氨基酸序列比對分析IL-12的種屬特異性

陳麗娜，王建剛，王亞俊，秦 歡，丁會芹,*

(1.康立泰生物醫藥(青島)有限公司，山東 青島 266112；2.青島大學，山東 青島 266001)

目前市場上尚未有任何一種上市藥物能夠單品種、單次劑量實現抑制腫瘤細胞生長，調節免疫功能且能夠同時促進全血象恢復。臨床上常需將多種藥物或治療方式聯合，治療方案復雜且效果有限。白介素-12(interleukin-12，IL-12)是一種具有多種生物學功能的細胞因子，具有明確的免疫調節、抑制腫瘤細胞生長功能，是迄今為止發現的唯一能夠促進造血功能全面恢復的細胞因子類藥物[1]。IL-12同時具有抗腫瘤[2]、免疫調節[3]及血象恢復[4]等作用，能夠填補臨床治療的空白。重組人白介素-12(rhIL-12)產品在全球范圍內還未上市，是真正意義上的國家一類創新藥物，其市場潛力巨大。rhIL-12蛋白結構與天然IL-12的一致，是由α亞基和β亞基經1個二硫鍵共價結合而成的異二聚體糖蛋白。α亞基由197個氨基酸組成，包含7個半胱氨酸殘基和3個潛在的N-連接糖基化位點；β亞基由306個氨基酸組成，包括10個半胱氨酸殘基和4個潛在的N-連接糖基化位點[5]。

生物技術藥物的生物學活性通常與種屬和/或組織特異性相關，因此應進行報審前的非臨床藥效研究及安全性評價，以闡明藥理學及毒理學等特征[6]。這就需要確定能夠預測臨床風險的相關種屬或動物模型，在進行非臨床藥效研究和安全性評價前，需關注種屬間IL-12氨基酸序列的特異性及其同源性，并進行氨基酸信息學比對分析。為此，作者通過UniProt數據庫檢索人、鼠、兔、犬和猴的IL-12氨基酸序列，運用ClustalW及Espript軟件進行兩序列比對，運用Blat數據庫進行多序列比對，為IL-12產品以及相關衍生產品的非臨床研究和評價中動物種屬的選擇提供依據，以指導新藥產品的注冊申報。

1 實驗

1.1 材料

在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org/)分別輸入關鍵詞“IL-12 α”和“IL-12 β”，獲得蛋白質氨基酸序列，選擇小鼠、大鼠、兔、犬、食蟹猴及人的IL-12氨基酸序列，排除“同物種序列”、“相似序列”及其它不相關序列；其中，人IL-12氨基酸序列去除信號肽序列。

1.2 方法

采用ClustalW及Espript軟件將獲取的人IL-12氨基酸序列與各種屬IL-12氨基酸序列進行兩序列比對。即分別將人與另一種動物的IL-12氨基酸序列復制到ClustalW軟件中，點擊“Execute Multiple Alignment”運行軟件，獲得兩序列比對文件，將所得文件上傳至Espript軟件，點擊“Submit”獲得兩序列比對結果文件。

采用Blat數據庫(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)依次選擇小鼠、大鼠、兔、犬、恒河猴、食蟹猴數據庫并輸入獲取的人IL-12氨基酸序列，點擊“Submit”運行數據庫，進行多序列比對；另外，選擇人數據庫并輸入獲取的5種動物種屬的IL-12氨基酸序列，運行數據庫進行多序列比對。完成比對后，分析人IL-12與各種屬IL-12的同源性差異。

2 結果與討論

2.1 各種屬IL-12氨基酸序列檢索結果

在UniProt數據庫檢索到與IL-12 α亞基氨基酸相關序列共435個，與IL-12 β亞基氨基酸相關序列共737個，排除“同物種序列”、“相似序列”及其它不相關序列。選擇非臨床研究中常用5種動物的IL-12 α亞基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43431)、大鼠(rat，Q9R103)、兔(rabbit，A0A5F9CIX7)、犬(dog，F1PPC0)、食蟹猴(crab-eating macaque，A0A2K5V4L8)；選擇5種動物的IL-12 β亞基氨基酸序列，包括：小鼠(mouse，P43432)、大鼠(rat，Q9R278)、兔(rabbit，G1TBD7)、犬(dog，F1PK70)、食蟹猴(crab-eating macaque，G7P6S2)。選擇人的IL-12 α亞基(human，p29459)及IL-12 β亞基(human，p29460)氨基酸序列，去除信號肽序列，即分別為197個氨基酸的IL-12 α亞基及306個氨基酸的IL-12 β亞基。

2.2 兩序列比對結果

采用ClustalW及Espript軟件比對人與5種動物的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列，兩序列比對結果見表1。

表1 人與5種動物的IL-12氨基酸序列比對結果/%

相似性數值越大，表明同源性越高。由表1可以看出，IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列同源性在人與小鼠之間分別為80.47%、84.84%，在人與大鼠之間分別為81.40%、84.37%，在人與兔之間分別為88.81%、91.01%，在人與犬之間分別為90.32%、91.95%，在人與食蟹猴之間分別為87.15%、95.88%。其中，人與食蟹猴的IL-12氨基酸序列同源性相對較高。

人與食蟹猴的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列比對見圖1。

注：深色背景序列表示人與食蟹猴相同的IL-12氨基酸序列

2.3 多序列比對結果

采用Blat數據庫，比對人IL-12與6種動物數據庫的氨基酸序列，結果見表2。

表2 人IL-12與6種動物數據庫的氨基酸序列比對結果

得分越高，種屬一致性越高。由表2可以看出，人的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與恒河猴的一致性分別高達94.0%、96.2%，與食蟹猴的一致性分別高達92.8%、96.2%，與其它種屬的一致性相對較低。選擇人IL-12 β亞基氨基酸序列與食蟹猴數據庫比對時，產生了4個食蟹猴氨基酸的匹配位置數據，第一個匹配數據表2中有顯示，另外3個得分都很低，并且跨度≤15 bp(base pair，堿基對)，雖然一致性均為100%，但這些匹配可能具有偶然性，不能代表人的IL-12 β亞基氨基酸序列與此位置有真正關系。

采用Blat數據庫，比對5種動物IL-12與人數據庫的氨基酸序列(表3)。分析一致性發現，5種動物的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與人的一致性大小順序依次為食蟹猴>犬>兔>大鼠>小鼠。

表3 5種動物IL-12與人數據庫的氨基酸序列比對結果

2.4 討論

IL-12是一種異源二聚體蛋白，具有與二硫鍵共價結合的α亞基和β亞基，是一種有效的抗腫瘤藥物。能夠通過刺激CD8+T細胞的細胞毒性，誘導Th1細胞分化，刺激抗原遞呈細胞對腫瘤抗原的遞呈作用，促進NK細胞、T細胞等IFN-γ分泌作用，抑制腫瘤血管生成等多種途徑增強機體免疫系統的腫瘤免疫作用，甚至可通過免疫調節誘導機體產生自身抗腫瘤的“遠端效應”和“免疫記憶”[7-9]。目前，已證實IL-12是唯一能夠促進骨髓造血系統全血象長久恢復的細胞因子，也是唯一能在輻射后24 h給藥仍然顯示全血象恢復功能的細胞因子[10-11]。IL-12還具有抗病毒[12]、抗肝炎[13]、抗寄生蟲[14]、抗哮喘[15]等多種生物學活性，其通過一系列復雜的作用機制來發揮作用。

多數生物技術藥物在蛋白質水平具有嚴格的種屬特異性，導致相應的一般藥理學、藥代動力學、藥效學評價及毒理學研究都存在種屬特異性問題。因而此類藥物的非臨床研究及安全性評價的主要挑戰就是確定相關種屬或動物模型。采用相關種屬進行非臨床研究及安全性評價有助于預測產品在臨床試驗中可能出現的治療效果及不良反應。

3 結論

分別采用了兩序列比對及多序列比對的方式進行氨基酸序列比對，雖然不同方式得出的一致性數據存在差異，但總體上，人的IL-12 α亞基及IL-12 β亞基氨基酸序列與常用種屬的同源性大小順序均為猴源>犬源>兔源>鼠源。即人的IL-12氨基酸序列與恒河猴、食蟹猴的一致性較高，與其它種屬的一致性普遍較低，因此存在種屬特異性。研究結果提示，IL-12產品以及相關衍生產品的藥理、藥效研究以及需種屬相關性動物進行的安全性評價應該在食蟹猴或恒河猴身上進行，才能獲得有意義于申報臨床及上市的試驗結果。