利用網絡藥理學與分子對接技術分析石見穿在治療癌癥中的作用機制

劉利艷 施 旻 陳 力 張 潔 李 斌 溫世偉 徐 彭

癌癥的發病率和死亡率已經成為第二大威脅人類健康的疾病[1-5]。中醫認為“正虛邪實”，“正氣虧虛、毒瘀互結” 于脈絡是癌癥發病的重要因素[6-7]，熱毒內蘊可形成腫瘤，即熱灼血凝，凝結成塊，熱灼津液，久積成塊等。腫瘤 (癌癥)本質是陽化氣不足、陰成形積聚[8-10]，癌癥自身也可生熱成毒[10]，歷代醫家多以清熱解毒、以毒攻毒、化痰散結為主要治法，體現了清熱解毒法在癌癥治療中有重要的作用[11]。

石見穿，別名紫參，唇形科植物紫參的全草(Salviae Chinensis Herba)，全草性平、味苦、辛,具有清熱利濕、活血調經、解毒消腫之功效，《本草綱目》記載其功效為：主骨痛，大風，癰腫[12-13]。現有文獻顯示石見穿具有增強免疫力，對胃癌、腸癌、肝癌等多種腫瘤細胞具有良好的抑制作用[13-17]，常與其他中藥配伍一起用于癌癥的治療，亦可配合放、化療，減輕放、化療患者的不適癥狀[18-19]。目前對石見穿治療癌癥的作用機制尚不明確。筆者亦未見有關運用網絡藥理方法對石見穿抗癌作用機制文獻報道。基于此，為了進一步研究石見穿的抗腫瘤作用機制，以石見穿為研究對象，采用生物信息數據庫以人類蛋白靶標為研究對象進行網絡藥理學的研究，以探究石見穿在治療癌癥的作用靶標及其作用機制。

1 資料與方法

1.1 數據庫及軟件

本研究所涉及的數據庫有:中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、化合物查詢數據庫PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、靶點預測數據庫swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)、疾病靶點數據DisGeNET(http://disgenet.org)和Genecards(https://www.genecards.org)、數據交集數據庫Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)、String蛋白相互作用網絡平臺(https://string-db.org/cgi/input.pl)。通路查詢數據庫KEGG(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)、蛋白數據庫PDB(http://www.rcsb.org)、swissmodel(https://swissmodel.expasy.org)；圖形可視化數據庫有：RAWGraphs(https://app.rawgraphs.io)；所涉及的軟件有：網絡可視化Cytoscape3.7.1，R語言，通路富集與生物學分析ClueGo2.5.4和CluePedia、分子對接軟件DISCOVERY STUDIO軟件等。

1.2 石見穿活性成分及靶點篩選

在TCMSP數據庫中搜集石見穿所有的活性成分；若根據化合物的類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18 和口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%為篩選條件，則符合條件的只有2個化合物，故本研究對活性成分的選擇不設篩選條件，將所有活性成分全部納入研究[20-24]。將納入活性成分分別在PubChem、swisstargetprediction數據庫中檢索，篩選物種為“homo sapiens”的靶點，并對各活性成分作用靶點進行篩選(篩選條件為Probability≥0.05)，即為石見穿的預測作用靶點。

1.3 疾病靶點篩選

在DisGeNET和Genecards數據庫，以關鍵詞“Cancer”進行檢索，篩選條件分別為:Score_gda≥0.05(DisGeNET)，Relevance score≥10(Genecards)，并將石見穿活性成分預測靶點與癌癥疾病靶點進行交集，得到共同的靶基因，繪制韋恩圖。

1.4 藥物-活性成分-靶點網絡的構建

將藥物與活性成分-靶點(共同靶基因)數據導入Cytoscape中，繪制藥物-成分-靶點網絡圖。

1.5 PPI網絡的建立

將交集后的靶基因上傳到String數據庫，將研究物種為選擇為人類(Homo sapiens) ，獲取蛋白相互作用數據，結果以TSV格式導出，然后導至Cytoscape軟件優化構建和分析蛋白相互作用網絡(PPI)，節點大小和顏色均按“degree”排列，edge粗細和顏色均按“combined_score”排列。

1.6 癌癥靶點生物學功能分析和通路分析

將共同靶基因經R語言包進行GO、KEGG分析，對石見穿治療癌癥作用的潛在靶點進行生物學功能和通路分析。將Cutoff值設為“p value<0.05”，“q value<0.01”，得到生物功能富集氣泡圖和barplot圖。將得到的與癌癥相關通路和靶基因上傳至RAW數據庫中，構建石見穿-活性成分-靶基因-信號通路的網絡圖。

1.7 活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證

選擇靶點數目最多的活性成分作為配體，PPI 網絡中“degree”最大的靶點作為受體，進行分子對接。在PDB、swissmodel數據庫下載所需蛋白結構，與pubchem下載的三維結構配體一一對接，LibDock對接模式，選擇評分分值最高的分子-蛋白對接圖(LibDockScore>100，則構象予以保留)。

2 結果

2.1 石見穿活性成分以及靶點篩選

經TCMSP檢索，共檢索出16個活性成分。將所有的活性成分在swisstarget prediction中檢索預測靶點，得到254個預測靶點。

2.2 疾病靶點篩選

分別從DisGeNET和Genecards數據庫中獲取癌癥相關的疾病靶點4511個和1521個，與245個預測靶基因一起輸入Draw Venn Diagram進行交集后，得到共同靶基因84個，即為石見穿的潛在作用靶點。見圖1。

圖1 預測靶點與疾病靶點交集韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-靶點網絡的構建

將藥物與活性成分靶點(共同靶基因)數據導入Cytoscape中，繪制中藥-成分-靶點網絡可視圖(圖2)，圈中心為石見穿，內圈16個節點代表石見穿的16個活性成分，中圈和外圈均為活性成分的作用靶點。體現了石見穿治療癌癥多成分、多靶點協同作用的特點。連接度為前3的潛在活性成分分別為MOL002049(Ferulaldehyde，degree：39)、MOL000263(oleanolic acid，degree：26)和MOL000511(ursolic acid，degree：26)。

圖2 石見穿-活性成分-預測靶點相互作用

2.4 PPI網絡的建立

將石見穿-癌癥84個潛在的靶基因上傳至String數據庫平臺獲取的蛋白質相互作用關系數據導至Cytoscape軟件優化構建和分析蛋白相互作用網絡(PPI)；PPI網絡共有84個節點(共同靶基因)通過877條邊發生作用，平均節點degree為20.9，可視圖中節點越大(半徑)則說明其degree越大，edge邊越粗，則說明其combined_score 值越大，關聯性越好(圖3)。經Cytoscape Network分析后得到各靶點的degree值，按照degree從大到小排序，排名前三分別為IL6(57)、MAPK3(56)、EGFR(56)。

圖3 石見穿治療癌癥潛在作用靶點PPI網絡

2.5 GO功能分析

經R語言包運行后，得到GO富集結果顯示：與核受體活性相關的基因有11個、轉錄因子活性相關的基因有11個、與輔因子結合相關的基因有15個、RNA聚合酶II近端啟動子序列特異性DNA結合相關的基因有14個、近端啟動子序列特異性DNA結合相關的基因有14蛋白質異二聚活性相關的基因有11個等，靶基因參與這些生物學功能的過程，說明其在生物學行為上占據重要的地位。

2.6 KEGG通路分析

經R語言包運行KEGG后，共得到137條信號通路，其中涉及癌癥的通路有24條，感染類的通路有27條，炎癥通路的有5條，免疫方面的通路有7條，激素相關通路7條等。IL-6、MAPK3、STAT3、MMP3、GSK3B、PTPRC等基因作為cross-talk 基因參與到 2 條及以上通路中，這些通路和基因涉及癌癥發生發展如細胞的增殖、凋亡、轉移、血管新生等重要的生物過程。

2.7 活性成分與關鍵靶點的分子對接驗證

選取連接靶點最多的活性成分(前三)，分別為阿魏醛(MOL002049，Ferulaldehyde)、齊墩果酸(MOL000263，oleanolic acid)、熊果酸(MOL000511，ursolic acid)為配體，作用最緊密的蛋白分別為IL6、MAPK3、EGFR三個蛋白為受體。分子對接結果顯示(如表1)，IL-6能與石見穿中活性成分阿魏醛穩定結合，通過與氨基酸殘端主要與SER L52、ARG H99、ARG H33 氫鍵連接，ALA H100 烷基連接，GLY L36 Pi-碳氫鍵，ASP L93、ASP H106 Pi-陰離子方式連接。齊墩果酸能與MAPK3、EGFR穩定結合，分別通過LEU B124 、MET B125、LEU B173、ILF B48、VAL B56、TYR B53 PI烷基或烷基、GLU B50 氫鍵、GLY B49碳氫鍵；ALA A289、SERA291、THR A339碳氫鍵、GLY A288范德華力、VAL A312、CYS A309、CYS A305、ARG A310、TYR A292 PI-烷基連接。熊果酸與MAPK3、EGFR亦能穩定結合，分別通過GLY B49碳氫鍵、VALB56、TYRB53、LEUB124、ILEB48、CYSB183、METB125、LEUB173PI烷基或烷基連接；LYSA375 烷基、ARGA310碳氫鍵連接。從對接構象上看，齊墩果酸和熊果酸與MAPK3、EGFR連接構象相似，但其與氨基酸殘基連接方式不同。

表1 藥物活性成分與蛋白對接情況表

3 討論

本研究運用網絡藥理學和分子對接技術的方法對石見穿的治療癌癥作用機制進行研究，從TCMSP數據庫中獲取了石見穿16個活性成分，通過對化合物靶點網絡分析和分子對接等可發現阿魏醛(Ferulaldehyde)、齊墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)可能是石見穿發揮作用的重要活性成分。通過String數據庫發現IL6、MAPK3、EGFR、MAPK1、CASP3、TNF、 PTGS2、ESR1、MAPK8、STAT3等基因為核心靶點。MAPK是信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者，能被不同的細胞外刺激，如細胞因子、神經遞質、激素、細胞應激及細胞黏附等激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。調節著細胞的生長、分化、對環境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理/病理過程。IL-6為由基質細胞、上皮細胞等多種細胞產生的1種多功能的細胞因子、在腫瘤、炎癥和免疫性疾病中發揮重要作用[25-26]，EGFR是1種受體型酪氨酸激酶。是成紅細胞增多癥癌基因B(ErbB)家族的主要成員，在許多組織中表達，并參與多種細胞過程，對細胞的生長發育至關重要[27]。研究顯示熊果酸能通過抑制(MAPK)/ERK信號通路，來抑制轉移性惡性黑色素瘤細胞的增殖，另有報道顯示熊果酸能夠通過抑制MAPK、EGFR磷酸化，從而抑制EGF刺激結腸癌細胞HT-29的增殖。其能抑制VEGF，參與血管新生。從而抑制腫瘤血管生成[28-30]。經齊墩果酸藥物處理后，神經膠質瘤細胞中的MAPK/ERK途徑被大大抑制。重組慢病毒載體Lv-MEK誘導的MAPK/ERK激活能夠挽救齊墩果酸對神經膠質瘤細胞遷移和侵襲的抑制作用，這說明齊墩果酸是通過抑制MAPK/ERK途徑來抑制神經膠質瘤細胞遷移和侵襲[31]。另有研究顯示齊墩果酸可有效抑制HU-VEC中VEGF誘導的VEGFR-2活化和血管生成，從而產生抗血管生成作用[32]。上述文獻報道與我們的研究結果基本一致。然目前尚未查到有關阿魏醛在腫瘤中、以及通過與IL-6之間相互作用的報道，通過我們本次研究或許能為我們之后探討阿魏醛在腫瘤中的作用的研究方向提供思路。

綜上所述，運用網絡藥理學來探討石見穿的治療癌癥潛在作用靶點，通過分子對接技術初步驗證了石見穿主要活性成分與潛在的作用靶點發生的相互作用，進一步確定了石見穿治療癌癥是“多成分-多靶點-多通路”的共同作用，為后續深入研究石見穿治療癌癥的分子機制奠定理論基礎。