高海拔酸菜中乳酸菌篩選與發(fā)酵特性研究

冶成君

(青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

中國酸菜的歷史可以追溯到3000多年前的周朝，北魏賈思勰所著的《齊民要術(shù)》中有著詳細(xì)記載[1]。而在一些國家，有著當(dāng)?shù)貏e具特色的酸菜品種，但多數(shù)被稱之為“泡菜”。通常情況下傳統(tǒng)酸菜是以自然發(fā)酵為主，通過附著在原料表面的微生物經(jīng)過一系列生物化學(xué)變化制作[2]而成的，其中乳酸菌對(duì)于酸菜發(fā)酵起著舉足輕重的作用[3]，酸菜原料經(jīng)過乳酸菌的發(fā)酵而形成，并且使得酸菜具有酸、甜、香、脆等獨(dú)特的風(fēng)味[4]，最重要的是乳酸菌還能產(chǎn)生多種功能性成分，如共軛亞油酸、γ-氨基丁酸、胞外多糖等，有效地提高了發(fā)酵食品的營養(yǎng)功能價(jià)值[5]。另外，乳酸菌還具有調(diào)節(jié)腸道菌群和改善代謝綜合癥[6]，有助于人體消化防止便秘、抗腫瘤、降膽固醇，以及調(diào)節(jié)生理機(jī)能等醫(yī)療保健功效[7]。此外，酸菜本身具有酸咸的味道、口感脆嫩[8]、開胃提神，醒酒去膩，不但能增進(jìn)食欲，還可以促進(jìn)人體對(duì)鐵元素的吸收[9]等生理功能。

近幾年來，關(guān)于乳酸菌的特殊生理活性及營養(yǎng)功能正日漸被人們重視[10]，而研究表明傳統(tǒng)自然發(fā)酵蔬菜中乳酸菌資源非常豐富[11]，且由于自然發(fā)酵的特殊環(huán)境使得乳酸菌在某些發(fā)酵特性方面尤為突出，對(duì)此研究人員對(duì)酸菜中的乳酸菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究并應(yīng)用于不同方面。

現(xiàn)今研究人員主要是從酸菜中篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌，并用于發(fā)酵食品與醫(yī)療保健方面，在國內(nèi)，張?zhí)K等[12]從酸菜汁分離乳酸菌和漢遜德巴利酵母菌發(fā)酵鹿肉；朱珺等[13]從四川泡菜樣品中篩選出1株具有良好的胃腸道環(huán)境耐受能力的植物乳桿菌581，并用于多種果蔬汁發(fā)酵；王報(bào)貴等[14]從泡菜中分離出植物乳桿菌在非酒精性脂肪肝病的治療中發(fā)揮著重要作用。在國外，VethachaiPlengvidhya等[15]通過DNA指紋分析進(jìn)行了分析結(jié)果表明，在酸菜發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)的乳酸菌種類比以前報(bào)道的要更加豐富；Nishida Satoshi等[16]從米糠泡菜中分離出副植桿菌乳桿菌11-1在家蠶細(xì)菌感染模型中的免疫活性及存活提高；Dong Joo Seo等[17]研究表明泡菜中某些乳酸菌對(duì)小鼠諾如病毒有抑制作用；Jung Eun Park等[18]發(fā)現(xiàn)從泡菜分離的乳酸菌可以抑制脂肪組織炎癥的作用。

目前研究人員對(duì)于西式泡菜、韓國泡菜 、四川泡菜及東北酸菜的發(fā)酵過程中微生物區(qū)系已有很多系統(tǒng)的研究[19]，而對(duì)高原地區(qū)酸菜中乳酸菌的研究較少。高海拔地區(qū)自制酸菜中的乳酸菌在高原惡劣的自然環(huán)境，在自然淘汰及發(fā)酵過程中，具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌菌群得以生存且資源豐富，而用于酸乳發(fā)酵中的乳酸菌發(fā)酵劑，菌種主要包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌[20]，菌株較為單一，且乳酸菌發(fā)酵劑的生產(chǎn)性能直接關(guān)系到最終發(fā)酵乳制品的性能，是影響產(chǎn)品質(zhì)量的重要因素[21]，本研究從高原自制酸菜的各個(gè)部位中分離篩選出乳酸菌并對(duì)其發(fā)酵特性中的產(chǎn)酸性、耐鹽性及耐亞硝酸鹽性能進(jìn)行研究，并用于牦牛酸乳發(fā)酵，通過對(duì)牦牛酸乳的感官與理化指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)與測(cè)定并結(jié)合上述發(fā)酵特性的結(jié)果，挑選出適用于酸乳發(fā)酵的乳酸菌。該研究為高海拔酸菜中乳酸菌發(fā)酵特性的初步了解奠定了基礎(chǔ)，也為酸乳的乳酸菌發(fā)酵劑提供菌株的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸菜 青海省西寧市大通回族土族自治縣橋頭鎮(zhèn)黎明小區(qū)居民家自制；MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基 青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉 日本雪印株式會(huì)社。

LDZX-75KBS立式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；VS-860超凈工作臺(tái) 蘇州工業(yè)園區(qū)鴻基科技有限公司；HF240CO2培養(yǎng)箱 上海力申科學(xué)儀器有限公司；H/T16MM臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；XH-C漩渦混合器 金壇市白塔新寶儀器廠；MDF-U3386S醫(yī)用低溫箱 普和希健康醫(yī)療器械(上海)有限公司；B10WAVEDA微量核酸蛋白自定儀 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；PE-06HD數(shù)字pH計(jì) 佐藤商事株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基的制備

含9%CaCO3的MRS瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉8.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀2.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉5.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.04g、瓊脂14.0g、吐溫801.0g、碳酸鈣9g、蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH6.6，經(jīng)121℃、15min滅菌。

MRS肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉8.0g、酵母浸粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氫二鉀2.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉5.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.04g、吐溫801.0g、蒸餾水1000mL，調(diào)節(jié)pH5.8，經(jīng)121℃、15min滅菌。

1.2.2乳酸菌的分離純化

分別取適當(dāng)?shù)牟烁撞巳~、菜莖、黃菜葉、菜水放入裝有10mL的10%脫脂乳溶液中，36℃厭氧培養(yǎng)24h，當(dāng)乳液發(fā)酵凝固后，在脫脂乳中進(jìn)行5代純化培養(yǎng)，使用無菌生理鹽水將各個(gè)樣品稀釋至10-7稀釋梯度，取稀釋菌液0.2ml均勻涂布于含CaCO3固體培養(yǎng)基中進(jìn)行分離。

1.2.3乳酸菌的篩選及形態(tài)鑒定

從分離得到的乳酸菌中篩選出長勢(shì)良好、傳代性能穩(wěn)定的6株菌株：B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5，將6株乳酸菌進(jìn)行平板培養(yǎng)挑取制作切片后利用顯微鏡初步觀察乳酸菌的形態(tài)。

1.2.4產(chǎn)酸性的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)采用pH法測(cè)定產(chǎn)酸性能，將經(jīng)篩選得到并培養(yǎng)24h后的菌液充分震蕩取10mL菌液于無菌管中利用數(shù)字pH計(jì)測(cè)定菌液的pH值。

1.2.5耐鹽性的測(cè)定

將經(jīng)過充分震蕩后的菌液分別接種于添加了1%、3%、5%NaCl的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在36 ℃下厭氧培養(yǎng)24 h，充分震蕩后檢測(cè)樣品在600nm波長下的吸光度。

1.2.6耐亞硝酸鹽的測(cè)定

將乳酸菌菌液充分震蕩后分別接種于10mL含100mg/L、125mg/L、150mg/LNaNO2的MRS肉湯培養(yǎng)基中,并在36℃厭氧培養(yǎng)24h,充分震蕩后并檢測(cè)樣品在600nm波長下的吸光度。

1.2.7還原牦牛乳酸乳的制備

稱取牦牛乳粉40 g與160 mL水充分混合后放入高壓滅菌鍋進(jìn)行65 ℃，30 min殺菌處理，殺菌完成后將牦牛乳液移液于無菌管中，每個(gè)無菌管裝9ml牦牛乳液。將菌液充分震蕩后取1mL加入到9mL牦牛乳液中，充分震蕩后進(jìn)行36℃培養(yǎng)12h。

1.2.8牦牛乳酸乳感官品質(zhì)的評(píng)價(jià)

依據(jù)牦牛酸乳的色澤、組織狀態(tài)、氣味、滋味制定的一個(gè)牦牛酸乳感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選擇3名本專業(yè)有經(jīng)驗(yàn)的評(píng)價(jià)人員采用三分制對(duì)牦牛酸乳進(jìn)行評(píng)價(jià)，取3人評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)總和為一份牦牛酸乳的評(píng)分，評(píng)價(jià)前后必須用溫水漱口，并按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)產(chǎn)品做出評(píng)定與評(píng)分。感官品質(zhì)評(píng)價(jià)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下表1。

表1 感官評(píng)價(jià)與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.9牦牛乳酸乳pH值的測(cè)定

將發(fā)酵12h后的牦牛酸乳樣品充分震蕩后取10mL于無菌管中，用pH直接測(cè)定樣品的pH值。在測(cè)定時(shí)，每測(cè)定一個(gè)樣品的pH值后需用純凈水沖洗并擦干電極。

1.2.10牦牛乳酸乳持水力的測(cè)定

取10 g牦牛發(fā)酵酸乳放入離心管中后，放入離心機(jī)，以3000 r/min離心3min后，除去上清液，稱量殘余物的重量 W，酸奶的持水力按下式計(jì)算

持水力%=(W/10)×100

2 結(jié)果

2.1 篩選乳酸菌菌落和菌株形態(tài)

純化分離培養(yǎng)后對(duì)菌株經(jīng)含CaCO3平板培養(yǎng)后挑選的菌落形態(tài)見表2。

表2 挑選菌落的形態(tài)

由上表可知在CaCO3培養(yǎng)基中菌落形態(tài)除J3-1、J3-4、H4-3、H4-4外均出現(xiàn)了透明圈，說明其余菌種都具有一定的產(chǎn)酸能力，為后續(xù)產(chǎn)酸性實(shí)驗(yàn)提供了一定的基礎(chǔ)。經(jīng)過接種于MRS肉湯培養(yǎng)基36 ℃厭氧培養(yǎng)后B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5的菌株生長情況穩(wěn)定良好，因此選用這6株菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，顯微鏡初步觀察6株菌株的形態(tài)后，經(jīng)鑒定菌株均為單球菌，如圖1所示。

圖1 菌株的形態(tài)

2.2 產(chǎn)酸性分析

乳酸菌發(fā)酵形成的酸性環(huán)境對(duì)腐敗菌具有較強(qiáng)的控制作用[22]，因此對(duì)乳酸菌產(chǎn)酸性的研究有著重要意義，而經(jīng)36 ℃厭氧培養(yǎng)19 h后測(cè)定各編號(hào)菌液的pH值如下表3所示。

表3 菌液的pH值

在實(shí)驗(yàn)前測(cè)得MRS培養(yǎng)基的pH值為5.61，而接種后經(jīng)過36 ℃厭氧培養(yǎng)19 h后，B2-1、B2-2、B2-4、J3-4的菌液pH值下降較快，其中B2-1 pH值為最低3.59，初步說明其在篩選后的6株菌株里產(chǎn)酸性能最好。

2.3 耐鹽分析

通過使用微量核酸蛋白自定儀測(cè)得編號(hào)為B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5的菌液經(jīng)充分震蕩后在不同NaCl濃度下于600 nm波長下的吸光度見表4。

表4 菌株在不同NaCl濃度下的吸光度

通過上表可以看出經(jīng)挑選的菌株的吸光度值均隨著NaCl濃度的升高而下降，從而反映出隨著NaCl濃度的升高，菌株的生長變緩，NaCl有抑制菌種的生長作用。

2.4 耐亞硝酸鹽分析結(jié)果

通過使用微量核酸蛋白自定儀測(cè)得編號(hào)為B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5的菌株經(jīng)充分震蕩后在不同NaNO2濃度下于600 nm波長下的吸光度見表5。

表5 菌株在不同NaNO2濃度下的吸光度

通過表5可以看出B2-1、J3-4的菌液的吸光度值隨著NaNO2濃度的升高而增加外，其他菌液的吸光度值均隨著NaNO2濃度的升高而明顯變化，說明B2-1、J3-4菌株在某一生長階段，可降解且能利用NaNO2中的氮元素合成自身所需要的蛋白質(zhì)，從而促進(jìn)了菌株的生長。

2.5 還原牦牛乳酸乳的凝乳狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)菌種接種于還原牦牛乳中經(jīng)12h厭氧培養(yǎng)后，各菌株凝乳狀態(tài)見表6。

表6 牦牛酸乳的凝乳狀態(tài)

2.6 牦牛酸乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)菌種接種于還原牦牛乳中經(jīng)12h厭氧培養(yǎng)后，各菌株凝乳感官評(píng)價(jià)結(jié)果見圖2。

圖2 牦牛酸乳感官評(píng)價(jià)

據(jù)評(píng)價(jià)人員的評(píng)價(jià)菌株B2-1發(fā)酵的牦牛酸奶色澤均勻一致，成乳白色，有光澤，雖沒有明顯的酸乳獨(dú)特的氣味也無任何異味，口感適中，但由少量的乳清析出；B2-2發(fā)酵的牦牛酸奶除滋味上有不適的刺激性外與B2-1的其他方面評(píng)價(jià)相似；菌株B2-4發(fā)酵的牦牛酸奶無明顯的酸奶的氣味與滋味且有少量乳清析出；J3-4、H4-1菌株發(fā)酵的牦牛酸奶色澤均勻一致，成乳白色，有光澤，組織細(xì)膩，質(zhì)地均勻，粘度適中，無乳清析出，但沒有明顯的酸乳獨(dú)特的氣味；H4-5菌株發(fā)酵的牦牛酸乳色澤均勻一致，成乳白色，有光澤，組織細(xì)膩，質(zhì)地均勻，粘度適中，無乳清析出，具有濃郁的酸乳香味，無任何異味且口感適中，無不良滋味。菌株H4-5適用于發(fā)酵牦牛酸乳制品，B2-1次之。

2.7 牦牛發(fā)酵酸乳pH值的分析

實(shí)驗(yàn)菌種接種于還原牦牛乳中經(jīng)過12 h發(fā)酵后的牦牛酸乳的pH結(jié)果見圖3。

圖3 發(fā)酵牦牛乳的pH值

2.8 牦牛發(fā)酵乳持水力的分析

6株菌株發(fā)酵的牦牛酸乳的持水力見圖4。

圖4 發(fā)酵牦牛酸乳的持水力

由6株菌株發(fā)酵的牦牛酸乳均有不錯(cuò)的持水力，通過凝乳狀態(tài)的觀察可知，由乳清析出的B2-1、B2-2、B2-4 的持水力低于未有乳清析出的其他3株菌株，其中感官評(píng)價(jià)最高的H4-5持水力是6株菌株中最高的。因此菌株H4-5作為酸乳的乳酸菌發(fā)酵劑有著良好的潛力。

3 討論

3.1 篩選菌種

實(shí)驗(yàn)表明從酸菜白菜葉和菜莖中分離篩選菌株產(chǎn)酸性能最高，說明此處的菌株在酸菜的腌制過程中起主導(dǎo)作用。

3.2 篩選菌種耐鹽性

B2-1的菌株在NaCl濃度為5%時(shí)吸光度達(dá)到了8.31，說明B2-1菌株具有良好的耐鹽性，而其他菌株尤其是H4-1、H4-5的生長受鹽濃度的影響較大，不利于奶酪或發(fā)酵肉制品的制作。

3.3 篩選菌種耐亞硝酸鹽性

由于亞硝酸鹽具有優(yōu)異的發(fā)色和抑菌能力，所以它是一種在食品生產(chǎn)中特別是在肉制品制造業(yè)中常用的食品添加劑，但它卻有致畸、致癌、致甲狀腺腫大等危害[23]，因此在肉制品發(fā)酵時(shí)，應(yīng)該選用具有良好的耐亞硝酸鹽性與降解亞硝酸鹽性的菌種，在泡菜發(fā)酵過程中，微生物將蔬菜中的硝酸鹽氧化成亞硝酸鹽, 同時(shí)蔬菜中的酚類物質(zhì)和維生素C等物質(zhì)也會(huì)將亞硝酸鹽還原，但生成的亞硝酸鹽大于被還原的亞硝酸鹽，因此，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，亞硝酸鹽的含量會(huì)逐步上升[24]。因此B2-1、J3-4菌株可作為肉制品發(fā)酵與酸菜發(fā)酵的乳酸菌發(fā)酵劑。

4 結(jié)論

本研究從高海拔酸菜的各部位分離篩選出乳酸菌對(duì)其菌落進(jìn)行形態(tài)初步鑒定，經(jīng)-80 ℃、120 d保存后活化進(jìn)行第二次篩選，從中分離篩選出6株傳代性良好的乳酸菌：B2-1、B2-2、B2-4、J3-4、H4-1、H4-5，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察、耐鹽性、耐亞硝酸鹽性、pH值的測(cè)定及還原牦牛乳發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)菌株初步觀察形態(tài)均為單球菌，經(jīng)發(fā)酵特性研究發(fā)現(xiàn)，在耐鹽性生長實(shí)驗(yàn)測(cè)定中菌株B2-1在NaCl濃度為5%時(shí)，吸光度仍達(dá)到8.31，而其他菌株隨著NaCl濃度的升高吸光度值迅速下降；在耐亞硝酸鹽性生長測(cè)定中，6株菌株均具有良好的耐受力，其中菌株J3-4耐受性最好，在NaNO2濃度為150 mg/L下，吸光度達(dá)到21.27；菌株B2-1的液體培養(yǎng)基pH值最低為3.59；菌株H4-1、H4-5發(fā)酵還原牦牛乳后凝乳狀態(tài)最好，感觀評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)菌株H4-1最高為32分、菌株B2-1次之為30分，發(fā)酵牦牛乳的pH值菌株B2-1最低為4.27、菌株H4-1的pH值為4.51，發(fā)酵牦牛乳持水力菌株H4-1最高達(dá)97%，菌株B2-1的持水力為90%。經(jīng)綜合評(píng)定菌株B2-1可用于牦牛乳奶酪發(fā)酵劑開發(fā)的候選菌株，菌株H4-1可用于牦牛乳酸奶發(fā)酵劑開發(fā)的候選菌株，菌株J3-4可用于發(fā)酵肉制品和酸菜發(fā)酵劑開發(fā)的候選菌株。