聲門型喉癌組織中Survivin、八聚體結合蛋白的表達與分化程度、淋巴結轉移的關系

關瑋豪 魏璐璐 許 歡

聲門型喉癌原發于聲帶以上部位，如會厭、室帶、杓會厭襞等，分化較差，發展較快[1]。本研究將通過研究聲門型喉癌患者組織中Survivin蛋白、八聚體結合蛋白表達與分化程度、淋巴結轉移的關系，從分子角度觀察并確定患者喉癌的發展情況，早日為患者提供更精確的檢查結果，并及時進行治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2020年5月在我院收治的118例聲門型喉癌患者作為實驗組，另選取同一時期于我院進行治療的50例聲帶息肉患者作為對照組。納入標準：①符合《喉癌外科手術及綜合治療專家共識》中對聲門型喉癌及聲帶息肉的相關診斷標準[2]；②所選患者均知情并簽署知情同意書。排除標準：①哺乳期或妊娠期女性；②依從性差，無法配合完成本研究；③病歷資料不詳細；④合并惡性腫瘤、精神系統疾病、心腦血管疾病病史者。實驗組患者118例，男性95例，女性23例；年齡40～75歲，平均年齡(56.56±3.12)歲；其中低分化患者61例，中分化患者32例，低分化患者25例；有淋巴結轉移患者52例，無淋巴結轉移患者66例。對照組患者50例，男性38例，女性12例；年齡36～70歲，平均年齡(51.43±3.07)歲。2組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 研究方法

采用免疫組織化學染色法測定Survivin蛋白表達水平：將118例聲門型喉癌患者及50例聲帶息肉患者組織標本采用石蠟常規切片，切成4～5 cm切片標本后，置于涂好多聚賴氨酸的玻片上[3]。于68 ℃烤片機進行烘烤，持續4 min。于二甲苯及酒精中進行組織脫蠟，隨后用蒸餾水連續沖洗3次，每次持續3 min左右，于PH值為7.4酸堿度下進行PBS沖洗3次，每次持續5 min[4]。在所選切片上需滴加3%H2O2溶液1滴進行孵育，持續15 min左右，結束后重復進行上述沖洗步驟。沖洗后于切片滴加Survivin第二抗體(雅吉生物，貨號：IH-0615R)1滴，繼續孵育30 min，PBS沖洗10 min左右[5]。所選切片于室溫下逐個滴加DAB顯色液，用實驗室顯微鏡查看顯色結果后進行自來水沖洗。所選切片逐個滴加蘇木精進行復染1 min左右，自來水沖洗后返藍10 min左右[6]。最后逐步進行梯度酒精脫水及二甲苯透明操作，采用中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察染色結果。八聚體結合蛋白表達水平測定：同上述操作步驟，將上述操作步驟中Survivin第二抗體更換為鼠抗人Oct4 單克隆抗體(武漢純度生物，貨號：CDLG-4839)。

1.3 結果判定

先于低倍鏡下觀察切片，選取染色較均勻區域，再于高倍鏡下選取5個不重疊視野范圍，對每個視野范圍進行細胞計數，規定每個范圍內有100個腫瘤細胞方便后續統計及比較。根據每個區域內陽性細胞率及著色強度對5個區域進行評分[7]。陰性：僅細胞核核膜上著色為藍色；陽性：細胞質及細胞核核膜上呈現明顯淺棕色、棕黃色或深棕色。著色強度：著色結果為陰性、淺棕色、棕黃色或深棕色分別計分0、1、2、3分。陽性細胞率：每個視野范圍內結果為陽性細胞總數占100個細胞數百分比，≤10%計0分，>10%～25%計1分，>25%～50%計2分，>50%計3分。每個區域內陽性細胞率及著色強度相加之和為蛋白表達水平：0分為不表達、1～2分為低表達、3～4分為中表達、5～6分為高表達，1～6分為陽性表達。

1.4 統計學方法

本研究數據的統計分析在spss22.0軟件上進行，計數資料以例數(n)及百分率(%)表示，用χ2檢驗，采用spearman相關性分析2組患者組織Survivin蛋白、八聚體結合蛋白表達與分化程度、淋巴結轉移的關系。檢驗標準α=0.05，當P<0.05時，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 比較2組患者Survivin蛋白、八聚體結合蛋白陽性表達率

實驗組Survivin、八聚體結合蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 比較2組組織中Survivin蛋白、八聚體結合蛋白陽性表達率(例，%)

2.2 實驗組患者組織中Survivin蛋白陽性表達與病理特征的關系

實驗組從高分化患者到中分化及低分化患者組織中Survivin、八聚體結合蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)；實驗組有淋巴結轉移患者組織Survivin、八聚體結合蛋白表達水平較無淋巴結轉移患者顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 比較實驗組各類別患者Survivin蛋白、八聚體結合蛋白陽性表達率(例，%)

2.3 實驗組組織Survivin、八聚體結合蛋白表達水平與分化程度及淋巴結轉移情況相關性

實驗組組織Survivin、八聚體結合蛋白表達水平與分化程度呈負相關(γ=-0.306、γ=-0.325，P均<0.05)，與淋巴結轉移情況呈正相關(γ=0.400、γ=0.309，P均<0.05)。

3 討論

我國喉癌發病率為1.8～2.0/10萬，占全身腫瘤1～2%，占頭頸腫瘤3～8%(居第2位)?？谇贿M食或者空氣進去以后，通過舌頭、舌根到達會厭，會厭水平分成兩條道，后面通過下咽、食道到達胃。會厭往前面走到聲門，也就是發聲的地方叫聲帶，再往下是氣管、肺，這是一條呼吸通道[8]。聲門型喉癌，就是發生在雙側聲帶上的癌。腫瘤轉移主要包括原發癌細胞生長、新腫瘤血管生成、脫落并浸入細胞基質、形成癌栓、定位于人體各器官或組織進行生長至繼續轉移擴散[9]。

組織Survivin蛋白是一種細胞凋亡抑制基因，是凋亡抑制蛋白家族的新成員，具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關。Survivin 能夠通過P21間接抑制Caspase，與細胞周期調控因子CDK4結合，導致 CDK2/cyclin-E激活和核糖體磷酸化[10]。核糖體磷酸化后啟動細胞進入周期，加快G1/S期的轉換，使P21從Survivin-CDK4復合物中釋放出來[11]，與線粒體 pro-caspase-3結合，阻止線粒體釋放Cyt-c，直接抑制了終末效應酶Caspase-3、Caspase-7，干預了Caspase-9的活性，抑制細胞凋亡[12]。同時survivin抵消了一大類凋亡刺激物的作用，包括IL-3、Fas、Bax、Caspase-3、Caspase -7、Caspase -8和TNF等[13]。人的Oct4基因位于6號染色體上(6p21.31)，長度為16.40 kb，具有多個轉錄起始位點，轉錄不同的mRNA亞型，從而翻譯成多種蛋白質[14]。Oct4對于人體維持干細胞正常功能及自我更新具有重要作用，有研究表明，腫瘤病變與腫瘤細胞分化程度及淋巴結細胞轉移有顯著關系[15]。本文采用免疫組織化學染色法，通過對比聲門型喉癌患者與聲帶息肉患者組織Survivin蛋白及八聚體結合蛋白陽性率可知，組織Survivin蛋白及八聚體結合蛋白陽性率分別為26%和18%。提示組織Survivin蛋白及八聚體結合蛋白表達水平與聲門型喉癌良惡性癌變的發生有關，可能參與了腫瘤細胞發展過程。本文結果顯示，實驗組從高分化患者到中分化及低分化患者Survivin、八聚體結合蛋白表達水平逐漸升高；實驗組有淋巴結轉移患者組織Survivin、八聚體結合蛋白表達水平較無淋巴結轉移患者顯著升高；組織Survivin、八聚體結合蛋白表達水平與分化程度呈負相關，與有淋巴結轉移呈正相關。進一步證實，組織Survivin、八聚體結合蛋白表達水平不僅與聲門型喉癌癌變發生過程相關，更影響著腫瘤細胞的癌變過程。癌變越嚴重，組織Survivin、八聚體結合蛋白表達水平越高，提示組織Survivin及八聚體結合蛋白對聲門型喉癌患者癌變過程發生及發展的作用越強。Survivin及八聚體結合蛋白同樣也預示著淋巴結是否發生轉移，對癌細胞追蹤定位或治療后對患者后期療效評估及預后預測具有重要作用。

綜上所述，組織Survivin蛋白及八聚體結合蛋白表達水平與聲門型喉癌良惡性癌變的發生及其發展密切相關，兩者可鑒定患者聲門型喉癌病情嚴重程度，為患者早期診斷及治療提供微觀分子病理基礎。