毛細管氣相色譜法同時測定鹽酸妥洛特羅原料的殘留溶劑、雜質與含量

陳子龍，路京，趙麗，呂倩，杜思迪（陜西省渭南市檢驗檢測研究院食品藥品檢驗中心，陜西 渭南 714000）

鹽酸妥洛特羅為腎上腺素β受體興奮劑，對支氣管平滑肌具有強而持久的擴張作用，對心臟的興奮作用較弱，臨床適用于緩解支氣管哮喘、急慢性支氣管炎、肺氣腫和塵肺等呼吸道阻塞性癥狀[1]。其現行標準為國家食品藥品監督管理局標準WS-10001-（HD-0558-2002）[2]，在具體操作中存在以下問題：一是現行標準采用薄層色譜法，用2%自身對照檢查雜質限度，該方法檢測靈敏度低，自身對照的斑點幾乎觀察不到，且樣品斑點在該色譜條件下有拖尾現象，影響結果判定，方法的專屬性和準確性較差；二是根據鹽酸妥洛特羅原料的生產工藝，其在生產過程中可能使用了乙醇、正己烷、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、1，4-二氧六環、乙酸乙酯、乙酸丁酯等多種有機溶劑，但現行標準僅對乙酸乙酯進行了控制，JPXVⅡ等其他國外現行標準中均未對殘留溶劑進行控制；三是含量測定采用以醋酸汞溶液為溶劑的高氯酸非水滴定法，而醋酸汞對環境和人體危害較大，應避免使用。本文參考相關文獻[3-14]，建立了毛細管氣相色譜法，經方法學驗證，對鹽酸妥洛特羅原料的7種殘留溶劑、雜質鄰氯苯乙酮和鹽酸妥洛特羅含量同時進行測定，彌補了原標準殘留溶劑項組分缺失，杜絕了含量測定的汞污染，還可以對雜質鄰氯苯乙酮的殘留量進行檢測，極大提高了檢驗效率，可更好地用于本品的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

6890N氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；XPE-105電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；全自動空氣源HA-300型（北京中惠普分析技術研究所）。

1.2 試藥

鹽酸妥洛特羅對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100472-202002，含量：99.4%），鹽酸妥洛特羅原料（某公司，批號：20171001，20171002，20171003，按干燥品計，純度＞99.0%）；二甲基亞砜、無水乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環、乙酸丁酯、鄰氯苯乙酮（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent DB-624（30 m×320 μm×1.8 μm）毛細管色譜柱，程序升溫，起始溫度為55℃，維持2 min，以10℃·min－1的速率升溫至180℃，再以50℃·min－1的速率升溫至240℃，維持10 min；進樣口溫度240℃；檢測器溫度250℃，流速1.5 mL·min－1，分流比10∶1，進樣體積1 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取無水乙醇247.0 mg、二氯甲烷32.83 mg、甲基叔丁基醚249.9 mg、正己烷14.30 mg、乙酸乙酯248.6 mg、1，4-二氧六環21.16 mg、乙酸丁酯253.4 mg、鄰氯苯乙酮53.93 mg，同置100 mL量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液①；精密稱取鹽酸妥洛特羅對照品100.23 mg，置10 mL量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，得對照品儲備液②；精密量取對照品儲備液①和②各1 mL置10 mL量瓶中，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品溶液。

2.2.2 殘留溶劑和鄰氯苯乙酮測定供試品溶液精密稱取鹽酸妥洛特羅樣品適量，用二甲基亞砜溶解并稀釋制成每1 mL約含50 mg的溶液，即得。

2.2.3 含量測定供試品溶液 精密稱取鹽酸妥洛特羅樣品適量，用二甲基亞砜溶解并稀釋制成每1 mL約含1 mg的溶液，即得。

2.3 系統適用性試驗

分別取空白溶劑（二甲基亞砜）、對照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，結果溶劑對測定無干擾，出峰順序依次為乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環、乙酸丁酯、鄰氯苯乙酮和鹽酸妥洛特羅，上述組分與相鄰峰分離度均符合要求，色譜圖見圖1。

圖1 氣相色譜圖Fig 1 GC chromatograms

2.4 線性關系考察

分別精密量取對照品儲備液①、②，適量稀釋得系列線性溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，以峰面積對對照品溶液質量濃度進行線性回歸，得線性方程，結果顯示，在各自線性范圍內，各組分均與測定值呈良好的線性關系，結果見表1。

表1 各組份的線性、范圍、檢測限及定量限Tab 1 Linear relationship，range，LOD and LOQ of components

2.5 回收試驗

2.5.1 殘留溶劑和鄰氯苯乙酮測定回收率 精密稱取本品約0.5 g，共6份，分別置10 mL量瓶中，精密加入對照品儲備液①1 mL，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算回收率，結果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環、乙酸丁酯、鄰氯苯乙酮的回收率分別為99.8%、98.8%、99.3%、99.0%、99.5%、98.6%、99.2%和100.2%，RSD均＜3.0%。

2.5.2 含量測定回收率 精密稱取本品約5 mg，共9份，分別置10 mL量瓶中，分別精密加入對照品儲備液②0.3、0.5和0.7 mL，用二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，即得低、中、高3個濃度的加樣回收測定樣品溶液。取對照品溶液和上述溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算回收率，結果鹽酸妥洛特羅低、中、高3個濃度的平均回收率為99.7%、99.8%、99.8%，RSD為0.60%、0.30%、0.40%。

2.6 檢測限與定量限

取混合對照品溶液逐步稀釋，稀釋后的樣品按“2.1”項下色譜條件進行分析，得不同組分的定量限和檢測限，結果見表1。

2.7 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，結果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、乙酸乙酯、1，4-二氧六環、乙酸丁酯、鄰氯苯乙酮和鹽酸妥洛特羅的峰面積的RSD分別為1.6%、2.1%、1.9%、1.8%、1.2%、2.2%、1.7%、1.1%和1.0%，表明本方法精密度良好。

2.8 重復性試驗

取批號為20171001的樣品，分別按“2.2”項下方法制備殘留溶劑和雜質測定供試品溶液及含量測定供試品溶液各6份。取對照品溶液和上述溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算樣品中殘留溶劑、鄰氯苯乙酮和鹽酸妥洛特羅的含量，結果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、1，4-二氧六環、乙酸丁酯、鄰氯苯乙酮均未檢出，乙酸乙酯的含量為0.008%（RSD為2.0%），鹽酸妥洛特羅含量為100.0%（RSD為1.3%）。

2.9 穩定性試驗

取批號為20171001的樣品，分別按“2.2”項下方法制備殘留溶劑和雜質供試品溶液及含量測定供試品溶液各1份。分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣分析，結果乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、1，4-二氧六環、乙酸丁酯、鄰氯苯乙酮均為未檢出，乙酸乙酯峰面積的RSD為1.4%，鹽酸妥洛特羅峰面積RSD為1.2%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.10 耐用性試驗

耐用性試驗結果表明，采用不同品牌極性相同的色譜柱[Agilent DB-624（30 m×530 μm×3.0 μm），Agilent DB-624（30 m×320 μm×1.8 μm）；DIKMA DB-624（30 m×250 μm×1.4 μm）]，適當改變載氣流速和柱溫，均可滿足系統適應性試驗要求。

2.11 樣品測定

取3批樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行分析，結果3批樣品中殘留溶劑乙醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、1，4-二氧六環、乙酸丁酯均未檢出；3批樣品中乙酸乙酯的含量分別為0.008%、0.004%和0.004%，均符合《中國藥典》（2020年版四部0861）殘留溶劑的限度要求；鄰氯苯乙酮均未檢出；鹽酸妥洛特羅含量與現行標準（采用高氯酸非水滴定法測定）結果基本一致，見表2。

表2 不同方法測定鹽酸妥洛特羅含量結果 (%)Tab 2 Determination of tulobuterol hydrochloride by different methods (%)

3 討論

3.1 鄰氯苯乙酮限度的確定

鄰氯苯乙酮為無色油狀液體，吞食有害，刺激眼睛、呼吸系統和皮膚。被國際癌癥研究機構（IARC）鑒別為可能的或肯定的人類致癌物，半致死劑量（LD50）為1.820 mg·kg－1（經口-大鼠），結合本品推薦的最大治療劑量，推算出本品中鄰氯苯乙酮的理論限度為9.1%，本方法擬定限度為0.1%，遠低于理論雜質限度。

3.2 溶劑的選擇

根據鹽酸妥洛特羅的溶解性試驗可知，本品在水、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亞砜中易溶，因正己烷等待測組分在水中不溶，因此對甲醇、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺和二甲基亞砜等4種溶劑進行了試驗，發現二甲基亞砜作為溶劑，各組分峰形良好，靈敏度高，因此選擇二甲基亞砜為溶劑。

3.3 色譜條件的優化

由于待測的9個組分中，二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷沸點與極性相近，分離難度大，同時全部9個組分之間的極性差異大，因此優先選擇中等極性的DB-624色譜柱，以兼顧各組分的不同極性。試驗過程中也考察了非極性的DB-1和極性的DB-WAX色譜柱，結果表明各組分的分離和色譜峰的對稱性均不如DB-624色譜柱。

在梯度洗脫程序的優化過程中，考慮到各組分沸點各不相同，跨度大，從最低的39.8℃（二氯甲烷）到264.2℃（鹽酸妥洛特羅）。因此選擇較低的起始溫度和升溫速率，確保沸點較低的7種殘留溶劑分離良好，然后以較快的升溫速率迅速升溫至240℃并維持10 min，使溶劑和其他信號雜質在坡度基線出峰，待測的鄰氯苯乙酮和鹽酸妥洛特羅在基線平穩處出峰。此外，在確保各組分分離度符合要求的前提下，適當提高流速至1.5 mL·min－1，以縮短進樣分析時間，提高工作效率。