新型冠狀病毒滅活操作對利奈唑胺血藥濃度的影響及一致性評價

唐原君，尹悅勤，陳明，汪碩聞*，范國榮（. 上海交通大學附屬第一人民醫院 臨床藥學科，上海00080；. 上海健康醫學院，上海 038）

新型冠狀病毒肺炎（簡稱新冠肺炎，COVID-19）為新發急性呼吸道傳染病，目前已成為全球性重大的公共衛生事件[1]。根據病例的回顧性研究，部分重癥患者往往存在合并細菌、真菌感染的情況[2-3]，必須聯合使用抗菌藥物和抗真菌藥物進行治療。利奈唑胺是新一代全合成的噁唑烷酮類抗菌藥物，臨床用于治療革蘭氏陽性球菌所致的感染，對葡萄球菌屬、肺炎鏈球菌屬、腸球菌屬細菌都具有高度的抗菌活性[4]。然而其在體內的藥動學特征卻存在較大的個體差異，腎功能、合并用藥、年齡、體重等因素均可影響利奈唑胺的血藥濃度，為避免或減少其不良反應，提高藥物療效，開展治療藥物監測（TDM），實施科學個體化給藥將發揮重要作用[5]。根據《新型冠狀病毒肺炎患者血藥濃度檢測技術指引》中的相關要求，針對新冠肺炎患者的外周靜脈血標本，需要按規定嚴格做好防護[6]。TDM項目送檢樣本屬于未經培養的感染性材料，其操作應當在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護。

鑒于目前國內許多開展TDM的實驗室均不符合生物安全二級實驗室的相關要求，且在防護物資緊張的情況下也無法滿足生物安全三級實驗室的個人防護的要求。在保證監測方法準確性和可靠性的基礎上，能否通過病毒滅活的操作方法對臨床獲取標本進行處理，成為后疫情時代下TDM從業者亟待解決的關鍵問題。根據指南推薦的對于生物標本的病毒滅活方法可采取濕熱法和紫外消毒法，已有報道對萬古霉素和伏立康唑的臨床生物標本經新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）滅活處理后的穩定性進行了考察[7-8]。本研究考察了新型冠狀病毒不同滅活方式對利奈唑胺血藥濃度的影響，以此填補病毒滅活操作對TDM樣本穩定性影響的空白，為開展其他相關TDM的醫療機構提供參考借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo UltiMate_3000超高效液相色譜儀（美 國Thermo Fisher），包 括LPG-3x00色 譜泵，WPS-3000自動進樣器，TCC-3x00柱溫箱，VWD-3x00檢測器，采用Chromeleon 6.80工作站進行數據分析。HY-5渦旋混合器（美國SI公司）；Centrifuge 5804R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；AL104-01電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）；SK7200H超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）；Hi-Tech水純化系統（18.2M，上海和泰儀器有限公司）。

1.2 試藥

利奈唑胺對照品（純度：98%，批號：M0801AS）、苯妥英鈉對照品（純度：99%，批號：J0727AS）（大連美侖試劑有限公司），磷酸二氫鉀（批號：20190725，上海凌峰化學試劑有限公司），異丙醇（批號：K49790140802）、甲醇（批號：1036307929）（德國Merck Millipore公司），甲基叔丁基醚（批號：17080261，美國Tedia公司），水為Hi-Tech水純化系統自制的去離子水（18.2 MΩ）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參考文獻，采用超高效液相色譜法測定利奈唑胺的濃度[9]。以苯妥英鈉為內標，色譜柱采用Agilent ZORBAX SB-C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫：30℃，流動相：甲醇-水＝55∶45（V/V），等度洗脫，流速：0.3 mL·min－1，檢測波長：254 nm，進樣量20 μL，分析時間3 min。典型色譜圖見圖1，利奈唑胺的保留時間為1.473 min。質控血漿樣品和臨床樣本根據測定當日的隨行標準曲線進行定量。

圖1 人血漿中利奈唑胺高效液相色譜圖Fig 1 Typical chromatogram of linezolid and phenytoin sodium in human plasma

2.2 溶液配制

精密稱取利奈唑胺對照品10.51 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得利奈唑胺質量濃度為1.051 mg·mL－1的對照品儲備液，置于4℃冰箱保存。

精密稱取苯妥英鈉對照品10.02 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容，搖勻，即得苯妥因鈉質量濃度為1.02 mg·mL－1的對照品儲備液，用甲醇溶液逐級稀釋成1.02 μg·mL－1的對照品工作液，置于4℃冰箱保存。

2.3 新冠病毒滅活方法

①濕熱滅活法：在56℃水浴加熱30 min；②紫外滅活法：在紫外燈下照射60 min。

2.4 血漿樣品前處理

取人血漿樣品200 μL置于1.5 mL離心管中，加入20 μL內標（苯妥因鈉1.02 μg·mL－1），渦旋混勻，再加入1 mL提取溶劑（叔甲醚-異丙醇＝90∶10，V/V），渦旋振蕩5 min，于13 000 r·min－1離心10 min。取上清液800 μL，于氮氣下吹干，加200 μL流動相復溶，渦旋振蕩1 min，于13 000 r·min－1離心5 min，取上清液80 μL置于進樣器中自動進樣20 μL測定。

2.5 新冠病毒滅活操作對利奈唑胺樣品穩定性考察

2.5.1 新冠病毒滅活方法對利奈唑胺對照品溶液濃度的影響 取利奈唑胺對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋成質量濃度為2.63、5.26、10.51 μg·mL－1的利奈唑胺質控對照品溶液，分別采用濕熱滅活法和紫外滅活法對利奈唑胺質控對照品溶液的穩定性進行考察。結果如表1所示，采用紫外滅活法，利奈唑胺的實測濃度僅為標示值的59.23%、16.75%、3.51%，且隨著濃度的增高，利奈唑胺降解越多。根據《中國藥典》2020年版“原料藥物與制劑穩定性試驗指導原則（9001）”中關于制劑質量的定義，本研究中將對照品準確度范圍定義為標示值的95%～105%。若超過此范圍，則認為該化合物在該新冠病毒滅活操作條件下不穩定，不予考慮進行后續的生物樣品穩定性實驗。結果表明，采用濕熱法滅活操作未對利奈唑胺對照品溶液產生影響，采用紫外法滅活操作后利奈唑胺對照品溶液不穩定，后續實驗選擇濕熱滅活法進行操作。

表1 新冠病毒滅活法對利奈唑胺質控對照品溶液濃度影響考察(n＝6)Tab 1 Effect of SARS-CoV-2 virus inactivation on the concentration of linezolid quality control reference solution (n＝6)

2.5.2 濕熱滅活法對利奈唑胺質控血漿樣品濃度的影響 取利奈唑胺對照品儲備液，用空白血漿配制成質量濃度為2.63、5.26、10.51 μg·mL－1的利奈唑胺質控血漿樣品，采用濕熱滅活法進行利奈唑胺質控血漿樣品穩定性考察。未滅活樣品和濕熱滅活法操作后的樣品，按“2.4”項下方法操作，結果見表2。采用血漿樣品處理濕熱法滅活后，利奈唑胺質控血漿樣品低、中、高濃度的準確度分別為99.1%、94.9%和100.1%，RSD均小于15%。根據“生物樣品定量分方法驗證指導原則（9012）”中關于生物樣品準確度的規定，本研究中將生物樣品的準確度范圍定義為標示值的85%～115%，若超過上述范圍則認為該生物樣品在此操作下不穩定。結果表明，采用濕熱法滅活操作未對利奈唑胺質控血漿樣品的穩定性產生影響。

表2 濕熱法滅活對利奈唑胺質控血漿樣品濃度影響考察(n＝6)Tab 2 Effect of damp heat inactivation on the concentration of linezolid quality control plasma samples (n＝6)

2.5.3 利奈唑胺血藥濃度監測樣本濕熱滅活前后分析方法一致性評價 選取本院重癥醫學科使用利奈唑胺的患者58例，采集穩態谷濃度血液標本，經6000 r·min－1離心5 min分離上層血漿，采用濕熱滅活法進行利奈唑胺臨床樣品穩定性考察，分別測定未滅活操作、濕熱滅活法操作后的利奈唑胺血藥濃度。

采用SPSS 19.0統計軟件對兩種方法測定結果進行組內相關系數（intraclass correlation efficient，ICC）值統計分析，統計結果顯示未滅活操作與濕熱滅活操作的利奈唑胺濃度結果的相關系數值為0.997（P＜0.001）。說明所檢測數據可信度高、一致性較好（ICC＞0.75），可以初步判斷兩組TDM檢測結果可重復性較好。

采用MedCalc軟件對兩種方法測定結果進行Passing-Bablok回歸法相關分析，以未進行滅活操作所測得利奈唑胺的濃度結果（Y）與濕熱滅活法操作所得利奈唑胺的濃度結果（X）進行線性回歸分析，回歸方程為Y＝－0.042 35＋1.009X（R2＝0.9957，n＝58），如圖2所示。其斜率和截距均在95%的置信區間內，表明兩種方法之間不存在系統誤差和比例誤差，測定結果之間的相關性良好（R2＞0.95）。Passing-Bablok回歸法證明兩種檢測方法可以互相代替。

圖2 利奈唑胺未滅活操作與濕熱滅活法Passing-Bablok線性回歸分析圖Fig 2 Passing-Bablok linear regression of un-inactivation and damp heat inactivation on linezolid

采用MedCalc軟件將兩種方法測定的利奈唑胺濃度值進行Bland-Altman分析，繪制偏差圖，如圖3所示。58例利奈唑胺實測配對數據差值的均數d＝－0.0133，則95%一致性界限為（－0.5880，0.5613）。從圖3可以看出96.55%（56/58）的點在95%一致性界限以內，符合相關要求。在一致性界限范圍內，未滅活操作的血藥濃度值與濕熱法滅活操作后血藥濃度值相比，差值的絕對值最大為1.18。由圖3中可知使用百分比比值計算一致性界限時，95%一致性界限為（－9.6668%，10.3177%），96.55%（56/58）的點在95%一致性界限內，此相差幅度在臨床上可以被接受。Bland-Altman分析證明濕熱滅活法與未滅活操作兩種檢測方法可以互換。

圖3 利奈唑胺未滅活操作與濕熱滅活法Bland-Altman分析圖Fig 3 Bland-Altman analysis of un-inactivation and damp heat inactivation on linezolid

3 討論

《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》中提出，新冠病毒對紫外線和熱敏感，56℃ 30 min、乙醚、75%乙醇、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒[1]。針對重癥新冠肺炎患者往往合并細菌、真菌感染的情況，臨床亟需對抗菌藥物的血藥濃度監測標本開展新冠病毒滅活操作穩定性的研究，以保護相關醫護人員的操作安全。目前尚未見到關于新冠病毒滅活操作對利奈唑胺血濃度監測影響的研究報道，本文主要采用濕熱法和紫外法滅活病毒。

研究結果發現，利奈唑胺樣品經濕熱滅活法后測定濃度與滅活前無明顯差異，但經紫外滅活法處理后出現明顯降解，有文獻報道，利奈唑胺在光化學條件下會發生C-F鍵的斷裂，進而產生相應的三線態笨基陽離子，發生光降解現象[10-11]。且在紫外滅活法中，隨著利奈唑胺濃度的升高，降解率增大，推測可能是由于在高濃度時，利奈唑胺的光化學動力學受反應中間體形成的影響，比如自由基，引起鏈式反應從而提高光降解率，造成利奈唑胺的濃度和光降解速率成正比。

本研究中所采用的臨床患者血樣均是在病區進行分離血漿的操作后送至實驗室進行檢測的，考慮到全血樣品在分離血漿的操作中也存在感染病毒的風險，本研究對全血樣品也進行了滅活前后的考察，發現濕熱滅活法會使全血樣品發生嚴重的溶血現象，樣品檢測的色譜圖雜質峰較多，會對利奈唑胺的保留時間造成干擾，且影響到利奈唑胺檢測的靈敏度。因此本研究中主要是對血漿樣品進行滅活前后的考察。

在一致性評價過程中，采用多種方法從不同角度進行綜合評價，可以避免單一評價方法的局限性，也使得評價結果更具有代表性[12-13]。本文采用經典的臨床分析檢驗一致性評價方法來判斷利奈唑胺樣品經過病毒滅活處理與未滅活處理的一致性，通過計算ICC值、Passing-Bablok回歸法和Bland-Altman偏差圖分析法進行綜合分析考察，證明濕熱法新冠病毒滅活操作不會對利奈唑胺血藥濃度監測結果產生影響。

綜上所述，在新冠肺炎疫情防控期間，對于利奈唑胺的TDM檢測血漿樣本可采用56℃、30 min濕熱法進行病毒滅活操作，不可采用紫外滅活方式。后續將對更多的抗菌藥物進行新冠病毒滅活操作影響的考察，從而減少疫情期間TDM相關醫護人員病毒感染的風險。