小兒荊杏止咳顆粒對(duì)幼齡大鼠發(fā)育毒性的研究

陳瓊芳，張宗利（新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410331）

小兒荊杏止咳顆粒由荊芥、矮地茶、杏仁、炙麻黃等中藥組成，具有疏風(fēng)散寒、宣肺清熱、祛痰止咳的功效，主要用于治療小兒外感咳嗽風(fēng)寒化熱證，即小兒急性氣管-支氣管炎引起的咳嗽、咯痰、痰黃、眼部紅腫、發(fā)熱等癥。小兒急性氣管-支氣管炎是兒科常見、多發(fā)的肺系病證，50%～60%由病毒感染引起，主要有流感病毒、副流感病毒、柯薩奇病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腺病毒等[1]。目前針對(duì)中藥兒科產(chǎn)品臨床前幼齡動(dòng)物毒性研究不完整，無法針對(duì)性地反映產(chǎn)品對(duì)兒童生長發(fā)育的影響。美國FDA、歐洲 EMA及中國NMPA均針對(duì)兒科用藥的非臨床安全性評(píng)價(jià)頒布了相應(yīng)的指導(dǎo)原則[2-4]。本研究通過觀察幼齡SD大鼠的體質(zhì)量、生長發(fā)育指標(biāo)、神經(jīng)系統(tǒng)指標(biāo)、免疫系統(tǒng)指標(biāo)、骨骼系統(tǒng)指標(biāo)，系統(tǒng)評(píng)價(jià)小兒荊杏止咳顆粒的發(fā)育毒性，為其臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

購入出生1 d（PND1）的幼年SD大鼠260只，體質(zhì)量13.3～22.2 g，共26窩，每窩10只，雌雄各半，每窩附帶母鼠1只[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：43004700029756]；按照國標(biāo)（GB14925-2010）SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境條件要求飼養(yǎng)于湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心屏障環(huán)境A區(qū)，動(dòng)物檢疫和適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)5 d，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（湘）2015-0016。實(shí)驗(yàn)期間環(huán)境溫度20～26℃，相對(duì)濕度：40%～70%。

1.2 試藥

小兒荊杏止咳顆粒[以下簡稱JXZKG，湖南方盛制藥股份有限公司，批號(hào)：161201，含量：4.23 g生藥/g干膏，臨床用量：6歲以下一次0.5袋（每袋含生藥18.33 g）tid]，給藥前以蒸餾水配制成所需濃度。

甲紫溶液（批號(hào)：20160502，衛(wèi)輝市康寶生化科技有限公司）；戊巴比妥鈉（批號(hào)：20160218，德國Merck）；免疫細(xì)胞檢測相關(guān)試劑盒（批號(hào)：201702，武漢Bio-Swamp）等。

1.3 儀器

AUY型分析天平（日本島津公司）；PL2002型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Digbehv 型動(dòng)物行為分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）；R_mCT2型微型CT（日本Rigaku Yamanashi公司）；MR-96A型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；BX43型生物顯微鏡＋MD50型數(shù)碼成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；ASP200S型全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1150H＋C型組織包埋機(jī)、AutoStainer XL自動(dòng)載玻片染色機(jī)＋CV5030自動(dòng)蓋片機(jī)（德國Leica）等。

2 方法

2.1 裂窩分組及劑量設(shè)計(jì)

PND1幼齡SD大鼠適應(yīng)飼養(yǎng) 5 d后，于首次給藥前2日（PND6），隨機(jī)選取檢疫合格的24只母鼠及240只仔鼠隨機(jī)分為4個(gè)臨時(shí)小組，每組6只母鼠及60只仔鼠，分別為空白對(duì)照組，JXZKG低、中、高劑量組。將母鼠放入新的大鼠籠具中，分別按順序編號(hào)為1-1，1-2，1-3……4-6；小組內(nèi)部每窩動(dòng)物抽取窩內(nèi)編號(hào)為F01的雌性仔鼠和窩內(nèi)編號(hào)為M01雄性仔鼠（共8只），交由組內(nèi)母鼠編號(hào)為1的母鼠進(jìn)行撫養(yǎng)；再自每窩其余動(dòng)物中抽取窩內(nèi)編號(hào)為F02的雌性仔鼠和窩內(nèi)編號(hào)為M02雄性仔鼠（共8只），交由組內(nèi)母鼠編號(hào)為2的母鼠進(jìn)行撫養(yǎng)；以此類推直至將每窩中的仔鼠均勻分布至小組中各只母鼠撫養(yǎng)。

由于藥物溶解度的限制，藥物可順利給予幼齡動(dòng)物的最大質(zhì)量濃度為2.54 g干膏·mL－1，故依此設(shè)計(jì)高、中、低劑量組藥物質(zhì)量濃度分別為2.54、1.27、0.63 g干膏·mL－1，對(duì) 應(yīng)25.4、12.7、6.3 g生藥·kg－1，分別相當(dāng)于兒童臨床劑量按公斤折算的10.2倍、5.1倍、2.5倍（按照6歲兒童平均體質(zhì)量22 kg，每日用藥55 g生藥計(jì)）。于PND8開始按10 mL·kg－1的體積灌胃給予對(duì)應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)給藥14周。

2.2 檢測指標(biāo)

2.2.1 一般狀態(tài)觀察 每日給藥后肉眼觀察動(dòng)物外觀、精神狀態(tài)、糞便情況、飲食及飲水情況等。

2.2.2 體質(zhì)量 斷乳之前（PND8～PND21）每日稱體質(zhì)量1次，PND22～PND35每周稱2次，PND36～PND133每周稱1次，根據(jù)每次稱重調(diào)整給藥量。每日稱量攝水量和飼料加料量，每周計(jì)算平均攝食量和攝水量。

2.2.3 生長發(fā)育指標(biāo)檢測 于PND8～PND42分別觀察動(dòng)物各項(xiàng)標(biāo)志性特征（幼鼠下門齒萌出、睜眼、張耳、睪丸下降、包皮分離、陰道張開）是否發(fā)育完成。

2.2.4 神經(jīng)反射、行為學(xué)指標(biāo)檢測 于PND10～PND21分別檢測動(dòng)物負(fù)向趨地性反射、聽覺驚愕反射及空中翻正反射是否形成[4-7]；分別于給藥后第4、9、14周檢測不同發(fā)育階段[各組間隨機(jī)選取10只動(dòng)物，雌雄各半，檢測自主活動(dòng)指標(biāo)（活動(dòng)時(shí)間、活動(dòng)次數(shù)和活動(dòng)距離）及轉(zhuǎn)棒（跌落次數(shù)）]是否存在差異。

2.2.5 肝藥酶、血清球蛋白及激素指標(biāo)檢測 分別于給藥期第4、9、14周末，采用Elisa法檢測肝組織細(xì)胞色素CYP2E1、CYP1A2含量和大鼠血清免疫指標(biāo)（IgG、IgA、IgM、IgE）、生長激素（E）、甲狀腺激素T3、甲狀腺激素T4、促皮質(zhì)激素（ACTH）、雄激素（androgen）、雌激素（GH）及孕激素（PROG）含量。

2.2.6 脛骨長度檢測 分別于給藥期第9、14周末、恢復(fù)期第4周末用游標(biāo)卡尺檢測動(dòng)物右側(cè)脛骨長度（近端關(guān)節(jié)面與遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)面的直線距離）。

2.2.7 骨密度檢測 分別于給藥期第4、9、14周末、恢復(fù)期第4周末，解剖時(shí)取右側(cè)股骨，紗布包裹加入適量冷生理鹽水后凍存，進(jìn)行小動(dòng)物微型CT骨密度檢測。

2.2.8 病理解剖 于給藥后4、9周末每組雌雄分別解剖 5 只，給藥后14周末每組雌雄各解剖10 只，對(duì)空白對(duì)照組、高劑量組及尸檢異常動(dòng)物進(jìn)行病理檢查，如高劑量組動(dòng)物某一組織出現(xiàn)與藥物相關(guān)病變，需要對(duì)其他劑量組動(dòng)物的相同組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用單因素方差分析（ANOVA）和非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。評(píng)價(jià)時(shí)考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和生物學(xué)意義，其中P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。發(fā)育檢查及神經(jīng)反射檢查以達(dá)標(biāo)時(shí)間為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，按計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)

與空白對(duì)照組比較，JXZKG高、中劑量組大鼠分別在給藥第3～12日、第3～6日出現(xiàn)不同程度的腹瀉現(xiàn)象，這一現(xiàn)象在給藥第3周完全消失。JXZKG低劑量組大鼠一般狀態(tài)沒有異常，綜合本中心進(jìn)行的其他幼齡動(dòng)物試驗(yàn)臨床觀察現(xiàn)象，認(rèn)為是幼齡大鼠灌胃給予高濃度藥液之后的正常反應(yīng)。

3.2 哺乳期幼鼠和斷乳后大鼠體質(zhì)量變化情況

如圖1A所示，在給藥后，哺乳期內(nèi)與同期空白對(duì)照組比較，JXZKG高劑量組幼鼠體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01）；JXZKG中、高劑量組未見明顯差異。如圖1B所示，斷乳后與同期空白對(duì)照組比較，JXZKG各劑量組動(dòng)物體質(zhì)量未見明顯差異。

圖1 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)哺乳期（A）和對(duì)斷乳（B）大鼠體質(zhì)量的影響Fig 1 Effect of JXZKG on the body weight of lactation rats（A）and weaned rats（B）

由結(jié)果可知幼齡SD大鼠經(jīng)口灌胃給予JXZKG，哺乳期及斷乳前期高劑量組動(dòng)物體質(zhì)量與同期空白對(duì)照組比較有一定下降，但下降幅度不大（未超過同期空白對(duì)照組體質(zhì)量的10%），且此期間內(nèi)動(dòng)物體質(zhì)量增長速度相比同期空白對(duì)照組無明顯差異，結(jié)合組織病理學(xué)檢查未見毒性意義的病理改變，認(rèn)為哺乳期及斷乳前期高劑量組動(dòng)物體質(zhì)量下降是灌胃給予高濃度的藥液產(chǎn)生的影響，無明顯毒理學(xué)意義。

3.3 大鼠平均攝食量、攝水量

實(shí)驗(yàn)期間JXZKG各給藥組平均攝食量和攝水量與同期空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體數(shù)據(jù)未列出。

3.4 大鼠生長發(fā)育指標(biāo)情況

如表1所示，JXZKG各劑量組動(dòng)物生理發(fā)育標(biāo)志性事件發(fā)生時(shí)間與空白對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠發(fā)育指標(biāo)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝30)Tab 1 Effect of JXZKG on the development index of rats (x± s，n＝30)

表1 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠發(fā)育指標(biāo)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝30)Tab 1 Effect of JXZKG on the development index of rats (x± s，n＝30)

組別 性別 檢測指標(biāo)/d下門齒萌出 睜眼 張耳 陰道張開 睪丸下降 包皮分離空白對(duì)照組 雌 11.0±0.0 13.2±0.6 18.0±0.0 35.3±1.1 － －雄11.0±0.0 13.2±0.6 18.0±0.0 － 22.3±1.9 42.0±0.0 JXZKG低劑量組 雌 11.0±0.0 13.4±0.8 18.0±0.0 35.0±0.0 － －雄11.0±0.0 13.3±0.7 18.0±0.0 － 22.1±1.8 42.0±0.0 JXZKG中劑量組 雌 11.0±0.0 13.2±0.6 18.0±0.0 35.0±0.0 － －雄11.0±0.0 13.3±0.8 18.0±0.0 － 22.3±1.9 42.0±0.0 JXZKG高劑量組 雌 11.0±0.0 13.3±0.7 18.0±0.0 35.3±1.1 － －雄11.0±0.0 13.4±0.8 18.0±0.0 － 22.1±1.8 42.0±0.0

3.5 大鼠神經(jīng)反射功能情況

如表2所示，JXZKG中劑量組空中翻正反射達(dá)標(biāo)時(shí)間略高于空白對(duì)照組（P＜0.05），但未表現(xiàn)出明顯的劑量關(guān)系，且相差不大，認(rèn)為是個(gè)體差異所致，且幼齡SD大鼠空中翻正反射常在PND16～PND19發(fā)育完成，各組動(dòng)物均在PND16～PND19發(fā)育完成，故認(rèn)為該變化沒有毒理學(xué)意義；其他指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)動(dòng)物反射指標(biāo)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝60)Tab 2 Effect of JXZKG on the reflection index of rats (x± s，n＝60)

表2 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)動(dòng)物反射指標(biāo)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝60)Tab 2 Effect of JXZKG on the reflection index of rats (x± s，n＝60)

注（Note）：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05（vs the blank control group，*P＜0.05）。

組別 反射指標(biāo)/d空中翻正反射 聽覺驚愕反射 負(fù)向趨地性反射空白對(duì)照組 16.1±0.5 16.0±0.0 10.2±0.6 JXZKG低劑量組 16.2±0.7 16.0±0.0 10.1±0.4 JXZKG中劑量組 16.4±1.0* 16.0±0.0 10.1±0.5 JXZKG高劑量組 16.0±0.0 16.0±0.0 10.2±0.6

3.6 大鼠行為學(xué)指標(biāo)情況

如表3～4所示，給藥中期，JXZKG中、高劑量組活動(dòng)距離明顯低于同期空白對(duì)照組（P＜0.01）；高劑量組活動(dòng)時(shí)間明顯低于同期空白對(duì)照組（P＜0.05），活動(dòng)次數(shù)明顯高于同期空白對(duì)照組（P＜0.05）。各給藥組動(dòng)物轉(zhuǎn)棒跌落次數(shù)與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)動(dòng)物自主活動(dòng)檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝10)Tab 3 Effect of JXZKG on the autonomic activity index of rats (±s，n＝10)

表3 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)動(dòng)物自主活動(dòng)檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝10)Tab 3 Effect of JXZKG on the autonomic activity index of rats (±s，n＝10)

注（Note）：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01（vs the blank control group，*P＜0.05，**P＜0.01）。

組別 階段 檢測指標(biāo)活動(dòng)時(shí)間/s 活動(dòng)次數(shù)/次 活動(dòng)距離/m空白對(duì)照組 給藥前期 365.64±95.47 114±13 17.24±6.19給藥中期 444.03±71.84 109±21 25.55±15.84給藥末期 417.85±61.16 128±18 17.52±4.10 JXZKG低劑量組 給藥前期 264.06±145.22 95±25 12.27±9.38給藥中期 451.18±48.72 115±17 18.92±3.50給藥末期 408.87±58.37 119±30 15.42±4.52 JXZKG中劑量組 給藥前期 343.34±87.40 116±29 17.07±4.96給藥中期 420.50±50.61 128±21 15.81±3.00**給藥末期 355.20±88.15 128±26 13.05±6.39 JXZKG高劑量組 給藥前期 363.12±79.33 114±27 17.09±4.25給藥中期 385.93±67.04* 132±22* 14.28±3.03**給藥末期 425.38±67.52 127±21 17.90±5.77

表4 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)動(dòng)物轉(zhuǎn)棒檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝10)Tab 4 Effect of JXZKG on rotating stick index of rats (x± s，n＝10)

表4 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)動(dòng)物轉(zhuǎn)棒檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)(±s，n＝10)Tab 4 Effect of JXZKG on rotating stick index of rats (x± s，n＝10)

組別 跌落次數(shù)/次給藥前期 給藥中期 給藥末期空白對(duì)照組 3±3 2±1 1±2 JXZKG低劑量組 4±4 2±2 1±2 JXZKG中劑量組 2±2 2±3 2±2 JXZKG高劑量組 2±1 2±2 2±2

3.7 脛骨長度及骨密度指標(biāo)情況

如圖2所示，整個(gè)試驗(yàn)期間各給藥組脛骨長度及骨密度分別與同期空白對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)動(dòng)物脛骨長度（A）和骨密度（B）的影響Fig 2 Effect of JXZKG on the tibia length（A）and the bone density（B）of rats

3.8 大鼠肝藥酶檢查結(jié)果

如表5所示，給藥末期，JXZKG低劑量組CYP1A2明顯低于同期空白對(duì)照組（P＜0.05），其他時(shí)期各劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠肝藥酶指標(biāo)的影響(±s)Tab 5 Effect of JXZKG on the liver drug metabolizing enzym (x± s)

表5 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠肝藥酶指標(biāo)的影響(±s)Tab 5 Effect of JXZKG on the liver drug metabolizing enzym (x± s)

注（Note）：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05（vs the blank control group，*P＜0.05）。

組別 階段 動(dòng)物數(shù)/只 肝藥酶指標(biāo)/（μmol·mL－1）CYP1A2 CPY2E1空白對(duì)照組 給藥前期 20 5.21±0.81 35.51±5.02給藥中期 10 3.83±0.89 22.35±4.20給藥末期 20給藥前期 20給藥中期 10給藥末期 20給藥前期 20 4.33±1.06 28.13±6.90 JXZKG低劑量組 4.70±0.96 32.63±4.55 4.00±1.23 23.09±5.50 3.94±0.86* 32.04±11.38 JXZKG中劑量組 4.65±0.90 34.39±5.13給藥中期 10 3.62±0.79 24.60±5.27給藥末期 20 3.65±0.92 29.34±7.87 JXZKG高劑量組 給藥前期 20 4.70±1.03 34.73±4.09給藥中期 10 3.78±0.80 25.50±7.79給藥末期 20 4.25±1.16 26.13±8.35

3.9 大鼠血清激素指標(biāo)檢查結(jié)果

如表6所示，給藥前期，JXZKG高劑量組甲狀腺激素T3、T4明顯高于同期空白對(duì)照組（P＜0.01或P＜0.05），其他時(shí)期各劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表6 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠血清激素指標(biāo)的影響(±s)Tab 6 Effect of JXZKG on the serum hormone index of rats (±s)

表6 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠血清激素指標(biāo)的影響(±s)Tab 6 Effect of JXZKG on the serum hormone index of rats (±s)

注（Note）：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P＜0.01（vs the blank control group，*P＜0.05，**P＜0.01）。

血清激素指標(biāo)/（μmol·mL－1）PROG GH E Androgen ACTH 甲狀腺激素 T3甲狀腺激素T4空白對(duì)照組 給藥前期 20 17.73±4.45 202.65±94.38 74.36±30.58 4.19±1.07 5.39±2.10 50.49±16.88 36.80±12.85給藥中期 10 16.73±1.40 156.04±57.54 63.39±1.31 4.09±0.61 4.75±0.36 62.50±9.85 32.99±3.20給藥末期 20 17.41±1.49 225.91±85.82 59.78±2.51 3.67±1.09 4.51±1.13 59.89±13.03 34.68±8.59 JXZKG低劑量組 給藥前期 20 20.10±6.63 192.06±102.42 70.59±22.04 3.96±1.04 4.67±1.28 46.37±17.45 46.63±19.99給藥中期 10 16.11±1.55 132.30±33.55 64.13±2.00 4.28±0.85 4.95±0.61 68.90±8.97 35.67±3.60給藥末期 20 17.37±1.96 234.49±73.92 59.49±2.39 3.91±1.02 4.87±1.10 51.68±12.43 35.15±9.20 JXZKG中劑量組 給藥前期 20 19.51±4.76 186.17±60.03 75.34±24.52 3.56±0.80 4.56±1.87 61.17±32.73 43.06±19.22給藥中期 10 15.94±1.52 149.94±35.45 63.81±2.09 4.22±0.60 4.68±0.32 67.81±13.43 31.73±3.03給藥末期 20 16.79±1.72 247.30±54.53 60.86±4.27 3.25±0.57 5.02±0.97 57.87±11.31 34.87±5.94 JXZKG高劑量組 給藥前期 20 21.34±3.87 177.60±76.55 83.92±20.34 4.12±0.82 4.72±1.97 74.98±35.22* 56.06±20.23**給藥中期 10 15.87±0.87 130.74±40.29 63.81±2.00 4.22±0.44 4.79±0.66 65.74±7.54 36.10±4.59給藥末期 20 18.09±1.75 269.47±64.34 59.60±2.97 3.47±1.01 4.87±1.23 59.66±19.66 35.49±10.66組別 階段 動(dòng)物數(shù)/只

3.10 大鼠免疫指標(biāo)檢查結(jié)果

如表7所示，給藥前期，JXZKG高劑量組免疫球蛋白IgA高于同期空白對(duì)照組（P＜0.05），其他時(shí)期各劑量組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表7 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠免疫指標(biāo)的影響(±s)Tab 7 Effect of JXZKG on the immune index of rats (±s)

表7 小兒荊杏止咳顆粒對(duì)大鼠免疫指標(biāo)的影響(±s)Tab 7 Effect of JXZKG on the immune index of rats (±s)

注（Note）：與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05（vs the blank control group，*P＜0.05）。

組別 階段 動(dòng)物數(shù)/只 免疫指標(biāo)/（μmol·mL－1）IgA IgM IgG IgE空白對(duì)照組 給藥前期 20 7.07±1.54 7.40±3.19 6.34±4.30 77.21±45.52給藥中期 10給藥末期 20給藥前期 20 7.28±1.12 7.93±1.99 8.75±2.57 111.56±17.40 7.67±1.26 6.39±1.47 7.19±2.73 101.09±25.07 JXZKG低劑量組 7.45±1.70 6.56±1.96 5.63±2.00 83.20±31.37給藥中期 10 7.77±1.14 8.82±1.28 10.33±2.91 113.13±23.23給藥末期 20 7.50±1.20 6.90±1.78 7.68±2.78 107.53±24.03 JXZKG中劑量組 給藥前期 20 7.83±2.53 6.66±1.45 5.46±2.67 80.58±36.00給藥中期 10 7.21±0.83 7.79±1.30 8.31±2.67 118.62±23.32給藥末期 20 7.92±1.60 6.85±1.55 9.05±4.43 114.17±29.44 JXZKG高劑量組 給藥前期 20 8.93±2.42* 6.75±2.01 6.34±2.84 90.68±34.33給藥中期 10 7.98±0.79 8.18±1.84 7.12±1.86 111.06±24.10給藥末期 20 7.75±1.66 6.82±1.54 8.59±2.94 118.42±26.26

3.11 組織病理學(xué)檢查結(jié)果

給藥前期、給藥中期和給藥末期及恢復(fù)期解剖的空白對(duì)照組及各劑量組動(dòng)物組織器官大小、顏色及質(zhì)地均未見明顯異常。給藥前期、給藥中期和給藥末期及恢復(fù)期組織病理學(xué)檢查均未發(fā)現(xiàn)JXZKG對(duì)幼齡SD大鼠腦、脊髓、垂體、胸腺、食管、氣管、甲狀腺/甲狀旁腺、唾液腺、胃腸道、胰腺、肝臟、腎臟、腎上腺、脾臟、肺臟、心臟、膀胱、睪丸、附睪、前列腺、精囊腺、卵巢和輸卵管、子宮和子宮頸、陰道、乳腺、哈氏腺、眼等組織有毒性意義的病理改變。

4 討論

4.1 JXZKG對(duì)一般評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

體質(zhì)量和體質(zhì)量變化是毒性的敏感指標(biāo)，幼齡動(dòng)物出生后早期增長相對(duì)快速，故10周齡前的體質(zhì)量每周至少稱量2次，以觀察體質(zhì)量的細(xì)微變化，并有助于更準(zhǔn)確地計(jì)算給藥量，更大限度地暴露藥物毒性[8-11]。且幼齡大鼠耳廓分離、睜眼和牙齒萌出等離乳前身體發(fā)育指標(biāo)與體質(zhì)量有明確的正相關(guān)，通過這些指標(biāo)可觀察和判斷受試藥物是否導(dǎo)致發(fā)育延遲。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，僅哺乳期及斷乳前期25.4 g生藥·kg－1組幼齡大鼠的體質(zhì)量與空白對(duì)照組比較有顯著性降低，相當(dāng)于臨床劑量（按體質(zhì)量計(jì)）的 10.2倍，但體質(zhì)量下降幅度不大（未超過同期空白對(duì)照組體質(zhì)量的10%），且此期間內(nèi)動(dòng)物體質(zhì)量增長速度相比同期空白對(duì)照組無明顯差異；6.3和12.7生藥·kg－1均對(duì)幼齡大鼠的體質(zhì)量增長無明顯影響；雖給予高劑量JXZKG會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體質(zhì)量下降，但并不會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生系統(tǒng)損傷，故認(rèn)為哺乳期及斷乳前期高劑量組動(dòng)物體質(zhì)量下降是灌胃給予高濃度的藥液產(chǎn)生的影響，無明顯毒理學(xué)意義。3個(gè)劑量均對(duì)幼齡大鼠的身體發(fā)育指標(biāo)無明顯影響。以上結(jié)果表明，JXZKG對(duì)幼齡大鼠生長發(fā)育無明顯影響。

4.2 JXZKG對(duì)特殊系統(tǒng)指標(biāo)的影響

特殊系統(tǒng)指標(biāo)主要包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、性發(fā)育和骨骼系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等[12-13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)性成熟評(píng)估和神經(jīng)行為測試、骨密度檢測以及對(duì)肝藥酶、血清球蛋白及激素指標(biāo)進(jìn)行檢測。性發(fā)育包括雄性睪丸下降、包皮分離和雌性陰道張開，檢測發(fā)現(xiàn)雄性大鼠睪丸下降發(fā)生在大鼠出生后22 d左右、包皮分離發(fā)生在42 d左右，陰道口張開發(fā)生在35 d左右，JXZKG低、中、高劑量均未引起其性發(fā)育時(shí)間點(diǎn)的改變，故JXZKG對(duì)幼齡大鼠性發(fā)育無明顯影響。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育評(píng)估應(yīng)包括個(gè)體發(fā)育反射、感覺運(yùn)動(dòng)功能、學(xué)習(xí)和記憶功能等[13]。由結(jié)果分析，JXZKG低、中、高劑量空中對(duì)翻正反射、聽覺驚愕反射和負(fù)向趨地性反射等神經(jīng)反射功能及協(xié)調(diào)性和自主活動(dòng)等學(xué)習(xí)記憶能力沒有明顯的影響，則JXZKG對(duì)幼齡大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)通過檢測脛骨長度和骨密度評(píng)價(jià)JXZKG對(duì)骨骼系統(tǒng)發(fā)育的影響。由結(jié)果分析，JXZKG低、中、高劑量與空白對(duì)照組比較骨密度和脛骨長度均未見明顯差異，則JXZKG對(duì)幼齡大鼠骨骼系統(tǒng)發(fā)育無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)通過檢測血清球蛋白IgG、IgA、IgE、IgM評(píng)估對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響。由結(jié)果分析，JXZKG低、中、高劑量與空白對(duì)照組比較血清球蛋白IgG、IgA、IgE、IgM未見規(guī)律性差異，則JXZKG對(duì)幼齡大鼠免疫系統(tǒng)發(fā)育無明顯影響。

綜上所述，JXZKG對(duì)幼齡大鼠身體發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)發(fā)育均無明顯影響。JXZKG對(duì)幼齡大鼠無發(fā)育毒性劑量為25.4 g生藥·kg－1，為臨床劑量（按體質(zhì)量計(jì)）的10.2倍。