

取對數生長期人肝癌HepG2細胞接種于6孔板中，木蝴蝶總黃酮干預48 h后消化收集細胞，加入RIPM、PMSF、磷酸酶抑制劑裂解提取總蛋白。采用NanoDrop 5000 BSA法測定蛋白濃度，PBS緩沖液調整使各組蛋白終濃度相同。采用SDS-PAGE法，5%濃縮膠和8%分離膠，在100 V電壓下濃縮30 min，調節電壓120 V電泳分離蛋白質，在160 V電壓下轉膜1 h，取出PVDF膜用BSA溶液室溫搖床封閉2 h。封閉結束后，將PVDF膜在一抗（5%BSA按照1∶500進行稀釋）、二抗（5%BSA按照1∶5000進行稀釋）中孵育，TBST搖床清洗，ECL法進行顯色，采用Image J軟件分析條帶灰度值[14]，計算各組蛋白質的相對表達量。

2.8 統計學分析

應用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進行統計學處理，實驗結果以±s表示，多樣本均數間比較采用單因素方差分析，P＜0.05說明差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 遷移芯片

根據實驗需求，本課題組設計一種用于研究藥物對細胞遷移影響的芯片——PDMS-玻璃復合芯片，設計圖及芯片實物圖見圖1。該芯片包括三層：PDMS閥層，通入液體作為液閥，可控制通道的開合，調節細胞和液體的流向；PDMS通道層，可作為細胞或液體的通道；玻璃層，用于細胞貼壁。采用氧等離子不可逆鍵合而成，其中細胞注入口、藥物注入口、廢液口等位置如圖1所示。

圖1 遷移芯片的結構示意圖（A）和實物圖（B）Fig 1 Schematic diagram（A）and physicalmap（B）of the microfluidic chip

3.2 基于遷移芯片木蝴蝶總黃酮類對人肝癌細胞HepG2遷移的影響

如圖2所示，關閉液閥前，即給藥0 h時，HepG2細胞在細胞培養通道呈貼壁生長，細胞形態呈梭形，胞質透明，生長狀態良好；關閉液閥后，細胞培養腔與相鄰通道相通，繼續培養24 h后，空白組細胞向相鄰通道生長，木蝴蝶總黃酮也有少量細胞向相鄰通道遷移生長，但是遷移率較低。木蝴蝶總黃酮組24 h、48 h相對遷移率分別為16.59%、8.06%，與空白組比較差異均有統計學意義（P＜0.01）。說明木蝴蝶總黃酮能很好地抑制腫瘤細胞遷移。

圖2 HepG2細胞在芯片中的遷移狀態（A，100×）和遷移統計結果（B）Fig 2 Migration of HepG2 cells in the chip（A，100×）and statistical data of the cell migration（B）

3.3 基于劃痕實驗木蝴蝶總黃酮類對人肝癌細胞HepG2遷移的影響

如圖3所示，給藥0 h時，各組HepG2細胞在孔板底部呈貼壁生長，細胞形態呈梭形，胞質透明，生長狀態良好。培養24 h后，空白組細胞向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”變小；木蝴蝶總黃酮組部分發生皺縮，細胞變圓，但是并未向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”無變化。培養48 h后，空白組劃痕空白密布肝癌細胞，“傷口”幾乎愈合；TF組細胞大部分發生皺縮、變圓，部分細胞已死亡、懸浮于培養液中，但是并未向劃痕空白處遷移生長，劃痕“傷口”無變化。說明木蝴蝶總黃酮具有顯著抑制腫瘤細胞遷移的作用。

圖3 劃痕實驗各組HepG2細胞遷移狀態圖（100×）Fig 3 Migration of HepG2 in each group of scratch test（100×）

3.4 木蝴蝶總黃酮對相關基因和蛋白質表達的影響

采用RT-PCR法和Western blot法檢測相關基因和蛋白質的變化，由圖4可知，木蝴蝶總黃酮能降低p38 mRNA和蛋白質的表達（P＜0.05），能降低p-p38蛋白質的表達（P＜0.01）。

圖4 木蝴蝶總黃酮對HepG2細胞中p38 mRNA（A）和p38蛋白質（B）相對表達量的影響（n＝3，±s）Fig 4 Effect of TF on p38 mRNA expression（A）and protein expression（B）of HepG2 cells（n＝3，±s）

4 討論

本研究基于實驗室成熟的芯片制作工藝，設計并制作了用于研究細胞遷移的微流控芯片，即遷移芯片。該芯片由閥層、通道層、玻璃層組成，閥層和通道層上下對應，是模擬傳統孔板劃痕遷移實驗。當上層閥層中通入液體后，由于壓力的作用，PDMS會發生彈性形變，通入液體的通道將下壓，與下層通道層中對應的通道重合，將其與通道層中細胞流入通道阻斷，即造成“劃痕”，向通道層中細胞通道通入細胞懸液，待細胞貼壁后，將液閥關閉，此時細胞與相鄰的通道相連接，細胞則可向空白通道處遷移生長。為防止使用時通道塌陷，本課題組在芯片中間加入長橢圓形的支撐結構，使該芯片可重復多次使用。該芯片通過閥控裝置來模擬“劃痕”，并且這種劃痕不會對細胞造成機械性損傷，更接近癌細胞在體內的轉移過程。為了驗證該芯片的適用性，本研究同時使用傳統的劃痕法進行驗證。劃痕法實驗結果與微流控芯片結果均說明木蝴蝶總黃酮具有很好的抑制腫瘤細胞遷移的作用，具有進一步研究的價值。同時也說明微流控芯片法可以替代孔板內進行的遷移研究實驗，并存在簡單、快捷的優勢。

MAPK即絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase）是一系列與腫瘤發生和發展相關的細胞過程的調節者，包括細胞的增殖、轉移、分化、凋亡、存活和耐藥性等[15-16]。p38是MAPK激酶中的一種，與癌癥具有很大的相關性[17]。Dalasanur等[18]的研究表明，在乳腺癌中激活的p38可以促進癌細胞的增殖和轉移。本研究結果表明木蝴蝶總黃酮能降低p-p38蛋白質的表達，即減少p38的活化，說明木蝴蝶總黃酮能抑制p38活化，抑制細胞增殖和轉移，從而發揮抗肝癌作用。

綜上所述，本研究結果表明木蝴蝶總黃酮具有明顯的體外抑制腫瘤細胞遷移的作用，其發揮作用的機制可能與抑制p-p38蛋白質的表達，減少p38的活化有關。