頭孢菌素C產生菌的誘變育種及發酵應用

牛李杰，張 婷，黨建寧，張寶新

(伊犁川寧生物技術股份有限公司，新疆 伊寧 835000)

頭孢菌素C(Cephalosporin C)，全稱7-(D-5-氨基-5-羧基戊酰胺基)頭孢霉烷酸，是一種親水性的β-內酰胺類抗生素，主要作為7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA)的合成中間體[1]。頭孢菌素C通過抑制細菌細胞壁肽的合成起到抑菌作用，具有抑菌范圍廣、對人體毒性較小等優點[2-3]。

頭孢菌素C的產生菌為頂頭孢霉(Cephalosporiumacremonium)，生長較慢，在發酵過程中容易出現抗性丟失、菌種退化的現象，因此需要不斷進行自然和誘變選育來保證菌種的優良性能，防止菌種衰退[4]。為了選育出性能優良的菌株，常采用紫外誘變、微波誘變、化學誘變等方法，但是微生物突變生理生化反應復雜，通過單一誘變往往難以達到目標。因此，誘變育種多采用復合誘變法，即組合兩種或者兩種以上化學或其它誘變劑使菌株發生較大的突變，進而篩選出優良菌株來提高效價[5]。曹棟等[6]通過紫外誘變結合終產物抗性的方法篩選到的突變菌株RM-8的頭孢菌素C效價比出發菌株提高了45%。任璐[7]通過紫外誘變篩選到銅離子、丙二酸、頭孢菌素C-鈉鹽耐受的突變菌株，并驗證了耐受突變菌株與高產突變菌株有一定的聯系，從耐受突變菌株中更容易得到高產突變菌株。孟國慶等[8]通過物理化學復合誘變的方法篩選到的高產菌株經搖瓶發酵后，頭孢菌素C效價達到2.83 g·L-1，比出發菌株提高了154.6%。黎亮等[9]對頂頭孢霉進行了紫外-氯化鋰復合誘變處理，并對培養基進行了優化，在160 t發酵罐中培養高產菌株，其效價比出發菌株提高了22.6%以上。

作者采用紫外線和丙二酸復合誘變的方法篩選頭孢菌素C高產菌株，并對篩選出的高產菌株進行50 L發酵罐小試驗證，為后期中試及工業化生產提供優良菌種和數據支持，對豐富菌種資源和提高生產效率具有現實意義。

1 實驗

1.1 菌種與培養基

頂頭孢霉(Cephalosporiumacremonium)B-1822-S-04，保存于伊犁川寧生物技術股份有限公司。

PDA培養基(g·L-1)：馬鈴薯浸粉5.0，葡萄糖20.0，硫酸銨15.0，瓊脂15.0，自然pH值。

種子搖瓶培養基(g·L-1)：黃豆粉28.0，酵母浸膏28.0，玉米漿19.0，蔗糖30.0，葡萄糖10.0，碳酸鈣5.0，pH值7.00±0.05。

發酵搖瓶培養基(g·L-1)：花生粉28.0，酵母浸膏30.0，黃豆粉35.0，玉米漿15.0，玉米粉20.0，硫酸銨1.0，碳酸鈣15.0，消泡劑1.4，pH值7.20±0.05。

15 L一級種子罐培養基(g·L-1)：黃豆粉29.0，花生粉28.5，蔗糖25.0，碳酸鈣5.0，玉米漿50.0，葡萄糖10.0，消泡劑0.35，pH值7.8，121 ℃滅菌35 min。

50 L二級種子罐培養基(g·L-1)：黃豆粉29.0，花生粉28.5，蔗糖8.0，豆油10.0，碳酸鈣6.5，硫酸銨2.5，硫酸鎂2.0，葡萄糖24.5，淀粉20.0，玉米漿60.0，消泡劑0.35，pH值6.0，121 ℃滅菌35 min。

50 L發酵罐培養基(g·L-1)：花生粉17.0，谷朊粉14.0，玉米粉11.0，糊精20.0，蛋氨酸15.0，硫酸銨8.0，豆油53.0，玉米漿100.0，硫酸鈣9.0，碳酸鈣5.0，消泡劑0.25，pH值6.8，121 ℃滅菌35 min。

1.2 儀器

30W/5A型紫外燈，上海四通特種燈泡廠；SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；HWS-250型恒溫恒濕培養箱，上海比朗儀器制造有限公司；ZWY-2102型恒溫振蕩培養箱，上海滬粵明科學儀器有限公司；SB-C18型高效液相色譜儀，安捷倫；CX31型顯微鏡，奧林巴斯；WS-500YDA型滅菌鍋，濟南寧樂醫療器械有限公司；PHS-3C型pH計，上海盛磁儀器有限公司；PL3002型電子天平，瑞士梅特勒-托利多；PHCBI型超低溫冰箱，日本三洋；50 L型六聯發酵罐，上海百侖生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

刮取活化培養的菌株B-1822-S-04孢子，與0.9%無菌生理鹽水混合，置于旋渦振蕩器上振蕩20 s使孢子混合均勻，用雙層無菌脫脂棉紗布過濾，得菌懸液，適當稀釋控制孢子濃度約為106個·mL-1。

1.3.2 致死率和正突變率的測定

統計誘變處理平板上的菌落數，以未經誘變處理平板上的菌落數作為對照，按下式計算致死率：

1.3.3 效價的測定[10-11]

按1.3.1方法制備菌懸液，經種子和發酵搖瓶培養后，將發酵液于3 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.44 μm過濾器過濾，采用HPLC法測定效價(頭孢菌素C含量，下同)。

HPLC檢測條件：安捷倫SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm),流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，流動相：0.01 mol·L-1乙酸鈉∶乙腈=98∶2(體積比)，pH值4.0。

1.3.4 紫外誘變

吸取5 mL菌懸液置于無菌玻璃平皿中，置于紫外燈下照射，間距15 cm；每隔一定時間(10 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s)吸取菌懸液，稀釋后涂布于PDA培養基平板上，以未經紫外燈照射的菌懸液作為對照，用黑紙包裹后置于30 ℃培養箱中培養7 d，統計平板上的菌落數，計算致死率，確定最佳紫外誘變時間。

在最佳紫外誘變時間下，再次進行紫外誘變培養，挑取形態、大小、色澤優良的單菌落，經種子和發酵搖瓶培養后測定效價。

1.3.5 紫外線和丙二酸復合誘變

將菌懸液紫外誘變一定時間(最佳誘變時間)，稀釋后涂布于含有不同濃度(0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%)丙二酸的PDA培養基平板上，然后置于30 ℃培養箱中培養7 d，統計平板上的菌落數，計算致死率，確定最佳丙二酸濃度。

在最佳紫外誘變時間、最佳丙二酸濃度下，再次進行紫外線和丙二酸復合誘變培養，挑取形態、大小、色澤優良的單菌落，經種子和搖瓶發酵培養后測定效價，篩選頭孢菌素C高產菌株。

1.3.6 高產菌株篩選及遺傳穩定性實驗

在確定的最佳復合誘變條件下，對菌懸液進行多次復合誘變處理，進一步篩選高產菌株。將最終選育出的高產菌株進行斜面傳代培養，經種子和發酵搖瓶培養后測定效價，驗證高產性能的遺傳穩定性。

1.3.7 驗證實驗

在最佳復合誘變條件下，對篩選到的高產菌株進行50 L發酵罐小試。首先將搖瓶種子液接入15 L一級種子罐，再將一級種子液接入50 L二級種子罐，然后將二級種子液接入50 L發酵罐中，每12 h取樣測定效價。整個過程嚴格按照工藝參數進行調控。

2 結果與討論

2.1 紫外誘變結果

菌懸液經過不同時間的紫外誘變，稀釋后涂布于培養基平板上，培養7 d后計算致死率，考察紫外誘變時間對致死率的影響，結果見表1。

表1 紫外誘變時間對致死率的影響

由表1可知，隨著紫外誘變時間的延長，致死率逐漸升高；0～90 s內致死率升高明顯，90 s后致死率升幅趨緩；紫外誘變90 s時的致死率為87.07%，紫外誘變120 s時的致死率達到96.55%。根據前期實驗，致死率在80%左右時正突變率較高，因此選擇紫外誘變時間為90 s。

2.2 紫外誘變效價檢測結果

菌懸液經過90 s紫外誘變后，通過培養篩選出形態、大小、色澤優良的菌株共83株，經種子和搖瓶發酵培養后，測定發酵液效價，結果見表2。

由表2可知，經紫外誘變后的效價基本呈正態分布，效價在3 000～3 999 mg·L-1的菌株最多，有25株；其次是效價在4 000～4 999 mg·L-1，有18株；效價高于出發菌株B-1822-S-04(效價為4 520 mg·L-1)的有16株，占總數的19.28%，其中效價最高達到6 251 mg·L-1，較出發菌株提高了38.29%。

表2 紫外誘變后的頭孢菌素C效價

2.3 紫外線和丙二酸復合誘變結果

菌懸液經過90 s紫外誘變，稀釋后涂布于含有不同濃度丙二酸的培養基平板上，培養7 d后計算致死率，考察丙二酸濃度對致死率的影響，結果見表3。

表3 丙二酸濃度對致死率的影響

由表3可知，隨著丙二酸濃度的增加，致死率逐漸升高；當丙二酸濃度增至1.2%時，致死率為100.00%。因此，1.0%是菌株對丙二酸的耐受臨界濃度。

2.4 復合誘變效價檢測結果

菌懸液經過90 s紫外誘變，稀釋后涂布于含有1.0%丙二酸的培養基平板上，通過培養篩選出形態、大小、色澤優良的菌株共76株，經種子和發酵搖瓶培養后，測定發酵液效價，結果見表4。

由表4可知，經過復合誘變后，效價在4 000～4 999 mg·L-1的菌株最多，有19株；效價高于出發菌株的有22株，占總數的28.95%，其中效價最高達到6 871 mg·L-1，較出發菌株B-1822-S-04提高了52.01%。

表4 復合誘變后的頭孢菌素C效價分析

2.5 高產菌株的篩選及其遺傳穩定性

在紫外誘變時間為90 s、丙二酸濃度為1.0%的條件下，對菌株B-1822-S-04進行多次紫外和丙二酸復合誘變，篩選到10株頭孢菌素C高產菌株，經種子和發酵搖瓶培養后測定效價，結果見表5。

表5 高產菌株的效價

由表5可知，10株頭孢菌素C高產菌株中效價較高的是菌株D-G-017、D-G-083、D-G-096和D-G-133，其效價分別為6 674 mg·L-1、6 554 mg·L-1、6 816 mg·L-1和6 789 mg·L-1，分別較出發菌株B-1822-S-04提高了47.65%、45.00%、50.80%和50.20%。

對4株高產菌株進行遺傳穩定性實驗，結果(表6)顯示，傳代5代后，4株高產菌株的效價雖有下降，但與出發菌株相差不大，說明這4株高產菌株的遺傳穩定性較好。將篩選的4株高產菌株分別保存，供后續實驗使用。

表6 4株高產菌株的遺傳穩定性分析

2.6 高產菌株的小試發酵結果

將篩選到的4株高產菌株分別在50 L發酵罐中培養160 h，效價均呈上升趨勢，其中菌株D-G-096的效價最高達到了29 270 mg·L-1(圖1)，較搖瓶發酵的效價(6 816 mg·L-1)提高了約4倍，較出發菌株50 L發酵罐的效價(13 868 mg·L-1)提高了111.06%；菌株D-G-133、D-G-017、D-G-083的效價也分別提高了102.57%、94.70%、73.56%。

圖1 高產菌株小試發酵過程中的效價變化

2.7 討論

影響發酵水平的首要因素是菌種資源，性能優良的菌種具有效價高、性能穩定、不易退化變異、對原材料要求低等特點。本實驗采用紫外線和丙二酸復合誘變的方法篩選頭孢菌素C高產菌株，雖然最終篩選出的菌株D-G-096搖瓶發酵的效價為6 816 mg·L-1，比出發菌株提高了50.80%，但是實驗周期較長，過程較為復雜；而傳統誘變技術，例如孟國慶[12]、杜淑濤[13]通過原生質體融合技術，Sun等[14]、陳國枝等[15]、胡又佳等[16]通過基因工程技術，李英英等[17]采用ARTP誘變技術，也能篩選出頭孢菌素C高產菌株，且簡單快速、目的性更強。

本實驗將篩選的4株高產菌株進行50 L發酵罐小試，其中菌株D-G-096的效價達到29 270 mg·L-1，是搖瓶發酵的4倍，較出發菌株的50 L發酵罐的效價提高了111.06%。牛永利[18]曾通過實驗驗證了50 L和5 t發酵罐效價沒有太大變化，可以將50 L發酵罐的工藝結論應用到工業化生產中。但是由于菌種不同、培養基配方不同，后期還需要進一步驗證500 L、5 t發酵罐的中試發酵情況，將發酵工藝更好地應用于工業化生產。

3 結論

以頭孢菌素C產生菌頂頭孢霉(Cephalosporiumacremonium) B-1822-S-04為出發菌株，經過紫外線和丙二酸復合誘變，篩選得到了4株頭孢菌素C高產菌株D-G-017、D-G-083、D-G-096和D-G-133，其中菌株D-G-096頭孢菌素C效價高達6 816 mg·L-1，較出發菌株提高了50.80%，且高產特性穩定；50 L發酵罐小試結果顯示，菌株D-G-096的效價達到了29 270 mg·L-1，較出發菌株提高了111.06%，可作為優良高產菌株保存使用。