青海毛驢馬腺疫病原菌的分離鑒定

黃榮，索佳佳，高楠楠，沈秀英，朱偉，董建寶

(1.青海大學畜牧獸醫科學院，西寧81000；2.山東畜牧獸醫職業學院，濰坊261061)

腺疫記載于我國唐代綜合性獸醫學著作《司牧安驥集》中“槽結”，是一種由C型鏈球菌屬馬鏈球菌馬亞種引起的急性接觸性馬屬動物傳染病，是世界范圍內最常見的馬屬動物傳染病之一[1]。該病以馬屬動物發熱、上呼吸道炎癥、喉囊和頭頸頜下淋巴結腫脹化膿破潰為主要特征，發病率高，傳染性強，幼駒死亡率較高[2]，感染后病原體很難被徹底清除[3]。

馬鏈球菌(Streptococcusequi)包括馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubspeciesequi,S.euqi)和馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcusequisubspecieszooepidemicus,S.zooepidemicus)[4]，馬鏈球菌馬亞種宿主特異性強，只感染馬屬動物，在感染宿主時主要通過鼻腔和口腔兩個途徑[5]，經口腔或鼻腔感染后侵襲扁桃體隱窩，短暫停留，感染后約3小時侵入頭頸頜下淋巴結，48小時可到達黏膜固有層[6]。該菌對外界環境適應力較強，在水中可存活一周左右，在干燥的膿汁和鼻液中可存活數周，本菌不耐熱，普通消毒劑即可將其殺滅[7]。

截至目前，關于馬腺疫的報道大都為馬的感染，有關驢發生腺疫研究較少，且未見有關于青海毛驢發生腺疫的報道。本研究以發生腺疫的青海毛驢為研究對象，對引發腺疫的病原菌進行分離鑒定，確定其致病菌為馬鏈球菌馬亞種，并對該菌進行了藥敏試驗，篩選出敏感藥物，為該病的預防和治療提供理論和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品

使用棉拭子和細菌采樣管采集發生腺疫的青海毛驢的膿性鼻液或破潰的淋巴結膿汁。

1.2 主要試劑及儀器

營養肉湯、5%綿羊血平板購自北京陸橋技術股份有限公司，DL2000 DNA Marker、Taq酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；凝膠回收試劑盒購自QIAGEN公司；細菌藥敏紙購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1病原分離純化與染色鏡檢

將無菌采集的病料分別涂片，進行美藍染色鏡檢。病料分別劃線接種于5%綿羊血平板，37℃培養20h后，觀察菌落形態，挑取單菌落進行擴大培養和鑒定。

1.3.2PCR鑒定及測序分析

使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取所分離菌落的DNA。參考《馬腺疫檢疫技術規范》(SN/T 2977-2011)中的PCR診斷技術對所提取的DNA樣品進行核酸PCR擴增。使用Premix TaqTM(Ex TaqTMVersion 2.0 plus dye)試劑盒，反應體系為25μL，組成如下：Ex Taq 12.5μL，DNA模板2.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，超純水8μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30個循環；72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳觀察，1%的瓊脂糖凝膠，電壓80V～100V，電流40mA～50mA，電泳30min～40min。使用QIAquick Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒對陽性目的帶進行回收，送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行核苷酸測序，將測序結果進行BLAST分析。

1.3.3藥敏試驗

采用標準K- B紙片瓊脂擴散法，將37 ℃培養16 h～18h生長良好的分離菌液30 μL接種于營養肉湯瓊脂平板，37 ℃培養16h后，檢測分離菌株對青霉素、頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢西叮、氨曲南、多粘菌素B、紅霉素、麥迪霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、卡那霉素12種抗生素的敏感性，按照說明書進行操作。

2 結果

2.1 涂片鏡檢和分離培養

對采集鼻拭子和膿汁樣品進行美藍染色鏡檢，顯微鏡視野可觀察到圓形或卵圓形球菌，少數成對多數呈鏈狀排列，幾個到幾十個球菌連成鏈(圖1)，5%綿羊血液瓊脂分離培養出現透明、中央微隆起、表面光滑、濕潤黏稠的露珠樣小菌落，且呈現β型溶血，即在露珠樣菌落周圍形成界限分明、完全透明的溶血帶(圖2)。

圖1 樣品美藍染色鏡檢結果 圖2 血瓊脂平板培養呈現β溶血

2.2 PCR及測序結果

對分離純化的細菌提取DNA，進行特異性PCR檢測，結果顯示本研究所采集的腺疫樣品均為陽性(圖3)。將陽性目的帶進行DNA回收純化和測序，對測序結果進行BLAST分析，結果顯示PCR所擴增目的帶的核苷酸序列為馬鏈球菌馬亞種的SeM基因的序列片段，確定所分離菌株為馬鏈球菌馬亞種。

圖3 樣品PCR檢測結果

2.3 藥敏試驗結果

對本研究所分離的馬鏈球菌馬亞種進行藥敏試驗(K-B紙片瓊脂擴散結果如表1)，結果顯示β-內酰胺類藥物(青霉素和頭孢類)對分離株最為敏感。

表1 藥敏試驗結果

S表示敏感，R表示耐藥，I表示中介。

3 小結與討論

國際上對馬腺疫的研究主要集中在馬上，對驢發生腺疫的報道較少。2015年，Firew等人報道了埃塞俄比亞的驢發生馬腺疫，并對驢發生馬腺疫的臨床癥狀進行了描述，對致病病原進行了分離和鑒定[8]。而我國對驢發生馬腺疫的報道要遠遠早于其他國家，張八軍于1990年首次報道了驢暴發馬腺疫的情況，并詳細記錄了驢發病的臨床癥狀、傳播方式、預防和治療方法等[9]。2018年以后，隨著規模化養驢的興起，規模化驢場暴發腺疫的情況被陸續報道[10-12]，研究表明規模化驢場各年齡段的驢均易感，但驢駒發病率和死亡率最高[2]，而且全國大部分的規模化驢場都有腺疫的發生，防控形勢較為嚴峻。本研究對引起青海毛驢發生腺疫的病原進行了分離鑒定，證實了馬鏈球菌馬亞種為致病原，并對所分離的菌株進行了藥敏試驗。

在馬腺疫的治療方面，青霉素是目前公認的首選藥物，而且截至目前尚未發現馬鏈球菌馬亞種的青霉素耐藥菌株。本研究對青海毛驢的分離株進行的藥敏試驗顯示，青霉素和頭孢類藥物為敏感藥物，但在臨床使用過程中青霉素性價比較高，在綜合考慮的基礎上建議使用青霉素進行治療。

馬腺疫是影響馬屬動物養殖業的主要傳染病之一，也是世界范圍內最常見的馬屬動物傳染病之一[1]，該病對馬屬動物，尤其是幼齡馬屬動物的感染率和致死率較高，嚴重威脅著馬屬動物養殖業的健康發展[3]。青海毛驢是一種以役用為主的小型品種，主要生活在青海地區，雖然個體矮小，但具有適應高原艱苦的自然環境、抗病力強、耐粗飼和易管理等優點，是非常具有地方特色的優良品種。2021年1月13日，青海毛驢作為特色畜種，入選了國家畜禽遺傳資源委員會辦公室發布的《國家畜禽遺傳資源品種名錄(2021年版)》。近年來,青海毛驢的數量急劇減少，保護其品種資源變得非常重要，而在保種的過程中，疫病防控是重要的工作之一，馬腺疫應當引起足夠的重視。