CTHRC1與PD-L1在前列腺癌組織中的表達水平及臨床意義

吳樹軍 蘇文濤 劉建軍 張軍民

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是我國男性常見的泌尿系統惡性腫瘤，近年來我國PCa發(fā)病率呈快速上升趨勢，由于PCa導致的死亡患者逐年增多[1]。膠原三股螺旋重疊蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1)是1種外分泌糖蛋白[2]，在多種實體腫瘤中高表達，CTHRC1基因通過調控MMP-7/MMP-9通路促進腫瘤細胞浸潤和擴散[3]。而程序性死亡受體-配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是重要的免疫檢查點蛋白，通過與PD-1結合抑制T細胞功能促進腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[4]，PD-L1已被證實在多種腫瘤中表達增高，且常與患者預后不良相關[5]。CTHRC1、PD-L1均與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關，但在PCa中作用尚不明確。本研究采用免疫組織化學法檢測PCa患者組織中CTHRC1、PD-L1的表達情況，旨在為PCa的預后的評估提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2013年1月至2017年1月于本院泌尿外科行根治性前列腺切除術的86例患者，患者年齡49～81歲，平均年齡(67±9.14)歲。所有患者病理學檢查均確診為前列腺癌，TNM分期組遵循美國癌癥聯合會(AJCC)分類；所有患者入組前均未行放、化療，靶向藥物治療及生物免疫治療；患者身體狀況良好，無手術禁忌癥。術中采集患者腫瘤組織及癌旁正常組織保存于-80 ℃?zhèn)溆茫谢颊呔炇鹧芯康闹橥鈺狙芯拷涐t(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核通過。

1.2 免疫組織化學法檢測CTHRC1、PD-L1蛋白表達

將玻片脫蠟水化，使用磷酸緩沖液(PBS)沖洗后滴加3%H2O2孵育10 min，使用EDTA(pH8.0)和檸檬酸鈉溶液對抗原進行高壓熱修復，PBS沖洗后滴加山羊血清室溫下封閉30 min，滴加50 μl一抗置于濕盒內4 ℃孵育過夜。次日在室溫復溫1 h，PBS沖洗3次后滴加50 μl二抗，室溫靜置1 h。PBS洗滌后滴加DBA顯色，與顯微鏡下觀察染色程度。PBS沖洗后蘇木精復染2 min，再沖洗后梯度酒精脫水、透明、中性樹膠封片后于顯微鏡下觀察。CTHRC1、PD-L1一抗均購自美國Abcam公司，HRP標記山羊抗兔二抗購買自美國SBI公司，DBA顯色液及其他實際均購買自北京中杉金橋公司。CTHRC1、PD-L1染色部位均為細胞質。染色后細胞質中出現棕黃色顆粒為蛋白表達陽性，按照蛋白染色強度打分：無染色記0分、淺黃色記1分、棕黃色記2分、深棕色記3分。再按照染色高表達細胞密度進行打分：高表達細胞<25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。參照文獻報道[6-7]最終結果以上述兩項評分相乘獲得，以≤6分記為低表達，>6分為高表達。

1.3 治療及隨訪

患者行根治性前列腺切除術后采用多西他賽聯合潑尼松龍方案進行化療，化療期間患者每3個月復查血清PSA水平、CT、MRI及骨掃描，以出現腫瘤進一步生長、骨轉移、患者臨床癥狀進一步加重、患者死亡判定為化療無效，無上述指征者判定為化療有效。采用電話、微信、郵箱等方式對患者進行隨訪，隨訪間隔為3個月，隨訪時間3年，末次隨訪時間為2020年1月。

1.4 統計分析

收集的實驗數據應用SPSS 21.0進行分析，計數資料以例數或率表示，兩組比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman分析，采用Kaplan-Meier生存曲線觀察兩組患者生存情況進行比較，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CTHRC1、PD-L1在腫瘤及癌旁組織中表達情況

免疫組化染色結果顯示：86例PCa組織中65例患者CTHRC1呈高表達，高表達率為75.58%；69例患者PD-L1呈高表達，高表達率為80.23%。腫瘤組織中CTHRC1、PD-L1表達水平明顯高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.001)，見表1。

表1 免疫組化法檢測CTHRC1、PD-L1表達情況/例

2.2 CTHRC1、PD-L1表達水平與患者臨床資料的關系

研究表明：PCa患者組織中CTHRC1、PD-L1表達水平與患者年齡及術前前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen，PSA)水平無關(P>0.05)，而與患者TNM分期、是否伴隨骨轉移及Gleason評分相關(P<0.05)，見表2。

表2 CTHRC1、PD-L1表達水平與患者臨床資料的關系/例

2.3 CTHRC1、PD-L1表達水平的相關性研究

86例PSa患者腫瘤組織中CTHRC1高表達65例，而PD-L1高表達69例，Spearman相關性分析顯示：PD-L1表達與CTHRC1表達呈正相關(γ=0.377，P<0.01)。

2.4 CTHRC1、PD-L1表達與患者化療效果的關系

86例PCa患者中化療有效71例，無效15例。化療有效患者腫瘤組織中CTHRC1、PD-L1表達明顯低于無效患者，差異有統計學意義(P<0.001)，見表3。

表3 CTHRC1、PD-L1表達與患者化療效果的關系/例

2.5 CTHRC1、PD-L1表達水平對患者預后的影響

以隨訪患者死亡或到截止時間為標準停止隨訪，86例PCa患者腫瘤組織中CTHRC1高表達患者65例，死亡24例，存活38例，失訪3例；CTHRC1低表達患者21例，死亡3例，存活18例，無失訪。86例PCa患者腫瘤組織中PD-L1高表達患者69例，死亡26例，存活41例，失訪2例；PD-L1低表達患者17例，死亡2例，存活14例，失訪1例，所有死亡患者死因均為前列腺癌進展或并發(fā)癥。采用Kaplan-Meier生存曲線比較患者生存情況，結果發(fā)現腫瘤組織中CTHRC1、PD-L1呈低表達的患者36個月的生存率高于高表達患者，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 CTHRC1、PD-L1表達水平與患者生存率的關系

3 討論

研究表明CTHRC1是1種遷移蛋白，其表達與血管重構、組織纖維化的形成、骨骼形成和腫瘤形成等多種生命活動相關[8]，而CTHRC1在腫瘤中常出現表達水平升高。大量文獻報道其與多種腫瘤的生長侵襲相關，如良性黑色素瘤細胞不表達CTHRC1，但在具有高度侵襲和轉移能力的惡性黑色素瘤細胞中CTHRC1表達水平明顯升高[9]；在非小細胞肺癌中CTHRC1表達水平可作為評估患者預后的相關指標，高表達患者常伴隨預后不良的發(fā)生[10]；此外還有研究表明CTHRC1表達水平與腫瘤耐藥的發(fā)生密切相關[11]，其可能作為相應的分子靶點在腫瘤的靶向治療中發(fā)揮作用。但目前CTHRC1與PCa的相關研究少有報道，本研究結果表明其在PCa組織中呈高表達，且化療有效的患者組織中CTHRC1表達水平較低，高表達CTHRC1的患者生存率低于低表達患者。國內郭碧瑩等[12]的研究發(fā)現，體外過表達CTHRC1顯著增強卵巢癌細胞增殖和遷移的能力，而下調CTHRC1的表達后卵巢癌細胞浸潤能力大大降低，研究證實CTHRC1在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促腫瘤作用。郭碧瑩等[13]的研究還發(fā)現高表達CTHRC1的卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性較低，而沉默CTHRC1后發(fā)現抑制細胞中Akt、STAT3磷酸化，使Bcl-2表達降低，提升化療效果。結合本研究結果，提示CTHRC1可能參與了PCa的發(fā)生發(fā)展及化療耐藥的發(fā)生。

PD-L1是免疫反應中重要的負性調控分子，與PD-1結合后募集蛋白酪氨酸磷酸酶(SHP)下調PI3K/Akt通路磷酸化水平，使CD4+T淋巴細胞向Treg分化[14]，抑制免疫反應的發(fā)生。PD-1/PD-L1還可通過耗竭CD8+T細胞的方式抑制抗腫瘤免疫反應，促進腫瘤的免疫逃逸[15]。研究表明PD-L1在多種腫瘤中的表達水平明顯升高，而其表達水平可作為患者預后的相關指標，胃癌組織中PD-L1高表達常與患者預后不良相關[16]；PD-L1還能通過促進肝癌微血管生成促進腫瘤的生長轉移[17]。本研究發(fā)現PD-L1在PCa組織中表達水平明顯上升，且與患者化療效果和生存率相關，與低表達者相比PD-L1高表達的PCa患者多數化療無效，且生存率明顯降低，結果與先前的研究一致。本研究還發(fā)現PD-L1的表達與CTHRC1表達相關。相關研究報道CTHRC1與金屬基質蛋白酶-9、粘蛋白-1等分子表達水平相關，可能參與了腫瘤微環(huán)境的調控導致PD-L1表達水平增高從而進一步促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[18]，但對此機制的研究尚不完全明確。

綜上所述，本研究結果顯示PCa患者腫瘤組織中PD-L1、CTHRC1表達水平明顯升高，且與患者TNM分期、有無骨轉移、Gleason評分、化療效果及預后相關，提示PD-L1、CTHRC1參與了PCa的發(fā)生發(fā)展，可能作為PCa患者化療效果及預后的評價指標發(fā)揮作用。但本研究樣本量較小，結果可能存在偏倚，需在后續(xù)研究中心加以改進，且PD-L1、CTHRC1在PCa中發(fā)揮的作用及機制仍需進一步研究。