廣藿香醇在體外對人肝微粒體中CYP3A4的非競爭性抑制作用研究

武夢琳，秦崇臻，柴玉娜，盧瑤瑤，汪新茹，張晶敏，齊光照（鄭州大學第一附屬醫院藥學部，鄭州450052）

細胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）是最重要的藥物代謝酶，在外源性藥物的解毒和內源性分子的生物合成中發揮著重要作用[1-2]。CYP3A4在藥物代謝酶中占舉足輕重的地位，超過60%的臨床藥物通過此酶代謝，并且其與許多藥物間的相互作用有關，因此藥物對于CYP3A4的抑制作用會導致藥物合用時出現毒副作用[3-4]。

已有許多關于中藥對CYPs抑制作用的研究，如三白草酮對CYP2C19的非競爭性抑制作用[5]，芹菜素對CYP2C9的抑制作用[6]，丹參提取物對CYP450的抑制作用[7-8]等。

廣藿香是我國傳統的中藥材，主要用于防治瘟疫、流行性感冒、腹痛等疾病，以廣藿香為主要成分的中成藥制劑也日益增多[9]。作為廣藿香揮發油的主要成分之一，廣藿香醇（patchouli alcohol，PA），又稱百秋李醇，是天然植物中提取的三環倍半萜化合物[10]，具有抗病毒、神經保護、抗炎、抗真菌以及胃腸調節等活性[11-13]。目前在臨床上，廣藿香醇也是多種中成藥的重要組分，如藿香正氣顆粒、小兒感冒顆粒以及小兒廣樸止瀉口服液等。其中廣藿香醇作為小兒感冒顆粒的有效成分之一，可以發汗解表，用于治療小兒外感風熱[14]；作為小兒廣樸止瀉口服液的主要成分之一，可以化濕健胃，對腹痛、腹瀉以及腹脹的治療有著較好的臨床效果[15]。在國家食品安全中，廣藿香醇因氣味宜人，也常作為食品添加劑和香精香料[16]。因此，應當特別注意廣藿香醇與其他藥物聯用時可能引起的藥物相互作用。

目前關于廣藿香醇的研究側重于含量測定、化學結構鑒定以及基礎藥理學方面[10，17-18]，而在藥物相互作用機制中的影響，以及藥物聯用時對CYPs是否有影響尚未有相關報道。為評估廣藿香醇的用藥安全，本文通過Cocktail法以探針底物為檢測體系，探討廣藿香醇在人肝微粒體和重組酶中的作用以及酶促動力學的影響，旨在為臨床提供安全合理的聯合用藥依據。

1 材料

1.1 儀器

美國Waters公司MS/MS系統：API型三重四級桿質譜儀，帶電噴霧離子化源（ESI）及數據采集Masslynx軟件；Waters 2695型超高效液相色譜儀帶自動進樣器和柱溫箱；Luna C18（150 mm×2.0 mm，5 μm）色譜柱。

1.2 試藥

香豆素（批號：01260595）、7-羥基香豆素（批號：54826）、甲苯磺丁脲（批號：T0891）、4-羥基甲苯磺丁脲（批號：UC160）、（S）-美芬妥英（批號：UC175）、4'-羥基美芬妥英（批號：H146）、美托洛爾（批號：80337）、α-羥基美托洛爾（批號：80073）、咪達唑侖（批號：M-908）、1-羥基咪達唑侖（批號：H-922）、曲馬多（批號：1672600）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G-6-PDH）、輔酶Ⅱ（β-NADP）（Sigma公司）。廣藿香醇（天津萬象恒遠科技有限公司，批號：WXHY-001994，HPLC測純度＞98%）。甲醇、甲酸、乙腈、叔丁基甲基醚和甲酸銨（廣州迪馬公司，色譜純）；實驗用水為娃哈哈純凈水；其余試劑為分析純。人肝微粒體和人重組酶（BD基因公司）。

2 方法

2.1 微粒體孵育條件

100 mmol·L－1K2HPO4-KH2PO4（pH＝7.4）的緩沖溶液反應體系（總體積為200 μL）中加入肝微粒體（終質量濃度為0.5 mg·mL－1）或重組酶（終質量濃度為0.5 mg·mL－1）、3.3 mmol·L－1的MgCl2、1.3 mmol·L－1的β-NADP、3.3 mmol·L－1的G-6-P和對應的藥物，37℃搖動水浴中預孵化5 min，加入0.4 U·mL－1的G-6-PDH（20 μL），37℃水浴20 min之后用含1.13 μmol·L－1曲馬多（內標）的100 μL甲醇終止反應。加入1 mL叔丁基甲基醚，震蕩5 min，3500×g離心10 min。分離出800 μL有機層用氮氣吹干，100 μL流動相溶解之后進樣10 μL到質譜系統。

2.2 色譜、質譜條件

采用課題組以前建立并驗證的方法[19]。流動相為10 mmol·L－1乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈（13∶87，V/V），流速為0.25 mL·min－1，總時間為5 min。離子源溫度和去溶劑溫度分別為100℃和400℃。錐孔氣和脫溶劑氣分別設定為50 L·h－1和400 L·h－1。ESI源，MRM掃 描，正離子模式監測。

2.3 廣藿香醇對肝微粒體酶抑制動力學實驗

2.3.1 廣藿香醇對CYP450的抑制作用 加入濃度分別為0、0.1、1和10 μmol·L－1廣藿香醇，孵育體系下測定每個CYP450對應的特異性底物的代謝物濃度。每個樣品平行做3份。

加入濃度分別為0.01、0.1、1、10和100 μmol·L－1廣藿香醇，孵育體系下測定CYP3A4酶活性，將所得數據以抑制劑濃度的log值（μmol·L－1）作為橫坐標，剩余活性率（%）作為縱坐標作圖。采用Graphpad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）軟件計算廣藿香醇的IC50。

2.3.2 廣藿香醇在人肝微粒體中對CYP3A4的抑制模型 為了驗證廣藿香醇的抑制類型，將廣藿香醇（0、5、10 μmol·L－1）在加入NADPH的人肝微粒體中預孵育0、10或30 min，然后加入CYP3A4特異性底物咪達唑侖（5、10或20 μmol·L－1），37℃孵育30 min。每個樣品平行做3份。所得數據采用SigmaPlot軟件（版本10.0，Systat software，Inc.：Chicago，IL，USA） 做Lineweaver-Burk圖和二次作圖。

2.3.3 CYP3A4重組酶驗證實驗 為驗證廣藿香醇選擇性抑制CYP3A4，將廣藿香醇（0.01、0.1、1、10和100 μmol·L－1）、咪達唑侖和NADPH系統在10 pmol人重組CYP3A4酶中37℃孵育30 min。每個樣品平行做3份。所得數據以抑制劑濃度的log值（μmol·L－1）作為橫坐標，剩余活性率（%）作為縱坐標作圖，采用Graphpad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）軟件計算廣藿香醇的IC50。

2.4 統計分析

計算人肝微粒體中不同濃度廣藿香醇對酶活性的影響，每個樣品平行3份，數據表示為平均值±SD，采用方差分析，P＜0.05示差異有統計學意義。使用GraphPad Prism 5.0（San Diego，CA，USA）通過非線性回歸計算50%抑制濃度（IC50）值。Lineweaver-Burk圖采用SigmaPlot軟件（版本10.0，Systat software，Inc.：Chicago，IL，USA）制作。

3 結果

3.1 廣藿香醇對人肝微粒體中CYP450酶的抑制作用

加入不同濃度廣藿香醇（0、0.1、1和10 μmol·L－1）后對酶底物代謝產物進行測定，分析剩余活性，結果見圖1A。由圖可知廣藿香醇對人肝微粒體CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19和CYP2D6并無明顯的抑制作用，且與濃度無關。而在圖1B中，隨著廣藿香醇濃度升高，肝微粒體CYP3A4 活性明顯下降，其IC50值為5.195 μmol·L－1。提示當藥物經由CYP3A4代謝時，廣藿香醇可能對其會有抑制作用。

圖1 人肝微粒體中不同濃度廣藿香醇對CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6酶（A）和CYP3A4酶（B）活性的影響Fig 1 Effect of different concentrations of PA on the enzyme activities of CYP2A6，CYP2C9，CYP2C19 and CYP2D6（A），and CYP3A4（B）in human liver microsomes

3.2 廣藿香醇對CYP3A4的抑制特點

從圖2可以看出，不同濃度的廣藿香醇對CYP3A4抑制作用不同，隨著廣藿香醇濃度的增加，CYP3A4活性降低；而不同時間段的廣藿香醇對CYP3A4抑制作用沒有明顯的差異。因此廣藿香醇呈現濃度依賴性地抑制肝微粒體中CYP3A4催化的咪達唑侖羥基化，但不具有時間依賴性。

圖2 廣藿香醇對CYP3A4酶的抑制特點Fig 2 Inhibition characteristics of PA on CYP3A4 enzyme

3.3 廣藿香醇對CYP3A4的抑制作用類型分析

以底物濃度1/[S]作為橫坐標，反應速度1/[V]作為縱坐標，按 Lineweaver-Burk 法作圖，確定提取物的抑制類型，結果見圖3A。以廣藿香醇濃度作為橫坐標，Lineweaver-Burk圖中幾條直線的斜率作為縱坐標，作圖得圖3B，據此可以得到廣藿香醇抑制常數（Ki）。

從圖3A中可以看出，不同濃度廣藿香醇共同孵育之后所得的曲線有一個共同交點并且落在橫坐標軸上，說明廣藿香醇對于CYP3A4抑制類型為非競爭性抑制。從圖3B中可以計算得到廣藿香醇抑制常數Ki為0.86 μmol·L－1。

圖3 廣藿香醇對CYP3A4酶代謝的動力學直線回歸方程Fig 3 Kinetic linear regression equation of PA for CYP3A4 enzyme metabolism

3.4 廣藿香醇對CYP3A4重組酶的抑制作用

采用10 pmol人重組CYP3A4與廣藿香醇共同孵育，驗證廣藿香醇對于CYP3A4選擇性抑制作用，結果見圖4，發現廣藿香醇可以顯著抑制CYP3A4活性，其IC50值為5.625 μmol·L－1，廣藿香醇對CYP3A4具有選擇性抑制作用，這與在人肝微粒體中實驗結果一致。

圖4 人重組CYP3A4酶中廣藿香醇（0.01、0.1、1、10及100 μmol·L－1）對咪達唑侖代謝的影響Fig 4 Effect of PA（0.01，0.1，1，10 and 100 μmol·L－1） on midazolam metabolism in recombinant human CYP3A4 enzyme

4 討論

聯合用藥在患者治療過程中非常普遍，但是聯合用藥過程中存在藥物相互作用的可能性。藥物相互作用一般由CYPs酶代謝引起，從而導致嚴重的不良反應[20-21]。目前，有關藥物相互作用的報道越來越多，因此研究藥物對CYPs的抑制作用可以預測可能發生的藥物相互作用，從而避免或減少聯合用藥時的嚴重不良反應發生。廣藿香醇具有抗炎、抗氧化、抑菌、抑制病毒、抗克氏錐蟲、免疫調節、抗腫瘤等藥理活性[9-13，17]。其在臨床使用的過程中，可能會與經 CYP3A4代謝消除的藥物聯合使用，從而影響藥物的有效性和安全性。常見含廣藿香醇的藥物如藿香正氣水，應當特別注意與其他藥物聯用時可能引起的藥物相互作用。本研究利用經典的肝微粒體體外孵育模型，探討廣藿香醇對CYP3A4的影響及作用機制。

本研究首次檢測了廣藿香醇對CYPs 的抑制作用、抑制類型以及機制模型，發現廣藿香醇對CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6活性沒有明顯的抑制作用，對CYP3A4活性的抑制作用呈濃度依賴性，但不具有時間依賴性。在廣藿香醇對CYP3A4的抑制作用類型分析中，得到了Ki值為0.86 μmol·L－1，可以判斷藥物抑制作用的類型主要是非競爭性抑制。隨后采用體外人肝微粒體孵育和重組酶驗證作為主要的實驗方法，通過CYP3A4重組酶驗證了這一結果。因此，當聯用藥物經由CYP3A4代謝時，可能會由于廣藿香醇的抑制作用，該藥不能被及時代謝，而導致藥物的血藥濃度升高，造成蓄積中毒等情況。這為預測藥物和藥物之間的相互作用以及臨床上應用含廣藿香醇成分的藥物的安全性提供了參考，但其在臨床使用中的真實情況，尚需動物體內實驗以及臨床試驗的驗證。