新疆鼠李果實提取物對高脂血癥大鼠調脂及抗氧化作用的研究

葉靜，陸春暉，沈靜*，張露（. 新疆醫科大學第五附屬醫院，烏魯木齊 8300；. 新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 8300）

由于脂肪代謝或運轉異常使血漿中一種或幾種脂質高于正常稱為高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）[1]，高脂血癥是動脈粥樣硬化等心血管疾病及脂肪肝病的主要發病原因[2-3]。新疆地區哈薩克常用藥新疆鼠李果實，民間常將其用于高脂血癥的治療中。新疆鼠李果實系鼠李科（Rhamnaceae）鼠李屬（Rhamnus）植物新疆鼠李果實（Rhamnus songoricaG.）產自中國新疆西部伊寧、新源、鞏留、特克斯、尼勒克、瑪納斯等地區，在中亞地區也有分布，為當地較為普遍的灌叢植物。新疆鼠李果實在新疆地區種質資源非常豐富，在哈薩克醫學中是具有一定藥用歷史的常用民間藥材，具有助消化、調節脂質代謝等功效。迄今對新疆鼠李果實化學成分與作用于高脂血癥藥理作用的相關研究均罕見報道，國外也僅限于生物及生態學等方面。基于民間應用基礎及前期相關藥材研究，新疆伊犁哈薩克自治州中醫院將其應用于臨床治療中，高脂血癥患者給予新疆鼠李果實后，血脂均得到改善。

本文選用體外抗氧化活性較強的新疆鼠李果實，通過建立大鼠高脂血癥模型，初步探討新疆鼠李果實提取物（RSFE）調脂作用及其體內抗氧化作用，為后續新疆鼠李果實對高脂血癥作用機制研究奠定基礎。

1 材料

1.1 試藥

新疆鼠李果實于2017年8月采自新疆伊犁州伊寧縣山區，經新疆醫科大學藥學院天然藥物分析教研室認定。脂必妥片（成分：紅曲，規格：0.35 g/片，成都地奧九泓制藥廠，批號：Z20178011）。

膽固醇（Klontech公司，批號：C27H460），豬膽鹽（上海蘭基科技發展有限公司，批號：160318），丙硫氧嘧啶片（德國Lomapham Rudolf Lohmann GmbH KG公司，批號：004000），蛋黃粉（安徽毫州蛋業有限公司，批號：20160120），香油（新疆泰星實業投資有限公司，批號：20160203），白糖、豬油（市售），總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）測試盒（Biosino生物科技有限公司），谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）及一氧化氮（NO）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、肝脂酶（HL）、脂蛋白脂肪酶（LPL）及總脂酶（LA）測試盒及蛋白定量測試盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 實驗動物

SPF級健康成年昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質量18～22 g；SPF級健康成年雄性SD大鼠90只，體質量（200±20）g [新疆醫科大學醫學實驗動物中心，實驗動物許可SYXK（新）2016-0001]。

高脂飼料含10%豬油、2%膽固醇、7%白糖、1%豬膽鹽、0.3%丙硫氧嘧啶、8%蛋黃粉、0.5%香油、71.2%基礎飼料，其中豬油為市售豬油加熱，濾過，去渣而成，飼料的混勻壓制由新疆醫科大學醫學實驗動物中心代為加工。

1.3 儀器

真空泵（鄭州長城科菲工貿有限公司），電子稱（成都普銳斯電子有限公司），冰箱（博世西門子家電集團），冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），高速離心機（上海安亭科學儀器廠），海爾－80℃冰箱（海爾醫療實驗室用品有限公司），勻漿機（金壇醫療器械廠），渦旋器（上海第一醫學院儀器廠），UV-1800型紫外分光光度計（日本島津公司），卓越310型全自動生化分析儀（武漢精誠偉業醫療設備有限公司），石蠟切片機（德國SLEE公司），倒置光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 新疆鼠李果實提取物的制備

取新疆鼠李新鮮果實于通風干燥條件下陰干、粉碎，共得藥材細粉1530 g，按料液比1∶10加70%乙醇加熱回流分批次提取3次，每次1 h，過濾、濃縮、冷凍干燥后得干粉共計120.87 g，計算平均出膏率約為7.9%。

2.2 RSFE急性毒性的測定

最大耐受量實驗：小鼠20只，以4.5 g·kg－1劑量一次灌胃給藥后，觀察7 d。期間未發現小鼠異常或死亡現象，平均每只增加2.5 g，為正常增長，故得出最大耐受量＞4.5 g·kg－1。

2.3 大鼠高脂血癥模型的建立

SD雄性大鼠常規適應性喂養1周后進行實驗，禁食12 h后，眼眶靜脈叢采血，測定TC、TG等血脂指標，根據血脂水平及體質量，使用完全隨機分組法將大鼠分為正常對照組（15只）和高脂血癥模型組（75只）。正常對照組給予基礎飼料喂養，高脂血癥模型組給予高脂飼料喂養。高脂血癥模型造模成功后，隨機分為5組，即模型組、陽性對照組、RSFE低劑量組、RSFE中劑量組、RSFE高劑量組。

第10周高脂飼料喂養結束后，每組大鼠眼眶取血測定血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平，再每組隨機取2只大鼠處死，取肝臟進行肝組織病理學檢查，血脂四項測定輔以肝組織病理學檢查以判斷高脂血癥模型造模是否成功。

2.4 給藥

正常對照組每日給予普通飼料喂養，模型組及各給藥組每日給予高脂飼料喂養。正常對照組：給予生理鹽水10 mL·kg－1灌胃，陽性對照組：給予脂必妥187.5 mg·kg－1灌胃，RSFE低、中、高劑量組分別給予RSFE 75、150、300 mg·kg－1灌胃。以上各組大鼠每日1次灌胃給藥。灌胃4周后檢測各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C水平。

2.5 大鼠血清生化指標的測定

分離大鼠血清，采用對應試劑盒測定TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、NO、T-SOD、MDA。

2.6 大鼠肝臟組織指標的檢測

等重量稱取肝組織后，加9倍體積生理鹽水進行勻漿，3000 r·min－1、4℃下離心15 min，得10%肝勻漿，取上清分裝保存于－80℃冰箱。

2.7 肝臟組織和心肌組織病理學檢查

開腹取肝臟組織、開胸取心臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中進行固定，經石蠟包埋、切片（厚度為5 μm），行常規HE染色，于光學顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織和大鼠主動脈組織病理形態學變化。

2.8 統計學方法

運用統計學軟件SPSS 17.0進行分析，實驗數據以x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠高脂血癥模型造模檢測結果

3.1.1 血脂四項檢測 結果表明，高脂飼料喂養10周后，高脂血癥模型組大鼠血清TC、TG與LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平顯著降低，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），結果見表1。

表1 高脂飼料喂養10周大鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C的分析(±s)Tab 1 TC，TG，LDL-C and HDL-C in the serum of rats after 10 weeks of high-fat diet (±s)

表1 高脂飼料喂養10周大鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C的分析(±s)Tab 1 TC，TG，LDL-C and HDL-C in the serum of rats after 10 weeks of high-fat diet (±s)

注（Note）：與正常對照組比較，*P＜0.01（Compared with the normal control group，*P＜0.01）。

組別 n TC/（mmol·L－1） TG/（mmol·L－1） LDL-C/（mmol·L－1） HDL-C/（mmol·L－1）正常對照組 15 1.79±0.14 0.59±0.06 0.47±0.21 1.40±0.09高脂血癥模型組 75 5.10±0.16* 1.13±0.10* 4.19±0.23* 0.63±0.08*

3.1.2 肝臟組織病理檢查結果 高脂飼料喂養10周后，正常對照組隨機取2只大鼠處死，高脂血癥模型組隨機取20只大鼠處死，取肝臟進行病理學檢查，檢測結果顯示高脂血癥模型組90%（18/20）大鼠出現肝細胞變性，可見大小不等的脂肪滴空泡散在，肝細胞排列疏松，符合高脂血癥性脂肪肝病理診斷標準（見圖1）。血清生化及肝臟組織病理學檢查結果表明，經過10周高脂飼料喂養成功建立大鼠高脂血癥模型。

圖1 正常對照組（A）及模型組（B）大鼠肝組織病理切片（HE）Fig 1 Pathological sections of the liver tissue in the normal control group （A）and the model group（B）（HE）

3.2 RSFE對高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平的影響

結果表明，與正常對照組比較，模型組的TC、TG及LDL-C升高，HDL-C降低。給藥4周后，各給藥組TC、TG及LDL-C降低，HDL-C升高（P＜0.01）（見表2）。

表2 新疆鼠李果實提取物對大鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平的影響(±s，n＝8)Tab 2 Effect of RSFE on the level of TC，TG，LDL-C and HDL-C in the serum of rats (±s，n＝8)

表2 新疆鼠李果實提取物對大鼠血清TC、TG、LDL-C及HDL-C水平的影響(±s，n＝8)Tab 2 Effect of RSFE on the level of TC，TG，LDL-C and HDL-C in the serum of rats (±s，n＝8)

注（Note）：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01（Compared with the normal control group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with the model group，##P＜0.01）。

組別 TC/（mmol·L－1） TG/（mmol·L－1） LDL-C/（mmol·L－1） HDL-C/（mmol·L－1）正常對照組 1.93±0.50 0.74±0.09 0.59±0.17 1.37±0.15模型組 8.73±0.56** 1.71±0.16** 5.32±0.84** 0.69±0.08**陽性對照組 2.36±0.39## 0.64±0.21## 0.71±0.14## 1.10±0.11**##RSFE低劑量組 3.28±0.66**## 1.47±0.16**## 2.38±0.18**## 0.74±0.05**RSFE中劑量組 2.53±0.28*## 1.04±0.11**## 2.15±0.22**## 0.82±0.11**RSFE高劑量組 2.13±0.37## 0.65±0.13## 1.59±0.18**## 1.05±0.18*##

3.3 RSFE對高脂血癥大鼠血清抗氧化指標的影響

肝臟是脂質代謝的重要場所，血清中ALT與AST水平的升高可反映肝損傷程度。結果表明，高脂飼料喂養14周后，模型組的ALT、AST水平升高，各給藥組的ALT、AST水平均下降（P＜0.05，P＜0.01）（見表3）。

表3 RSFE對大鼠血清ALT和AST水平的影響(±s，n＝8)Tab 3 Effect of RSFE on the level of ALT and AST in the serum of rats (±s，n＝8)

表3 RSFE對大鼠血清ALT和AST水平的影響(±s，n＝8)Tab 3 Effect of RSFE on the level of ALT and AST in the serum of rats (±s，n＝8)

注（Note）：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal control group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

組別 ALT/（U·L－1） AST/（U·L－1）正常對照組 45.47±9.38 68.51±13.10模型組 140.25±10.81** 174.75±18.84**陽性對照組 64.40±17.05## 108.67±11.20##RSFE低劑量組 80.33±10.69## 140.67±9.29##RSFE中劑量組 77.00±17.29## 96.43±26.49##RSFE高劑量組 76.71±8.24## 87.25±14.39#

3.4 RSFE對高脂血癥大鼠血清抗氧化指標的影響

模型組血清T-SOD、MDA、NO均有顯著性變化，提示長期高脂飲食降低機體的抗氧化能力從而對機體造成氧化損傷。RSFE可提高大鼠血清T-SOD水平，降低血清MDA及NO含量，改善機體受自由基攻擊程度（見表4）。

表4 RSFE對大鼠血清抗氧化指標的影響(±s，n＝8)Tab 4 Effect of RSFE on the antioxidative index in the serum of rats (±s，n＝8)

表4 RSFE對大鼠血清抗氧化指標的影響(±s，n＝8)Tab 4 Effect of RSFE on the antioxidative index in the serum of rats (±s，n＝8)

注（Note）：與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal control group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

NO/（μmol·L－1）正常對照組 395.03±47.03 3.26±0.98 21.85±1.74模型組 267.02±25.90** 5.91±1.21** 42.22±2.45**陽性對照組 385.60±33.96## 3.76±1.24## 23.98±2.21##RSFE低劑量組 320.03±38.25# 4.29±0.85# 34.07±3.49**##RSFE中劑量組 304.93±33.62# 3.93±0.80## 30.55±4.62**##RSFE高劑量組 372.80±26.39## 3.74±1.22## 20.08±3.45##組別 T-SOD/（U·mL－1）MDA/（nmol·mL－1）

3.5 RSFE對高脂血癥大鼠肝組織抗氧化指標的影響

3.5.1 RSFE對高脂血癥大鼠肝組織T-SOD和MDA的影響 結果與正常對照組比較，模型組肝組織T-SOD、MDA有顯著性變化（P＜0.01），長期高脂飲食可降低肝臟的抗氧化能力從而對肝臟造成氧化損傷。RSFE可提高大鼠肝組織T-SOD水平，降低肝組織MDA含量，改善機體受自由基攻擊程度（P＜0.01）（見表5）。

表5 RSFE對高脂血癥大鼠肝組織各指標的影響(±s，n＝8)Tab 5 Effect of RSFE on the index in the hepatic tissue of rats (±s，n＝8)

表5 RSFE對高脂血癥大鼠肝組織各指標的影響(±s，n＝8)Tab 5 Effect of RSFE on the index in the hepatic tissue of rats (±s，n＝8)

注（Note）：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01（Compared with the normal control group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01）。

LA/（U?mgprot－1）正常對照組 200.66±22.99 2.42±0.27 2.57±0.20 641.86±68.35 1.23±0.10 1.11±0.22 2.35±0.28模型組 94.55±15.74** 3.68±0.41** 4.67±0.67** 463.41±81.42** 0.53±0.05** 0.56±0.11** 1.09±0.08**陽性對照組 185.52±23.26*## 2.84±0.51**## 3.82±0.47**## 604.91±57.62*## 1.31±0.13## 1.16±0.18## 2.47±0.24##RSFE低劑量組 109.21±16.90**# 3.22±0.45**# 4.15±0.76**## 492.59±82.41**# 0.64±0.10** 0.64±0.13** 1.28±0.22**RSFE中劑量組 138.93±20.06**## 3.05±0.52**## 3.72±0.49**## 533.35±67.39**## 0.71±0.14**## 0.83±0.26**## 1.55±0.12**##RSFE高劑量組 179.08±19.44*## 2.70±0.31*## 3.30±0.37**## 584.37±47.59**## 1.04±0.13**## 1.29±0.25*## 2.33±0.35##組別 T-SOD/（U·mgprot－1）MDA/（nmol·mgpro－1）NO/（μmol·gprot－1）GSH-PX/（U·mg－1）HL/（U·mgprot－1）LPL/（U·mgprot－1）

3.5.2 新疆鼠李果實提取物對高脂血癥大鼠肝組織NO和GSH-PX的影響 結果表明，模型組NO、GSH-PX均有顯著升高，提示HLP發生過程中NO和GSH-PX含量升高，伴隨著氧化應激反應的發生。給予RSFE灌胃4周后，可降低大鼠肝組織NO和GSH-PX水平，改善肝臟組織氧化應激反應狀態（見表5）。

3.5.3 新疆鼠李果實提取物對高脂血癥大鼠HL、LPL及LA的影響 結果表明，正常對照組，模型組HL、LPL、LA均顯著下降比較（P＜0.01）。提示長期進食高脂飼料使外源性脂質不能排出體外，降低肝臟調控HL和LPL等脂蛋白代謝酶生物活性的能力，引發體內脂質代謝紊亂。給予RSFE灌胃4周后，RSFE可能通過肝臟調節脂蛋白代謝酶的生物活性，升高大鼠肝組織中HL、LPL及LA的活性，減輕肝組織脂肪變性，達到調脂的目的（見表5）。

3.6 大鼠肝組織病理學檢查結果

各組大鼠肝組織病理學檢查結果如下：正常對照組大鼠肝組織無異常變化，肝細胞形態和排列正常且無脂肪變性，肝小葉結構清晰，肝細胞圍繞小葉中央靜脈呈放射狀。模型組大鼠發生肝脂肪變性，病變程度主要是中重度脂肪變性，并且肝細胞排列疏松，體積變大變圓，胞漿內有大小、多少不等的脂滴，以致細胞核被擠壓至一邊。各給藥組脂肪變性不同程度減輕。其中，陽性對照組與RSFE高劑量組脂變和空泡變數量明顯減少，個別出現灶性壞死；RSFE低劑量組肝細胞脂變較明顯，肝小葉中央區肝細胞有大小、多少不等的脂滴，病變以中央靜脈向周圍遞減，部分肝細胞胞漿疏松化；RSFE中劑量組肝細胞存在脂變和空泡變，但數量較少，亦見部分肝細胞胞漿呈現疏松化（見圖2）。參照高脂血癥性脂肪肝的病理分級，RSFE給藥組脂肪變性較模型組明顯減輕，并接近于陽性對照組，表明新疆鼠李果實有減輕高脂血癥所引起的肝細胞脂肪變性程度的作用。

圖2 大鼠肝組織病理切片Fig 2 Pathological sections of liver tissue

3.7 大鼠主動脈組織病理學檢查結果

正常對照組大鼠主動脈組織無異常變化，內膜表面完整光滑無損傷，中膜平滑肌排列整齊、厚薄均勻，內皮細胞排列緊密無脫落。模型組大鼠主動脈組織脂質沉著，內膜灶性增厚，中膜平滑肌細胞排列紊亂，厚薄不均勻，與正常對照組相比，內膜、中膜厚度明顯增大，內皮細胞排列紊亂。給藥組大鼠主動脈組織脂質沉著現象較模型組有不同程度減輕。其中，陽性對照組及RSFE高劑量組脂質沉著明顯減少，內膜表面較完整平滑且中膜平滑肌排列整齊且厚薄均勻；RSFE低劑量組脂質沉著較明顯，中膜平滑肌細胞排列排列紊亂，厚薄不均勻，散見炎性細胞浸潤；RSFE中劑量組脂質沉著有所減輕，內膜灶性增厚，中膜平滑肌基本排列整齊，部分平滑肌有細胞水腫的現象（見圖3）。

圖3 大鼠主動脈組織病理切片（HE，400×）Fig 3 Pathological sections of aortic tissue（HE，400×）

4 討論

體內氧化平衡與高血脂癥之間的關系密切，高血脂促進動脈壁細胞中自由基的釋放活性，活性氧成分或氧自由基又進而導致LDL的氧化。而脂質過氧化作用的增強，使T-SOD水平降低后生成大量脂質過氧化物，反映在MDA水平的增多上[4]。脂質過氧化物氧化LDL-C后使其黏附于血管上，經歷吞噬、凋亡等過程后轉化為脂肪，進一步加重高脂血癥的發展[5-6]。因此，對抗脂質過氧化反應的發生，清除自由基是目前治療高脂血癥的關鍵。

在機體的各類氧化還原反應過程中所產生的O2－，而后產生脂質過氧化物及終極產物MDA，進而導致生物分子的結構或功能障礙，成為高脂血癥的基礎[7-9]。機體通過保護性酶系統-抗脂質過氧化酶終止自由基反應。T-SOD是一種有效的抗氧化劑，具有清除O2－與減少MDA生成的作用，從而阻斷脂質過氧化物的生成，進而減輕其對機體的損傷。NO是由內皮細胞釋放，具有舒張血管并逆轉其脂質過氧化狀態的作用[10-12]。而GSH-PX通過將胞漿、線粒體及脂類中的H2O2轉化為H2O和O，從而阻斷OH并且達到穩定細胞膜的作用[13]，清除脂質過氧化物，從而治療高脂血癥[14]。而肝細胞的抗氧化作用是通過提高GSH-PX活性而發揮其保護與解毒等功能的[15-16]。

本文研究表明，高脂飲食誘導的高脂血癥大鼠組的MDA水平顯著升高，說明其脂質氧化水平升高、作用增強，這種升高的MDA能被不同濃度的RSFE處理后得到改善，并且RSFE能降低高脂血癥大鼠TC、TG、LDL-C、ALT與AST水平，升高HDL-C、HL、LPL及LA水平，說明RSFE具有降低血脂的作用。其次，高脂血癥能直接損傷動脈壁的抗氧化機能，使動脈壁內的T-SOD活性降低，導致其清除自由基的作用受到影響，加重所在區域的動脈血管的病理損傷和機能的異常。本文中不同濃度的RSFE處理高脂血癥大鼠后，能不同程度地提升由高脂飲食誘導的大鼠血清與肝組織中的T-SOD的降低水平，并降低其NO、GSH-PX水平，也說明了RSFE具有增強抗氧化酶活性、清除氧自由基和其他活性氧成分的作用。