轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白對(duì)子癇前期的診斷和治療作用研究

馬曉鵬，曹廣明，劉崇東

（1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100020）

子癇前期是孕期常見(jiàn)的嚴(yán)重妊娠并發(fā)癥，是目前孕產(chǎn)婦及圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一[1]，有文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病率約為12%[2]，在我國(guó)孕產(chǎn)婦發(fā)病率為2%～6%[3]。迄今為止，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，任何單一的病因?qū)W說(shuō)均不能解釋其病因和發(fā)病機(jī)制[4-5]。為改善母兒預(yù)后，子癇前期的診斷及治療是目前臨床研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。已有研究表明，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，TTR）是子癇前期孕婦重要的差異性表達(dá)蛋白之一[6]。本研究使用亞硝基左旋精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）法建立子癇前期小鼠模型，通過(guò)分析TTR對(duì)子癇前期孕鼠及其子代病理生理變化的影響，為子癇前期的診斷及治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備 選取健康無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)CD-1雌性小鼠37只，雄性小鼠10只，體質(zhì)量25～28 g，飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所屏障系統(tǒng)內(nèi)。選用8周齡左右的雌鼠和9周齡左右的雄鼠，于每天17:00將小鼠按照雌鼠∶雄鼠2∶1合籠過(guò)夜，次日晨8:00檢查雌鼠有無(wú)陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓之日即認(rèn)定為妊娠第1天。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 按完全隨機(jī)分組法將孕鼠分為四 組：對(duì) 照 組9只，TTR組8只，L-NAME組11只，L-NAME+TTR組9只。處理方法如下：對(duì)照組在妊娠第7～11天皮下注射生理鹽水50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射生理鹽水100 μL；TTR組在妊娠第7～11天皮下注射生理鹽水50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔 注 射TTR 100 μg。L-NAME組 和L-NAME+TTR組用L-NAME法建立子癇前期小鼠模型：于妊娠第 7天開(kāi)始行 L-NAME 50 mg/（kg·d）皮下注射，連續(xù)注射 5 d即妊娠第 11 天建立模型。L-NAME組在妊娠第7～11天皮下注射L-NAME 50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射生理鹽水100 μL；L-NAME+TTR組在妊娠第7～11天皮下注射L-NAME 50 mg/（kg·d），妊娠第11天腹腔注射TTR 100 μg。

1.3 小鼠血壓及尿蛋白測(cè)定及血清中TTR的檢測(cè) 從妊娠第6天開(kāi)始，隔日對(duì)孕鼠進(jìn)行血壓測(cè)量，通過(guò)無(wú)創(chuàng)鼠尾血壓計(jì)，利用尾套法測(cè)量小鼠的收縮壓、舒張壓和平均動(dòng)脈壓，每只小鼠采集6次血壓值，最終以平均值作為當(dāng)天的血壓值。于妊娠第17天采用應(yīng)激性排尿法收集小鼠尿液，將尿液常溫瞬時(shí)離心，保存于－80 ℃冰箱，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）進(jìn)行尿蛋白檢測(cè)。小鼠妊娠第18天，用眼眶后靜脈叢采血法留取血標(biāo)本，將血標(biāo)本于離心機(jī)中以2 000 r/min、4 ℃離心15 min，吸取血清于－80 ℃冰箱保存，用ELISA進(jìn)行血清TTR檢測(cè)。

1.4 子代發(fā)育情況比較 孕鼠妊娠第18天抽血成功后，采用頸椎脫臼法處死小鼠，暴露子宮，見(jiàn)孕鼠子宮呈“Y”型、壁薄，兩側(cè)宮腔內(nèi)可見(jiàn)鼠胎及胎盤。自子宮遠(yuǎn)端沿子宮血管網(wǎng)對(duì)側(cè)剪開(kāi)子宮，依次取出胎仔及胎盤，計(jì)數(shù)正常形態(tài)胎仔和胎盤數(shù)量。并將胎仔及胎盤置于分析天平上稱取質(zhì)量，精確至0.001 g。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布或近似正態(tài)分布且方差齊時(shí)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)分布或方差不齊時(shí)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組孕鼠血壓情況比較 于小鼠妊娠第7天始皮下注射L-NAME后，子癇前期組（包括L-NAME組和L-NAME+TTR組）孕鼠的收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓與對(duì)照組比較，均出現(xiàn)了明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；妊娠第11天經(jīng)過(guò)腹腔注射TTR后，L-NAME+TTR組孕鼠的收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓較L-NAME組均明顯下降，以舒張壓下降幅度更為明顯，但各項(xiàng)血壓值仍高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；TTR組孕鼠的血壓與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組孕鼠的血壓變化

2.2 各組孕鼠尿蛋白水平比較 L-NAME組孕鼠的尿蛋白定量較對(duì)照組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；注 射TTR后 的L-NAME+TTR組 孕 鼠的尿蛋白較L-NAME組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TTR組孕鼠尿蛋白與對(duì)照組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 各組孕鼠血清TTR含量比較 應(yīng)用ELISA方法對(duì)各組孕鼠血清內(nèi)TTR含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示子癇前期組孕鼠血清內(nèi)TTR的含量較對(duì)照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)用TTR干預(yù)治療后，L-NAME+TTR組孕鼠血清TTR水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)合孕鼠血壓以及尿蛋白的變化，表明TTR干預(yù)明顯改善了小鼠的子癇前期樣癥狀和尿蛋白異常。結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 各組子代發(fā)育情況比較 四組孕鼠均于妊娠第18天處死，見(jiàn)孕鼠子宮呈“Y”型，壁薄，兩側(cè)宮腔內(nèi)可見(jiàn)胎仔及胎盤，見(jiàn)圖4。記錄各組孕鼠的妊娠數(shù)量，分離出胎仔與胎盤，見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示：子癇前期組孕鼠的胎仔質(zhì)量及胎盤質(zhì)量均明顯低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），L-NAME組可見(jiàn)死胎1例；應(yīng)用TTR后的L-NAME+TTR組，其胎盤與胎仔質(zhì)量較L-NAME組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明TTR可逆轉(zhuǎn)子癇前期胎盤與胎仔質(zhì)量的下調(diào)改變，見(jiàn)圖6。

圖4 待分離的胎仔與胎盤

圖5 已分離的胎仔與胎盤

圖6 各組孕鼠間胎盤質(zhì)量（左）及胎仔質(zhì)量（右）比較結(jié)果

3 討論

子癇前期是妊娠期特有的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，其主要的病理、生理變化是全身小動(dòng)脈痙攣，可導(dǎo)致母兒嚴(yán)重的并發(fā)癥，目前仍是導(dǎo)致孕婦及圍產(chǎn)兒患病及死亡的主要病因之一[7]。另有研究表明，子癇前期與產(chǎn)后成人心血管疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)[8]；暴露于子癇前期的子代，成年后血壓及體質(zhì)量指數(shù)增高的風(fēng)險(xiǎn)增加，發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)增高[9]。因此，如何有效地預(yù)防和治療子癇前期已成為目前全世界共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。

子癇前期的發(fā)病學(xué)說(shuō)眾多，但任何一個(gè)病因?qū)W說(shuō)都不能解釋所有子癇前期的病因和發(fā)病機(jī)制，我們對(duì)子癇前期的發(fā)病機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。動(dòng)物模型可以再現(xiàn)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為疾病的治療及預(yù)防提供思路，是目前進(jìn)行疾病發(fā)病機(jī)制、治療研究的主要方法之一。L-NAME是一氧化氮合酶抑制劑，可使一氧化氮的合成減少，引起小鼠全身血管收縮，從而模擬子癇前期的主要病理生理改變[10]。本研究中應(yīng)用L-NAME后，可見(jiàn)子癇前期模型組的孕鼠出現(xiàn)了明顯的血壓升高、尿蛋白增多、胎仔體質(zhì)量減低等表現(xiàn)，有效地模擬了子癇前期的主要病理、生理表現(xiàn)。因此，無(wú)論是從孕鼠或是從其子代方面分析，這種建模方法是成功可行的，而且此法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，造模成功率高，故而可予以廣泛應(yīng) 用。

TTR最初被稱作前白蛋白，于1942年首次在血清及腦脊液中被發(fā)現(xiàn)[11-12]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，TTR在子癇前期患者血清中的表達(dá)濃度明顯下調(diào)[6]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TTR在監(jiān)測(cè)病情變化及對(duì)治療反應(yīng)方面也可能具有一定的意義：子癇前期病情越重，TTR下降的趨勢(shì)越明顯[13]，在診斷重度或輕度子癇期具有明確的意義[14-15]。

既往Nakashima等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期動(dòng)物模型中血漿TTR值明顯低于對(duì)照組，TTR以聚集的形式沉積在胎盤組織，并導(dǎo)致胎盤組織壞死、誘發(fā)胎盤功能障礙。本研究中，TTR在子癇前期孕鼠血清中的表達(dá)均明顯低于正常孕鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。這可能是由于子癇前期的病理過(guò)程中，TTR蛋白四聚體變性轉(zhuǎn)化為無(wú)活性的TTR單體而沉積于胎盤組織，不能行使其正常的生物學(xué)功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，加重胎盤功能減退，進(jìn)一步導(dǎo)致胎盤分泌TTR水平、血活性TTR水平均下降[17-19]。另有學(xué)者通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)TTR可以抑制類似子癇前期的臨床表現(xiàn)和（或）病理改變，包括新發(fā)病的蛋白尿、高血壓、腎小球內(nèi)皮增生及抗血管生成因子的生成等[20]。本研究結(jié)果還表明應(yīng)用TTR干預(yù)后，可改善其血壓及尿蛋白升高的變化，并可使胎盤及胎仔質(zhì)量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。這說(shuō)明外源性TTR對(duì)于子癇前期病理過(guò)程的逆轉(zhuǎn)、改善母胎結(jié)局可能有積極作用。

綜上所述，本研究提示TTR的表達(dá)下調(diào)對(duì)子癇前期可能具有一定的診斷作用，TTR在一定程度上可以逆轉(zhuǎn)子癇前期導(dǎo)致的血壓升高、尿蛋白升高等病理改變。另外，本研究還初步評(píng)價(jià)了TTR對(duì)改善母胎結(jié)局的療效。這些有助于更深入地了解子癇前期的發(fā)病機(jī)制，從而為臨床防治該病拓展新的思路。我們期待TTR作為新型的子癇前期的預(yù)測(cè)因子及治療靶點(diǎn)在子癇前期的診斷和治療中發(fā)揮重要的作用。