化妝品中金黃色葡萄球菌的快速檢測方法研究

文 霞, 張淑瑤, 陳漪汶, 謝小保

廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室,廣州 510070

隨著人類生活水平的提高，化妝品已逐漸成為人們生活必需品，化妝品中各種營養元素給微生物提供了良好的生存環境，金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬中對人類致病力最強的一種，其亦存在于正常人的皮膚表面，與其他微生物組成皮膚表面微生態系統，一旦人們使用了污染有金黃色葡萄球菌的化妝品，勢必會導致皮膚微生態失衡，繼而發生炎癥、化膿等人體局部化膿性病灶，如果皮膚有破損，甚至可導致敗血癥，另外，金黃色葡萄球菌還可以感染呼吸道，毒害消化道，引起相應系統的疾病，因此，國內外有關化妝品的衛生要求文件，包括《化妝品安全技術規范》(2015年版)中都將金黃色葡萄球菌列為化妝品常規檢測項目，要求不得檢出。

在檢測手段上，目前國內外檢測機構仍主要采用傳統的方法對金黃色葡萄球菌進行檢測，整個過程一般需要3 d～5 d，且操作煩瑣，已不能滿足微生物快速準確檢測的現實需要，而且有可能存在可見不可培養(viable but nonculturable，VBNC)的細菌。因此，迫切需要建立新的快速檢測技術和方法。近幾十年來，基于分子技術的PCR方法已成為解決這些問題的最有前景的快速檢測方法之一[1,2]。

PCR技術以敏感、特異、簡便和快速等優點被越來越多地應用，研究表明 PCR 鑒定能準確快速的鑒定金黃色葡萄球菌[3,4]。ALI R等[5]研究指出 PCR是鑒定金黃色葡萄球菌非常好的標準。目前, 關于金黃色葡萄球菌鑒定方法準確性的研究已有較多報道, 而對于各種鑒定方法在檢驗過程中的實際應用研究較少。其中多重PCR方法以準確、高效的特點廣受研究者關注。金黃色葡萄球菌會產生耐熱核酸酶, 耐熱核酸酶編碼基因(nuc基因)不僅為金葡菌所特有, 而且在不同菌株之間具有較高保守性，廖光華等[6]以隨機挑選的 50 株菌為研究對象, 建立了一種基于基因進行PCR 檢測金黃色葡萄球菌的方法。另外, 研究顯示纖維蛋白原結合蛋白基因(clfA)存在于所有金黃色葡萄球菌的染色體中[7]，同時,SmaI序列為其他葡萄球菌缺失而金黃色葡萄球菌特有的序列[8]。已有研究證實這三種基因和序列組合的多重PCR可用于食品中金黃色葡萄球菌的檢測[9]。

另外，合適的增菌培養液是提高菌落檢測效率的有效手段，本研究對《化妝品安全技術規范》(2015年版)中的SCDLP增菌液進行了優化，并結合三重PCR方法快速、準確地檢測化妝品中污染的金黃色葡萄球菌，旨在為化妝品中金黃色葡萄球菌的快速檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑：酪蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、NaCl、葡萄糖、酵母提取物、丙酮酸鈉、組氨酸、硫基乙醇酸鈉、卵磷脂、吐溫-80和瓊脂糖(廣州碩恒生物科技有限公司)；2×EasyTaq? PCR SuperMix(北京全式金生物技術有限公司)、DNA Maker(北京全式金生物技術有限公司)、細菌 DNA 提取試劑盒(廣東 Magen 美基生物)、瓊脂糖和營養瓊脂(NA)培養基(廣東環凱生物技術有限公司)，凝膠成像分析系統(Bio-Red)。

儀器：PCR儀，DNP-9082型電熱恒溫培養箱，廣州環凱微生物科技有限公司；DKB-501A型恒溫水浴鍋，廣州環凱微生物科技有限公司；DYY-6D型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 實驗菌株和引物

實驗菌株：大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC 8039)、銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa(ATCC 9027)、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC 6538、ATCC6538P、CMCC26003)，標準菌株購于廣東省科學院微生物研究所菌種保藏中心；沃氏葡萄球菌Staphylococcuswarneri、腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophytics、弗氏檸檬酸桿菌Citrobacterfreundi，惡臭假單胞菌Pseudomonasputida，肺炎克雷伯氏菌Klebsiellapneumoniae，粘質沙雷氏菌Serratiamarcescens，污染菌株來源于受污染的化妝品樣品。

引物合成：以SmaI限制性酶切片斷特異序列、以耐熱核酸酶基因nuc、纖維蛋白原結合蛋白基因clfA為靶基因，利用Primer5.0設計引物，委托北京六合華大基因科技有限公司廣州分公司合成, 其序列見表1。

表1 引物序列

1.3 實驗樣品

實驗樣品來源于市售的保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽膚水和粉底液，各1瓶，經《化妝品安全技術規范》(2015年版)中微生物檢測方法檢測后，未有微生物污染。

1.4 實驗方法

1.4.1單重PCR特異性實驗

分別采用合成好的金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc基因)、特異性序列(SmaI序列)和纖維蛋白原結合蛋白基因(clfA基因)引物分別對金黃色葡萄球菌ATCC6538、金黃色葡萄球菌ATCC6538P和金黃色葡萄球菌CMCC26 003的總DNA進行單重PCR擴增。

PCR擴增的反應體系為：濃度為1 pg/μL～100 ng/μL的DNA模板1 μL、含Mg2+的10×緩沖溶液10 mM、dNTP 0.2 mM、Taq DNA聚合酶 1.0 U、引物對的上下游引物各0.5 μM，加ddH2O至總體積為25 μL；PCR擴增的反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s、48 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min 30 s，進行30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.4.2單重和多重PCR檢測靈敏度實驗

以不同濃度的金黃色葡萄球菌ATCC6538 DNA模板對上述三對引物的單重和多重PCR檢測靈敏度進行測試，其中金黃色葡萄球菌ATCC6538 DNA模板濃度分別為134.82 ng/μL、13.48 ng/μL、1.35 ng/μL、134.82 pg/μL、13.48 pg/μL、1.35 pg/μL和0.13 pg/μL。PCR反應體系和條件同1.4.1。

1.4.3人工污染化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測

1.4.3.1人工污染樣品

將市售的六個不同類型化妝品樣品(保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽膚水和粉底液)，進行人工隨機致病菌污染，保濕乳中加入金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 6538，化妝水中加入金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC 6538和大腸桿菌EscherichiacoliATCC 8039，面霜中加入金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 6538和銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 9027，潔面膏中加入大腸桿菌EscherichiacoliATCC 8039，爽膚水中加入銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 9027，粉底液中加入大腸桿菌EscherichiacoliATCC 8039和銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosaATCC 9027，控制加入上述致病菌污染后各樣品的菌懸液的終濃度為10 CFU/mL，由此制備得到各化妝品的人工污染樣品。

1.4.3.2人工污染樣品增菌培養

制備增菌液：取酪蛋白胨17 g、大豆蛋白胨3 g、牛肉膏3 g、NaCl 5 g、葡萄糖2.5 g、酵母提取物0.5 g、丙酮酸鈉15 g、組氨酸5 g、硫基乙醇酸鈉1 g、卵磷脂2 g和吐溫-80 10 g，先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其他成分混合，加熱溶解至1 L，調pH為7.2～7.3，備用。

分別取10 mL化妝品的人工污染樣品，加入90 mL增菌液中，充分混勻；陰性對照為100 mL增菌液，陽性對照為加入了金黃色葡萄球菌ATCC6538的100 mL增菌液(終濃度為1 CFU/mL～10CFU/mL)，各組置于37 ℃振蕩培養箱中150 r/min培養6 h。

1.4.3.3人工污染樣品PCR檢測

基因組DNA提取：取上述振蕩培養后的增菌液各10 mL，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，采用Magen細菌DNA提取試劑盒提取六個化妝品的人工污染樣品、陰性對照和陽性對照中的細菌基因組DNA，采用BioSpec-nano超微量分光光度計測定濃度，于-20 ℃保存備用。

采用設計的三對引物對化妝品的人工污染樣品、陰性對照和陽性對照中金黃色葡萄球菌進行PCR擴增，反應體系和條件同1.4.1。取PCR擴增產物5 μL用1%瓊脂糖凝膠(含染色劑Gold view)在120 v電壓下電泳30 min，然后置于Bio-Red凝膠成像分析系統中觀察結果。

2 結果與討論

2.1 單重PCR特異性實驗結果

采用本研究設計的三對引物(nuc、SmaI、clfA)分別對三株金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC6538、ATCC6538P、CMCC26003)進行PCR實驗，結果顯示三對引物均能擴增出清晰的條帶，目的條帶的大小分別為618 bp、822 bp和348 bp(見圖1)，采用三對引物分別對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌、弗氏檸檬酸桿菌、惡臭假單胞菌、肺炎克雷伯氏菌和粘質沙雷氏菌8種化妝品常見的污染微生物進行PCR擴增，結果表明8株細菌均未擴增出條帶，表明本研究設計的引物特異性良好(見圖2、圖3和圖4)。

M：DNA marker；1、4、7：金黃色葡萄球菌ATCC 6538；2、5、8：金黃色葡萄球菌ATCC6538P；3、6、9：金黃色葡萄球菌CMCC26003。

M：DNA marker；1：大腸桿菌；2：銅綠假單胞菌；3：沃氏葡萄球菌；4：腐生葡萄球菌；5：弗氏檸檬酸桿菌；6：惡臭假單胞菌；7：肺炎克雷伯氏菌；8：粘質沙雷氏菌。

M：DNA marker；1～8：污染菌株樣品同圖2。

M：DNA marker；1～8：污染菌株樣品同圖2。

2.2 單重和多重PCR檢測靈敏度實驗結果

采用三對引物分別對金黃色葡萄球菌進行靈敏度檢測，結果顯示，nuc基因擴增的靈敏度為1.35pg/μL，clfA基因擴增的靈敏度為13.48 pg/μL，SmaI序列擴增的靈敏度為13.48 pg/μL；當同時采用三對引物進行多重PCR組合擴增時，金黃色葡萄球菌的靈敏度為1.35 pg/μL，見圖5、圖6、圖7和圖8。

M：DNA marker；1～7：濃度為134.82 ng/μL、13.48 ng/μL、1.35ng/μL、134.82 pg/μL、13.48 pg/μL、1.35pg/μL和0.13 pg/μL的DNA模板；8：陽性對照；9：陰性對照。

M代表DNA marker；1～9代表的擴增樣品同圖5

M代表DNA marker；1～9代表的擴增樣品同圖5

M：DNA marker；1～9：擴增樣品同圖5

2.3 人工污染化妝品中金黃色葡萄球菌的檢測結果

分別對6種不同類型的化妝品進行人工污染后，傳統平板計數法檢測污染樣品中微生物的總數，重復檢測三次取平均值，結果是保濕乳為1.5CFU/g，化妝水為2.6 CFU/g，面霜為7.3 CFU/g，潔面膏為9.6 CFU/g，爽膚水為2.4 CFU/g，粉底液為5.5 CFU/g。經增菌培養后，采用多重PCR方法檢測其中的金黃色葡萄球菌，結果顯示，污染有金黃色葡萄球菌的化妝品樣品(保濕乳、化妝水、面霜)均能檢出各基因相應條帶，而沒有加入金黃色葡萄球菌的化妝品樣品(潔面膏、爽膚水和粉底液)未出現條帶(見圖9)，表明金黃色葡萄球菌多重PCR檢測引物能快速、準確檢測出污染化妝品中的金黃色葡萄球菌，且在保濕乳中，經增菌后，可檢出1.5 CFU/g的金黃色葡萄球菌。

M：DNA marker；1：保濕乳；2：化妝水；3：面霜；4：潔面膏；5：爽膚水；6：粉底液；7：陽性對照，8：陰性對照。

2.4 討論

目前，市場上的化妝品種類繁多且來源廣泛，特別是新型化妝品的不斷推出，加上各種人為因素與技術問題等給化妝品微生物檢驗工作帶來極大挑戰，但總的趨勢是化妝品微生物的合格率在逐年上升，然而由于化妝品中防腐劑的非正常添加，導致一些致病性金黃色葡萄球菌、糞大腸菌群的檢出率很低[10-12]，因此，化妝品微生物檢測的靈敏度也有待提高。

微生物的檢測方法主要依賴傳統的瓊脂平板培養法，方法繁瑣，耗時長，且容易出現誤檢和漏檢。防腐劑的存在也使相當一部分化妝品的抑菌作用無法清除，很大程度上影響了檢驗結果。本研究首先對金黃色葡萄球菌的增菌液進行了優化，在SCDLP增菌液的基礎上添加了一些化合物，如組氨酸、巰基乙醇酸鈉，可與卵磷脂和吐溫-80產生協同作用，進一步中和化妝品中常見的防腐劑，使微生物可以快速恢復生長。另外，根據YOON等[13]的報道，酵母膏和丙酮酸鈉可促進金黃色葡萄球菌復蘇生長，特別是金黃色葡萄球菌在不同壓力條件下(高溫、低溫、缺氧、紫外線等)處于休眠狀態或生長受限的情況，其中，丙酮酸鈉是一種VBNC狀態微生物復蘇促進劑，可以刺激VBNC細胞的新陳代謝及DNA和蛋白質的生物合成[14,15]，因此，優化的增菌液可有效擴增化妝品中的金黃色葡萄球菌。增菌后，即進行多重PCR實驗，本文多重PCR靈敏度可達到1.35 pg/μL，比徐曉可等[9]采用相同三組引物和序列擴增的靈敏度要高。同時，對人工污染樣品，經增菌后，在保濕乳中可檢出1.5 CFU/g的金黃色葡萄球菌，且特異性良好。本研究還添加了空白對照，可減小微生物檢測的誤差，降低漏檢和誤檢的可能性。但是，普通PCR檢測方法也有弊端，其只能進行定性檢測，無法檢測到污染微生物的具體數量，而且PCR法檢測的是微生物的DNA，其表示的是存在DNA即存在微生物，但當微生物死亡，其核酸還存在的情況也包含在內，所以也可能出現假陽性的結果，但通過前期的6 h增菌培養后，這種假陽性的可能性會大大降低。盡管如此，更加準確且能定量的方法仍然需要建立，如將熒光染料疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide，EMA)或疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)與實時熒光定量PCR技術相結合的方法等，作者將繼續對此改進方法進行深入研究。

3 結論

本研究提出了一種可快速定性檢測化妝品中金黃色葡萄球菌的方法，即微生物預富集結合多重PCR的檢測方法可以有效將受防腐劑等其他壓力條件下的VBNC狀態金黃色葡萄球菌復蘇并檢測出來，且靈敏度和特異性均較好。該方法適用于包括保濕乳、化妝水、面霜、潔面膏、爽膚水和粉底液等不同性質的化妝品產品。