汽車空調蒸發器微生物種群調查及分類鑒定研究

尚博文， 馮 靜， 王景軒， 陳晶華， 李 源， 施慶珊，謝小保*， 馬 秋， 郭秋彥

1.吉利汽車研究院(寧波)有限公司，浙江 寧波 315000；2.廣東省科學院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應用重點實驗室，廣東 廣州 510070；3.杭州福兆朗風科技有限公司，浙江 杭州 311215；4.博富科技股份有限公司，江蘇 昆山 215300

隨著國民經濟的發展和人們生活水平的不斷提高，汽車的保有量和普及率不斷提升。空調系統作為汽車生產中不可缺少的設施之一，可實現對車內空氣溫度、濕度的有效調節，并保持車內空氣清潔，從而大大改善了汽車的舒適性和人們的駕乘環境。然而，汽車空調在創造舒適環境的同時，也會由于長期運行、不易清洗或清洗不當等原因而給汽車內部造成各種污染，尤其值得關注的是微生物污染。

汽車空調微生物污染不僅會導致汽車空調產生異味，破壞車內清新環境，嚴重時還會危害人體健康，引發各種疾病。近年來，關于汽車空調異味的報道及消費者投訴越來越多，給消費者及汽車生產廠商都帶來了困擾。蒸發器屬于汽車空調的重要組成部分，因其特殊的位置環境，不易拆卸且難以清洗，有可能為汽車空調微生物的滋生和繁殖提供適宜環境。目前關于汽車空調微生物污染及相關種群調查的相關研究及報道較少。基于此，本研究主要對汽車空調蒸發器的微生物污染情況及其表面的主要微生物種群進行取樣調查及分離鑒定，以明確污染危害汽車空調蒸發器的主要微生物種群，為解決汽車空調異味提供前期的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 采樣蒸發器情況

以正常行駛10萬公里的某品牌汽車空調蒸發器為調查采樣對象，采樣蒸發器具體情況如下：

(1)抗菌處理組蒸發器(抗菌組)：蒸發器表面涂刷有氧化鋅抗菌涂層，取出時表面有較輕微異味，已正常運行10萬公里。

(2)未處理組蒸發器(對照組)：蒸發器表面未經任何處理，取出時表面異味較抗菌組稍濃，已正常運行10萬公里。

1.2 采樣部位及方法

采用表面采樣法，分別對抗菌組及對照組蒸發器進風口(正面)及出風口(背面)上不同位置進行取樣。用無菌濕潤的棉簽，在蒸發器表面選取合適位點進行均勻擦拭后，剪掉手接觸部位，放入含有5 mL無菌生理鹽水的取樣管中，密封保存后帶回實驗室，于4 ℃保存。采樣部位涂抹區域約為5 cm×5 cm大小，每位點取樣次數為2次。蒸發器表面具體采樣部位及編號如圖1和表1所示。

抗菌組蒸發器正面

表1 蒸發器表面各位點采樣編號及具體部位

1.3 菌株的分離、純化及培養

將含采樣樣品的采樣管從4 ℃冰箱中取出后，分別于渦旋振蕩器上充分渦旋震蕩，分散均勻。于超凈工作臺上，用無菌移液器各吸取200 μL樣品液，分別轉移至含有營養肉湯瓊脂培養基(NA)和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)的固體平板上，涂布均勻后，分別置于不同條件的恒溫培養箱中培養。每樣品設置三個重復，分別置于37 ℃常規恒溫培養箱、37 ℃厭氧培養箱及28 ℃恒溫恒濕培養箱中培養一定時間后取出，觀察并記錄平板表面生長的菌落數量。隨后，挑取形態各異的單菌落轉移至另一對應的NA或PDA平板上，分別置于37 ℃(NA平板)培養箱和28 ℃(PDA平板)培養箱中進行純培養后，得到經純化后的菌株。

1.4 菌株的形態鑒定及顯微形態觀察

用無菌接種環取一環無菌水于潔凈的載玻片上，挑取少量微生物菌株菌體放入無菌水中，涂抹均勻并固定后，進行革蘭氏染色。采用Nikon E200生物顯微鏡攝像系統，于10×100倍油鏡下，對菌株的顯微形態(大小、顏色、形狀等)進行顯微觀察并拍照。根據《伯杰細菌鑒定手冊》[1]及《真菌鑒定手冊》[2]等分類標準，綜合菌株的平板培養特性及顯微特征，結合相關微生物分類學資料進行形態學鑒定。

1.5 菌株的分子生物學鑒定

采用16S rRNA或18S rRNA序列擴增方法對微生物菌株進行分子生物學鑒定。挑取NA或PDA上培養好的菌株菌絲體，用美基生物DNA提取試劑盒(AmPure Microbial DNA Kit)提取基因組DNA。以提取到的DNA為模板，采用細菌通用16S rRNA及真菌通用18S rRNA進行PCR擴增(表2)。將PCR反應產物送至廣州擎科生物技術有限公司在ABI 3730XL測序儀上進行雙向測序。將測得的DNA序列結果提交NCBI進行序列比對，并采用GenBank中的BLAST軟件進行同源性比較，確定微生物菌株的種群分類。

表2 PCR擴增通用引物序列信息

2 結果與分析

2.1 微生物菌株的分離及培養

表3及圖2～圖4為抗菌組蒸發器各樣品在NA平板及PDA平板上經不同培養條件及不同培養時間后，平板表面上生長出的菌落情況。由圖可知，抗菌組蒸發器樣品在NA培養基上經常規培養或厭氧培養后，都僅有極少數樣品長出了少量菌落，其余樣品上則未分離得到微生物菌落。而在PDA培養基上上培養7 d的培養結果則表明，A1、A3及A5樣品平板上長出了數量不同的菌落，其余樣品對應平板上則未觀察到菌落生長。上述結果表明，汽車空調蒸發器表面經抗菌涂層處理后，其表面附著的微生物群落數量極少，可有效控制蒸發器表面微生物的滋生及繁殖。

表3 不同樣品培養一定時間后的平板菌落數

圖2 抗菌組蒸發器樣品在NA平板上常規培養24 h后的菌落生長情況

圖3 抗菌組蒸發器樣品在NA平板上厭氧培養48 h后的菌落生長情況

圖4 抗菌組蒸發器樣品在PDA平板上培養7 d后的菌落生長情況

圖5～圖7為對照組蒸發器各樣品在NA平板及PDA平板上經不同培養條件及不同培養時間后，平板表面上生長出的菌落情況。結果表明，對照組蒸發器部分樣品，在平板上生長一定時間后，其表面生長出了部分菌落，其中尤以C1樣品(采自對照組蒸發器正面左上角，圖1C1位置)為最。由圖可知，C1樣品無論是經常規培養或厭氧培養后，其對應的NA平板上均著生有較多數量的微生物菌落。同時，上述樣品經PDA培養基培養后，平板上同樣觀察到大量菌落的生長。這一結果表明，未經抗菌劑處理的汽車空調蒸發器，其表面滋生和繁殖的微生物群落數量顯著高于經抗菌處理后的抗菌組汽車空調蒸發器。

圖5 對照組蒸發器樣品在NA平板上常規培養24 h后的菌落生長情況

圖6 對照組蒸發器樣品在NA平板上厭氧培養48 h后的菌落生長情況

圖7 對照組蒸發器樣品在PDA平板上培養7 d后的菌落生長情況

此外，試驗結果還表明，微生物在該蒸發器上的滋生及繁殖位置，主要集中于蒸發器進風口面左上角位置(對應圖1C1位置)，表現為該處對應樣品上分離得到的菌落數顯著高于其它部位樣品上分離到的菌落數，抗菌組蒸發器中PDA平板上的菌落結果也驗證了該結果。這一結果表明，汽車空調蒸發器上的微生物群落分布疑與蒸發器的安裝位置或其進風口位置密切相關。

2.2 菌株的純化及顯微形態觀察

從上述NA或PDA上挑取形態各異的單菌落，分別轉接至另一對應的NA平板或PDA平板上，于37 ℃(NA平板)或28 ℃(PDA平板)培養箱中培養后，得到經純化后的菌株。抗菌組蒸發器及對照組蒸發器樣品分離得到的純化菌株數如表4所示。

由表4可知，從抗菌組蒸發器上分離純化得到的菌株數一共為10株(A1～A10)，而對照組蒸發器上經分離純化得到的菌株數為50株(C1～C50)，顯著高于抗菌處理組蒸發器。這一結果表明經過抗菌處理后，蒸發器表面的微生物種群數量大幅降低，表明適宜的抗菌處理可有效抑制汽車空調蒸發器上微生物的滋生與繁殖。

表4 蒸發器樣品分離菌株數量及編號

2.3 微生物菌株的形態鑒定

圖8為抗菌組蒸發器上分離得到的10株菌株A1-A10在光學顯微鏡(10×100)下的顯微形態圖。由圖可知，在A1～A10菌株中，大部分菌株形態呈桿菌，部分為短桿狀或柱狀，部分呈長鏈狀排列，顯微視野中可見卵圓形芽孢或碎裂的芽孢殼，可以明確判斷其為芽孢桿菌屬菌株。而A3～A5菌株在顯微形態下呈卵圓形，部分細胞可見頂端芽體，根據其形態可初步推斷其為酵母菌。

圖8 抗菌組蒸發器分離菌株(A1～A10)的顯微形態圖

圖9為對照組蒸發器上分離得到的微生物菌株(C1～C50)在光學顯微鏡下的顯微形態圖。由圖9可知，C1～C50菌株中大部分菌株的顯微形態呈短桿狀至柱狀或長鏈桿狀，且在顯微視野下可見芽孢或芽孢殼，表明C1～C50中的大部分菌株也為芽孢桿菌。此外，部分菌株的顯微形態呈球狀或球桿狀和細小桿菌等，根據顯微形態難以判斷出其所屬種群，還需結合其分子生物學鑒定結果才能準確判斷。形態鑒定結果也表明，從對照組中分離得到的微生物菌株，其微生物種群的類別要明顯多于經抗菌處理后的抗菌組蒸發器上的微生物種群，這一結果證明抗菌處理不僅可以抑制汽車空調蒸發器中微生物的種群數量，也有利于抑制微生物種群中部分特定菌株的生長和繁殖。

圖9 對照組蒸發器分離菌株(C1～C50)的顯微形態圖

2.4 微生物菌株的分子鑒定

對上述分離得到的A1～A10及C1～C50號菌株提取DNA，經PCR擴增測序并進行BLAST比對后，再結合其顯微形態特征，明確了上述菌株的種屬分類。抗菌組蒸發器及對照組蒸發器采樣樣品分離菌株的分子生物學鑒定結果如表5所示。由表5可知，抗菌組蒸發器上分離得到的10株菌株中，7株為芽孢桿菌，占總菌株數量的70%，為抗菌組蒸發器微生物種群中的優勢種群；另三株為紅酵母屬(Rhodotorulasp.)菌株，占總菌株數量的30%。

表5 不同樣品上分離菌株的鑒定種屬結果

對照組蒸發器分離菌株中，共發現芽孢桿菌屬(Bacillussp.)菌株44株，占總菌數的88%，表明對照組蒸發器微生物種群中的優勢菌株也為芽孢桿菌。這與抗菌組蒸發器上的優勢菌群相一致，表明汽車空調微生物種群中的優勢菌群為芽孢桿菌，這與芽孢桿菌自身極強的耐受性密切相關。研究表明，芽孢桿菌產生的孢子(芽孢)對諸如高溫、干燥、輻射、酸堿等不利環境條件均有極強的抵抗力，能在不利的環境條件中存活，并在適宜條件下重新復蘇存活。除芽孢桿菌外，對照組蒸發器樣品中還分離得到了約翰遜不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)和甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)幾種菌，均為革蘭氏陰性桿菌。鞘氨醇單胞菌屬和甲基桿菌屬微生物通常是室內新風空氣凈化系統及室內空氣中經常檢出的微生物優勢菌群[3,4]。不動桿菌屬菌株生存能力極強，對高磷高鹽、制霉菌素、絲綢染劑、紫外線及多種抗生素類藥物等均有較強抵抗力[5-8]。此外，約翰遜不動桿菌還是一種重要的條件致病菌，在一定條件下可引發呼吸道感染、燒傷感染、中耳炎、腦膜炎、敗血癥和泌尿系統感染等[9]。

3 結論

微生物污染是引發汽車空調異味的主要原因，對汽車空調蒸發器上微生物種群的分析調查有助于明確污染汽車空調的主要微生物類群，從而為后續解決汽車空調異味提供研究基礎及科學指導。通過對抗菌組及對照組汽車空調蒸發器表面樣品的采集、分離及鑒定，共從抗菌組蒸發器上分離得到10株菌株，從對照組蒸發器上分離得到50株菌株。此外，無論在抗菌組還是對照組蒸發器中，芽孢桿菌均是汽車空調蒸發器微生物種群中的優勢菌群，其次為紅酵母菌及鞘氨醇單胞菌等。與對照組蒸發器相比，抗菌組蒸發器上的微生物群落與種類均顯著下降，表明對汽車空調蒸發器的抗菌處理可有效抑制蒸發器表面微生物群落的滋生及繁殖。