自然發酵牦牛酸奶中乳酸菌的分離鑒定

金鑫燕，閆忠心

(青海大學畜牧獸醫科學院，西寧 810016)

乳酸菌是一類革蘭氏染色呈陽性的桿菌或球菌，不形成芽孢，不運動，過氧化氫酶試驗呈陰性，對葡萄糖發酵能產生50%以上乳酸，而且在缺少氧氣的環境中生長良好的兼性厭氧性細菌的總稱。在形態學上，主要包括乳酸桿菌和乳酸球菌屬兩個主要類群。乳酸菌在自然界中分布相當廣泛，在土壤、植物根系和許多人類食品、動物的飼料，還有自然界的湖泊和河水、污泥以及一些臨床樣品中都發現有乳酸菌的存在[1]。乳酸菌能促進營養物質的分解和吸收、促進乳糖吸收減少乳糖不耐受、調節體內消化道的正常菌群、維持微生態平衡、使胃腸道健康、增強免疫功能[2-4]。乳酸菌廣泛用于乳制品、蔬菜和肉類產品的發酵和防腐中。許多乳酸菌除產生乳酸、乙酸、雙乙酰和過氧化氫外，還能產生多種具有抑菌或殺菌生物活性物質，在抑制各種病原菌和食物腐敗等方面起重要作用[5，6]。

牦牛乳跟我國高寒牧區牧民生活息息相關。與普通牛乳相比，牦牛乳含有豐富的蛋白質、必需氨基酸、脂肪、乳糖和礦物質，具有極高的營養價值[7]，其礦物質易被人體吸收和利用[8，9]。同時，傳統牦牛酸奶微生物菌群能夠產生多種對人身體健康有益的物質如維生素、氨基酸等，彌補了牧民對必須氨基酸、維生素及礦物質攝入的不足，平衡了牧民的飲食結構[10]。牧民沿用傳統方法加工牦牛酸奶和牦牛酥油等乳制品，較好地保存當地自然環境中的有益微生物(特別是乳酸菌)[11]。有研究表明，傳統牦牛酸奶來源的乳酸菌具有抗氧化作用與清除氧自由基能力[12-14]。因此，發酵牦牛酸奶是乳酸菌的資源寶庫，通過分離出牦牛酸奶中的乳酸菌，對其菌種進行分離鑒定，將為牦牛酸奶的商品開發提供研究基礎[15-17]。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品采自青海省海北藏族自治州海晏縣、黃南藏族自治州澤庫縣及同仁市3個不同地區當地居民自然發酵的牦牛酸奶。

1.2 試劑及耗材

試驗試劑：生理鹽水、MRS(Man Rogosa Sharpe broth)培養基、結晶紫染色液、革蘭氏碘液、沙黃復染液、茚三酮溶液、75%酒精、蒸餾水。

試驗耗材：無菌均質袋、無菌試管、微量移液器及配套吸頭、無菌錐形瓶等。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品的采集

將采集好的牦牛酸奶移至于無菌的密封袋內封口，標記采集地名稱、序號、奶源等信息后迅速放入裝有冰袋的冰盒內。隨時更換冰袋，將牦牛酸奶保持在低溫的環境下帶回實驗室，進行乳酸菌的分離培養。

1.3.2乳酸菌的分離純化及鑒定

1.3.2.1準備工作 將樣品用無菌生理鹽水進行梯度稀釋后，分別吸取0.1mL傾注于MRS瓊脂培養基上，用涂布棒在MRS瓊脂平板進行表面涂布，每個稀釋度做兩個平皿。然后放入36℃±1℃恒溫厭氧環境中培養72±2h。

1.3.2.2乳酸菌的純培養 準備工作：取出第一次培養的平板，觀察菌落是否形成后，使用接種環挑取有透明環的、大小、形狀、顏色不同的單個菌落，分區劃線在滅菌MRS瓊脂培養基上，36℃±1℃厭氧條件下培養48h，進一步純化菌株。待平板上菌落形成后，在光線充足的地方觀察平板中的菌落是否為單一、相同的菌落，如有不同菌落，繼續分離純化。直到培養基表面生長的全部為單一、相同的菌落時，對菌株進行編號，并記錄顏色、大小、表面突起程度等特征。

1.3.2.3乳酸菌的形態學鑒定 用接種環挑取適量生長良好的分離株菌落，涂片、固定于載玻片上，放置待冷后進行革蘭氏染色。在顯微鏡下仔細觀察和記錄細胞染色情況、細胞形態和分散情況。在鏡檢觀察時紫色或藍紫色呈陽性反應，紅色為陰性反應。

1.3.2.4乳酸菌的生化鑒定 利用生化鑒定試劑盒(蔗糖發酵管、纖維二糖發酵管、麥芽糖發酵管、甘露醇發酵管、水楊苷發酵管、山梨醇發酵管、乳糖發酵管、七葉苷發酵管、棉子糖發酵管、1%馬尿酸鈉發酵管)對從中分離到的乳酸菌進行菌種的鑒定。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌分離鑒定結果

2.1.1乳酸菌菌落形態特征

從三個地區不同樣品中分離出10株乳酸菌。培養基的菌落形態主要呈現出表面光滑，中部稍微凸起或平坦、邊緣整齊的白色菌落，以及菌落中間凸起或平坦、具有粗糙的表面，以及具有邊緣不整齊的乳白色菌落。各菌株的具體形態見圖1-圖3，特征見表1。

圖 1 海晏縣牦牛乳奶乳酸菌形態特征

圖 2 同仁縣牦牛酸奶乳酸菌形態特征圖

圖3 澤庫縣牦牛酸奶乳酸菌形態特征圖

表1 乳酸菌的形態特征

2.1.2乳酸菌鏡檢結果

乳酸桿菌部分彎曲，分布不規則。乳酸鏈球菌排列成圓形簇狀。

從鏡檢結果圖4來看，1為桿狀，2、3、4均為鏈球狀。

圖4 海晏縣牦牛酸奶中乳酸菌鏡檢結果

從鏡檢結果圖5來看，1、3、4均為桿狀，2為鏈球狀。

圖5 同仁市牦牛酸奶中乳酸菌鏡檢結果

從鏡檢結果圖6來看，1、2均為鏈球狀。

圖6 澤庫縣牦牛酸奶中乳酸菌鏡檢結果

2.1.3乳酸菌生化鑒定結果

生化鑒定管在37℃下培養24h以后結果如表2所示。

表2 發酵管生化鑒定

經過生化鑒定發酵管試驗，結合各乳酸菌鏡檢結果圖得出表2，從三個地區不同樣品中分離出10株乳酸菌。其中4株為桿菌分離株和6株球菌分離株。海晏縣樣品菌種有干酪乳桿菌干酪亞種L.caseisubsp.casei和嗜熱鏈球菌S.thermophilus，同仁市樣品中的菌種有嗜酸乳桿菌L.acidophilus、嗜熱鏈球菌S.thermophilus和羅伊氏乳桿菌L.reuieri，澤庫縣樣品中的菌種為嗜熱鏈球菌S.thermophilus。

3 討論

3.1 其他動物酸奶制品中乳酸菌群組成分析

孟和畢力格等從內蒙古采集的10份雙峰駝酸奶和1份新鮮駝奶中分離得出30株乳酸菌，分別歸屬于乳桿菌屬，乳球菌屬，腸球菌屬和明串珠菌屬等14種：德氏乳桿菌乳亞種、植物乳桿菌、干酪乳桿菌干酪亞種、干酪乳桿菌假植物亞種、發酵乳桿菌、彎曲乳桿菌、香腸乳桿菌和嗜酸乳桿菌群的菌株；乳酸球菌乳亞種、糞腸球菌、鳥腸球菌和堅強腸球菌；腸膜明串珠菌葡聚糖亞種和腸膜明串珠菌腸膜亞種。其中桿菌16株，球菌14株[18]。賈旭等從內蒙古采集了35份山羊奶及奶制品樣品分離出31株乳酸菌。并表明在新鮮山羊奶、山羊酸奶和稀奶油中均能分離得到乳酸菌，這些菌分別歸屬于乳桿菌屬、腸球菌屬和乳球菌屬3個屬8個種，乳酸桿菌為20株，乳酸球菌為11株[19]。該地區乳酸桿菌比乳酸球菌豐富，這是分離菌株在溫差較大的環境中長期適應的結果。由于季節變化和包內生活做飯加熱導致包裝內溫度變化特別大，從而導致了從內蒙古牧區分離到的乳酸桿菌具有了生長溫度范圍廣的特點。

3.2 青海地區牦牛酸奶樣品中乳酸菌群組成分析

羅毅皓等從青海大通、剛察、共和、玉樹地區的牦牛酸奶樣品和酥油樣品中分離出來的乳酸菌，分別是嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、菌種為干酪乳桿菌干酪亞種或鼠李糖乳桿菌。牦牛酸奶樣品的主要優勢菌是乳酸桿菌和鏈球菌，除玉樹樣品中唾液鏈球菌嗜熱亞種較多外，而其他3個地方牦牛酸奶樣品都是乳酸桿菌為優勢菌，有少量唾液鏈球菌嗜熱亞種和極少量其他種菌類[20]。本試驗從青海海晏、同仁和澤庫3個不同地區采集到的牦牛酸奶樣品中分離到4株乳桿菌和6株乳酸球菌。海晏和同仁樣品中乳酸球菌是優勢菌，同仁市樣品中乳酸桿菌為優勢菌。

3.3 影響牦牛酸奶中微生物種類和數量的環境因素

自然發酵牦牛酸奶中微生物的種類和數量與其生存和分離環境密切相關。地理、地形、氣候等自然環境因地區而異，少數民族牧民在生產牦牛酸奶時使用的方法也不同，如發酵溫度、發酵時間、制作方法、牧民生活習慣、擠奶器具和發酵容器等。這使不同地區不同自然發酵牦牛酸奶制品中分離的乳酸菌種類及優勢菌群存在一定差異。

4 結論

從海晏、澤庫、同仁三個地區牦牛酸奶樣品中分離出10株乳酸菌。其中4株為桿菌分離株和6株球菌分離株。海晏縣樣品菌種有干酪乳桿菌干酪亞種L.caseisubsp.casei和嗜熱鏈球菌S.thermophilus，同仁市樣品中的菌種有嗜酸乳桿菌L.acidophilus、嗜熱鏈球菌S.thermophilus和羅伊氏乳桿菌L.reuieri，澤庫縣樣品中的菌種為嗜熱鏈球菌S.thermophilus。研究結果為青海地區牦牛乳酸菌資源數據庫的豐富提供了依據。