西部旱區紫花苜蓿地土壤微生物群落結構和多樣性分析

丁成翔

(青海大學畜牧獸醫科學院，西寧 810016)

西部旱區是我國主要的紫花苜蓿種植區，該地區光合有效輻射高、生長季晝夜溫差大等氣候特點益于紫花苜蓿光合產物的形成和營養物質的積累，充足的水分供給可提高苜蓿草產量。土壤微生物作為重要的土壤肥力影響因素，加之高通量測序技術的飛速發展，土壤微生物群落結構和多樣性特征分析逐步納入土壤質量評估中[1]。土壤微生物在生態系統中扮演重要功能，參與養分的物質循環和能量流動[2]，不同土壤生境的微生物群落結構和多樣性存在差異，進而影響土壤微生物功能。土壤養分影響土壤微生物生物群落結構和多樣性，在糧食作物生產、草地生態系統已有較多研究例證[3]，區域氣候條件和海拔亦是影響土壤微生物群落結構的主要環境因子。王艷廷等[4]研究發現，土壤物理特性改善能增加土壤微生物活性和未培養的微生物種類；谷永建等[5]培養試驗發現降水顯著改變了微生物量，從而影響闊葉林凋落物分解速率，同樣結果在草地生態系統也得到了驗證[6]；周煜杰等[7]應用文獻計量學研究方法發現，不同生態類型土壤微生物群落的海拔分布規律不一致。當前在大空間尺度對土壤微生物研究報道多為天然草地、林地和荒漠等，對人工種植的苜蓿地的報道較少。因此，本試驗將從研究區環境因素、土壤特性等角度探索苜蓿地土壤微生物群落結構和多樣性，分析影響苜蓿地土壤微生物的關鍵因子，為苜蓿高產栽培技術與田間管理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究區

研究區位于青海省烏蘭縣、內蒙古鄂爾多斯鄂托克旗和甘肅肅南裕固族自治縣，所選試驗點為當地紫花苜蓿種植地。烏蘭縣屬干旱大陸性氣候，平均海拔2960m，年平均氣溫3.5℃，年平均降雨量159.3～197.6mm，土壤類型為棕鈣土；鄂托克旗屬溫帶大陸性季風氣候，平均海拔1365m，年平均氣溫6.4 ℃，年降水量為250mm，土壤類型為壤質沙土；肅南屬高寒半干旱氣候，平均海拔1300m，年平均氣溫為3.6℃，年均降水量254.8mm，土壤類型為壤質沙土。

1.2 樣品采集

采樣時間為2020年7月中旬，每個研究區紫花苜蓿核心種植地內隨機選取6個采樣點，各采樣點相隔500m，每個采樣點為1m×1m，使用直徑8cm的土鉆采用5點取樣法采集土樣，5個重復，采樣深度為0-20cm，取樣后將5個重復土樣混合均勻。土樣分為兩部分保存，一部分保存在4℃中用于理化性質分析，一部分在-20℃保存用于高通量測序。此外，每個樣點用環刀采集部分土壤用于容重分析。

1.3 土樣分析

土壤理化性質的測定指標主要為土壤有機質、全氮、全磷、氨態氮、硝態氮、速效磷、速效鉀、含鹽量、含水量、容重、pH、土壤質地(粘粒、粉粒、砂粒)以及導水率。

將原狀土置于150°C恒溫烘箱中，烘干6～8h到恒重，稱重測定其容重，每個測點容重為3個對照樣組的平均值。土壤質地組成使用英國馬爾文Mastersizer2000激光粒度儀濕法測定，將土壤顆粒有效直徑按美國農部制標準分三個等級：粘粒(<0.002mm,%)、粉砂(0.05～0.002mm,%)、砂粒(2～0.05mm,%)。土壤養分按照鮑士旦編著的農化分析書測定[8]。

1.4 測序分析

樣品按照MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit 試劑盒提取樣品基因組DNA。以提取的樣品基因組DNA為模板針對微生物 16S rRNA基因V4區(515F 與 806R)進行PCR擴增。Illumina MiSeq 平臺進行高通量測序。

1.5 數據分析

通過QIIME平臺去除原始序列中的低質量序列，根據標簽序列分開來自不同樣品的序列。利用Uchime軟件去除在PCR過程中形成的嵌合體，獲得的高質量序列用 Usearch方法進行聚類，以16S rRNA 基因序列97%相似度作為分類操作單元(operational taxonomic units, OTUs)的劃分標準。通過RDP分類鑒定OTU代表性序列的微生物分類相對豐度。方差分析(ANOVA)用SPSS Statistics 19.0完成。α和β多樣性采用vegan和picante包(R3.5.1)計算。

2 結果與分析

2.1 不同研究區土壤微生物群落結構

如圖1a，在門分類水平上分析3個研究區土壤微生物群落組成，前10的細菌和古菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteriodetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、藍藻門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、厚壁菌門(Firmicutes)。在門水平上，不同研究區微生物分布差異較大，烏蘭縣研究地變形菌門、酸桿菌門和擬桿菌門豐度較高，鄂托克旗和肅南縣研究地放線菌門、芽單胞菌門和綠彎菌門的豐度較高。如圖1b，在綱水平上， alpha變形菌門的豐度最高。表明不同研究區苜蓿種植地土壤微生物群落結構差異較大。

圖1 原核微生物門水平和綱水平分類群落組成

3個研究區土壤微生物總OTUs數為8361個。其中，共同擁有的OTUs數633個，占總OTUs的7.6%；特有OTUs數量最多的是肅南研究地土樣，2677個，占總OTUs的32%；最少的是烏蘭縣研究地土樣，1780個，占總OTUs的21.3%；烏蘭縣與鄂托克的共有OTUs數為12.2%，與肅南的共有OTUs為10.7%；鄂托克與肅南的共有OTUs數為14.4%。表明鄂托克與肅南的苜蓿種植地土壤微生物群落結構更為相似(圖2)。

圖2 不同研究地苜蓿地土壤微生物韋恩圖

2.2 alpha和beta多樣性分析

3個研究區苜蓿種植地土壤微生物Alpha多樣性指數分析表明，鄂托克旗土壤微生物香農維納指數和系統發育多樣性指數均最高，烏蘭縣的alpha多樣性指數最低，且顯著低于鄂托克旗的多樣性指數，見圖3a、3b。

圖3 不同地區苜蓿土壤微生物alpha多樣性分析

對3個研究區苜蓿種植地的土壤微生物分別基于bray-curtis距離和weighted-unifrac距離進行beta多樣性分析發現，不同研究區的土壤微生物在pCoA第一軸和第二軸上明顯分開，前兩軸總共可以解釋70.2%和72.7%的方差(圖4a、4b)。分別基于這兩種距離使用置換多元方差分析(PERMANOVA)，進行999次置換后發現，3個研究區兩兩之間均有著顯著差異(表1)。

表1 beta多樣性的置換多元方差分析

2.3 氣候、海拔及土壤理化性質分析

對3個研究區不同因子分析表明，各因子間均存在顯著差異。烏蘭縣海拔高于鄂托克旗和肅南縣；鄂托克旗土壤容重和粉粒占比高于其他兩個研究區，肅南的土壤粘粒和砂粒占比最高。在土壤養分方面，3個研究區土壤有機質無顯著差異，土壤全氮、全磷、有效磷、有效鉀、氨態氮和硝態氮含量差異顯著；鄂托克旗土壤pH值相比最高(見表2)。

表2 不同地區環境因子

2.4 不同因子與土壤微生物的關系

由圖5可知，海拔和全氮是影響不同研究區苜蓿地土壤微生物alpha多樣性指數最關鍵因子。海拔與微生物多樣性指數呈顯著負相關，全氮與微生物多樣性指數呈顯著正相關；全磷和速效鉀也與部分多樣性指數呈顯著相關。

圖5 土壤微生物alpha多樣性與環境因子相關性分析

冗余分析發現，研究區各因子與72.5%的微生物群落變化緊密相關。其中，降雨量和微生物群落變化相關性最高，為0.67，顯著相關；其次分別為研究區海拔、土壤粉粒占比、土壤全磷含量、土壤砂粒占比和土壤粘粒占比等。相較于土壤化學因子，區域氣候、海拔及土壤物理因子對苜蓿地土壤微生物群落結構的影響更深。

圖6 不同研究地各因子對土壤微生物群落結構冗余分析

表3 不同因子與土壤微生物群落的相關性分析

3 討論

紫花苜蓿因其較高的營養和經濟價值在我國西部干旱區廣泛種植，種植區氣候條件以及海拔差異較大。3個研究區中，鄂托克旗苜蓿地土壤的微生物香農維納多樣性指數、系統發育多樣性指數均是最高；烏蘭縣苜蓿地的土壤微生物多樣性最低。相關性分析表明，苜蓿地土壤微生物alpha多樣性與海拔成顯著負相關，烏蘭縣地處青藏高原，海拔較高，其微生物豐富度和多樣性較低。王穎等[9]在高寒草甸研究結果發現，土壤微生物多樣性隨海拔變化呈單峰型曲線；劉秉儒等[10]對賀蘭山林地土壤微生物多樣性研究發現，隨著海拔增加，微生物物種多樣性呈增加趨勢；厲桂香等[11]對微生物多樣性的海拔分布格局綜述認為，不同生態系統內微生物海拔分布格局具有多種規律，呈線性、單峰型或無變化的特征。這表明，針對不同植被類型的生態系統，土壤微生物海拔分布特征需要結合區域生態系統因子具體分析與解釋。除海拔因素外，土壤微生物alpha多樣性與土壤全氮含量顯著正相關，該研究結論很好的解釋了研究區烏蘭縣苜蓿種植地土壤全氮含量最低，其土壤微生物多樣性亦最低的原因。該結論與徐潤宏等[12]在青藏高原的施氮試驗結果相似，表明隨著氮沉降增加，土壤細菌多樣性顯著增加；吳勇等[13]在西北荒漠紫花苜蓿地施肥試驗中亦發現，土壤全氮含量與土壤微生物量呈顯著正相關。

與已有研究結果相似[14]，本實驗結果表明，在土壤微生物群落結構門水平上，3個研究區苜蓿地土壤微生物相對豐度較高的分別為變形菌門、放線菌門和酸桿菌門。由于不同種類土壤微生物對干旱脅迫的耐受性不同，本研究中變形菌門和放線菌門豐度最高，這與其較強的耐干旱能力有關[15]。綱水平分析發現，相對豐度較高的為alpha變形菌綱，原因是紫花苜蓿作為豆科類牧草，alpha變形菌綱是根瘤菌的優勢類群之一[16]。

有研究表明，土壤理化性質、海拔和區域氣候特征影響土壤微生物群落結構組成[17]。本研究發現，3個研究區苜蓿地土壤共同具有的微生物OTUs數較少，小于總OTUs數的10%，說明 3個研究區特有的微生物OTUs數較多，大于總OTUs數的90%。同樣種植紫花苜蓿，不同地域土壤微生物群落結構差異顯著，原因可能是區域之間差異較大的環境因子，說明相比于地上植物因子，氣候、海拔和土壤因子與土壤微生物關系更緊密；也有可能是由于研究區苜蓿地種植年限較短(<5a)，尚未對土壤微生物群落結構造成顯著的影響[18]。此外，冗余分析結果發現，氣候、海拔和土壤物理特征相比于土壤化學特征對土壤微生物群落結構的影響更深。

4 結論

綜上所述，西部干旱區紫花苜蓿種植地土壤微生物群落結構和多樣性差異顯著，地域海拔和土壤全氮含量是影響不同研究區苜蓿地土壤微生物多樣性關鍵因子，水分(降雨量)對苜蓿地土壤微生物群落結構變化特征有顯著的影響效果，土壤質地相比土壤化學特征對土壤微生物群落結構和多樣性影響更深，相互關系更緊密。