miR-548t-3p靶向CITED2調控甲狀腺癌細胞的凋亡研究

王愛霞 劉瑋芳 王春平

甲狀腺癌(TC)是常見的內分泌惡性腫瘤，最近幾十年來在世界范圍內迅速增加[1]。根據2014年世界癌癥報告，全球約有298,000例新的TC病例和40,000例死亡病例[2]。根據2015年的中國癌癥統計資料，TC已成為中國女性中的第六位惡性腫瘤，也是30歲以下女性中最常見的腫瘤[3]。此外，TC的復發率很高，導致治愈率下降和死亡率顯著增加，這嚴重危害了人類健康[4]。目前，最常見的TC治療方法是手術結合放射療法或化學療法。但是，它對耐受性乳頭狀癌，未分化癌和髓樣癌沒有很好的療效，并且在癌癥復發和對人體的危害方面仍存在爭議[5]。因此，探索TC的腫瘤發生機制，尋找影響TC細胞增殖和凋亡的關鍵分子，是TC治療的重要途徑。miRNA是一大類微小的非編碼RNA，它們是內源編碼的，并通過與靶mRNA的3'UTR區結合而負調控基因表達，從而導致mRNA的翻譯抑制或降解[6]。Vriens等[7]通過高通量測序發現TC癌組織和TC癌旁組織中miRNA的表達種類顯著不同，包括miR-548t-3p。然而，miR-548t-3p在TC細胞中的功能尚未得到研究。基于此，本研究旨在探討miR-548t-3p調控甲狀腺癌細胞凋亡的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

甲狀腺癌細胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7均購自普諾賽公司(貨號：CL-0457,CL-0575,CL-0613,CL-0617,CL-0618,CL-0623,CL-0643,CL-0644,CL-0647)。miR-548t-3p mimcis,miR-548t-3p inhibitor,siRNA和過表達質粒均有北京擎科合成。lipo3000轉染試劑購自武漢市武昌區科邁實驗用品經營部(貨號：L3000015)。TRIzol試劑購自四川愛奇生物科技有限公司(貨號：15596026)。第一鏈cDNA合成試劑盒購自寶如億(北京)生物技術有限公司(貨號：N118-1-1)。BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(貨號：P0012)。CITED2抗體購自廣州吉英生物科技有限公司(貨號：46505)。GAPDH抗體購自廣州洛唯爾生物科技有限公司(貨號：ab8245)。FITC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒購自廣州市左克生物科技發展有限公司(貨號：22839)。熒光素酶檢測試劑盒購自北京伊諾凱科技有限公司(貨號：N1150)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料 納入2020年1月至2021年1月我院收治的甲狀腺癌患者62例；其中男性25例，女性37例，年齡31～77歲，平均年齡(47.32±9.45)歲；腫瘤直徑1.0～3.6 cm，平均直徑為(1.77±0.82)cm；依據國際抗癌聯盟《TNM惡性腫瘤分類》第7版進行TNM分期：均為Ⅲ期。甲狀腺癌患者均經我院病理科證實。排除標準：①嚴重心、肝、腎功能損害者。②長期使用皮質類固醇激素及免疫抑制劑者。③患有精神疾病者。④患有其他腫瘤者。本研究經醫院倫理委員會審批，受試者均簽署知情同意書。

1.2.2 細胞培養與轉染 將CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7細胞保持在1640培養基中，將SW579、B-CPAP、8305C、BHT101細胞保持在DMEM培養基中，并補充10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。將上述細胞放置與5%CO2、37 ℃的培養箱中培養。將甲狀腺癌細胞以2×105/孔的密度接種在6孔板中，以進行RNA干擾。將miR-548t-3p mimcis,miR-548t-3p inhibitor,siRNA和過表達質粒分別與lipo3000轉染試劑混合，室溫靜置15 min后緩緩滴入甲狀腺癌細胞中。

1.2.3 RNA抽取與實時熒光定量PCR 根據制造商的規程，使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用第一鏈cDNA合成試劑盒進行逆轉錄。在ABI 7500系統上在以下條件下進行qRT-PCR：95 ℃持續30 s;95 ℃持續5 s(40個循環);60 ℃持續30 s，72 ℃持續15 s。使用GAPDH作為內部對照計算基因的相對表達水平。

1.2.4 免疫印跡 處理后收集甲狀腺癌細胞裂解液，并用雙辛可寧酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離等量的蛋白質進行電泳，然后將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉后，將膜與抗CITED2抗體作為一抗和抗GAPDH抗體作為內參。隨后，將膜與適當的二抗在室溫下孵育1 h。信號用化學發光底物試劑盒成像，并通過凝膠成像系統檢測。

1.2.5 甲狀腺癌細胞的凋亡檢測 用胰蛋白酶收集甲狀腺癌細胞，并用冰冷的D-Hanks溶液洗滌2次。然后，根據制造商的說明，使用FITC-Annexin V細胞凋亡檢測試劑盒進行Annexin V/PI染色。使用貝克曼計數器流式細胞儀分析樣品。

1.2.6 熒光素酶報告實驗 根據生產商的說明，使用FuGENE HD將50 μg的熒光素酶報告載體和150 μg的pLL3.7-miR-548t-3p或pLL3.7-miR-對照載體轉染到96孔板中的1.5×104SW579細胞中。轉染后48 h，按照制造商的說明，使用雙熒光素酶報告基因分析系統測量熒光素酶活性。將海腎熒光素酶活性標準化為螢火蟲熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

通過SPSS 16.0進行統計分析。根據統計分析的要求，所有結果均通過至少三個獨立實驗確認。由于異常分布或方差的異質性，數據表示為平均值±標準偏差，并使用Mann-Whitney檢驗進行分析。P<0.05被認為具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-548t-3p在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌旁組織中的表達水平

miR-548t-3p在甲狀腺癌組織的表達水平顯著高于甲狀腺癌旁組織(P<0.05)，見圖1。

圖1 miR-548t-3p在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌旁組織中的表達水平

2.2 miR-548t-3p抑制甲狀腺癌細胞凋亡

過表達miR-548t-3p后，甲狀腺癌細胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7的凋亡水平均下降(P<0.05)；而敲低miR-548t-3p后，甲狀腺癌細胞的凋亡水平均上升(P<0.05)，見圖2。

圖2 miR-548t-3p抑制甲狀腺癌細胞凋亡

2.3 miR-548t-3p靶向CITED2調控甲狀腺癌細胞凋亡

通過miRDB在線分析發現miR-548t-3p潛在靶向92個基因的mRNA。在甲狀腺癌細胞SW579中過表達miR-548t-3p后，檢測上述基因mRNA水平的表達，發現miR-548t-3p能夠顯著降低SNRK、VASP、CITED2的mRNA水平(P<0.05)，見圖3A。使用siRNA敲低SNRK、VASP、CITED2后，發現當敲低CITED2時，甲狀腺癌細胞SW579的凋亡水平顯著下降(P<0.05)，見圖3B。過表達CITED2后，甲狀腺癌細胞SW579的凋亡水平顯著上升(P<0.05)，見圖3C。敲低miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達水平顯著上升，見圖3D。過表達miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達水平顯著下降，見圖3E。同時，熒光素酶報告實驗發現miR-548t-3p靶向CITED2的3端非編碼區(P<0.05)，見圖3F。同時敲低miR-548t-3p和CITED2，SW579細胞的凋亡水平無顯著改變(P>0.05)；同時過表達miR-548t-3p和CITED2，SW579細胞的凋亡水平無顯著改變(P>0.05)，見圖4。

圖3 CITED2調控甲狀腺癌細胞凋亡

圖4 miR-548t-3p靶向CITED2調控甲狀腺癌細胞凋亡

3 討論

甲狀腺癌是最常見的內分泌惡性腫瘤，每年占全世界癌癥發生率的1.3%和癌癥死亡率的0.5%[8]。根據組織病理類型，甲狀腺癌分為乳頭狀甲狀腺癌，濾泡性甲狀腺癌，未分化甲狀腺癌和髓樣癌[9]。最常見的類型是乳頭狀甲狀腺癌，約占甲狀腺癌的70%～80%[10]。因此，深入了解甲狀腺癌發生發展的分子機制將有助于確定新的診斷和治療方法。

在本研究中，發現miR-548t-3p在甲狀腺癌組織的表達水平顯著高于甲狀腺癌旁組織(P<0.05)。過表達miR-548t-3p后，甲狀腺癌細胞SW579、B-CPAP、8305C、BHT101、CAL-62、KHM-5M、TPC-1、FTC-133、HTh-7的凋亡水平均下降(P<0.05)；而敲低miR-548t-3p后，甲狀腺癌細胞的凋亡水平均上升(P<0.05)。miRNA是一類非蛋白質編碼的單鏈RNA分子，由內源基因編碼，長度為19～25個核苷酸，在物種中高度保守[11]。miRNA通常作用于一個或多個mRNA，并通過降解mRNA或抑制翻譯水平來負面調節基因表達[12]。提示miR-548t-3p通過降解某個底物來調控甲狀腺癌細胞的凋亡。

過表達miR-548t-3p后， miR-548t-3p能夠顯著降低SNRK、VASP、CITED2的mRNA水平(P<0.05)。敲低SNRK、VASP、CITED2后，僅當敲低CITED2時，甲狀腺癌細胞SW579的凋亡水平顯著下降(P<0.05)。盡管敲低SNRK和VASP并沒有影響甲狀腺癌細胞SW579的凋亡，但是miR-548t-3p靶向SNRK和VASP在甲狀腺癌發生發展中的其他作用仍然值得進一步探討。

過表達CITED2后，甲狀腺癌細胞SW579的凋亡水平顯著上升(P<0.05)。敲低miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達水平顯著上升。過表達miR-548t-3p后，CITED2的蛋白表達水平顯著下降。多項研究證實[13-14]，CITED2可誘導細胞凋亡。其機制可能是CITED2是CBP / p300的負調節劑，而CBP/p300是組蛋白乙酰轉移酶，可以通過乙酰化(例如在Lys-373上)穩定p53，并在p53穩定性中起重要作用[15]。因此，miR-548t-3p抑制了CITED2，隨后p53積累減少最終抑制了細胞凋亡。此外，據報道丟失CITED2可以防止MYC與HDAC1相互作用，從而引起p21CIP1啟動子的活化和細胞的靜止[16]。這些結果與我們的結果一致，表明miR-548t-3p干擾可能通過下調CITED2的表達并隨后影響p53和p21的表達來抑制細胞凋亡。

綜上所述，miR-548t-3p通過靶向CITED2 mRNA的3端非編碼區，降解了CITED2 mRNA并減少了CITED2的蛋白表達，最終抑制了甲狀腺癌細胞的凋亡。