溴硝醇液相檢測(cè)方法的研究探索

馬寶龍， 周銀輝， 魏學(xué)鑫， 顧學(xué)斌

上海萬(wàn)厚生物科技有限公司，上海 201815

1919年，溴硝醇(化學(xué)鍵線式如圖1)由WILKENDORF R制得，后由英國(guó)藥學(xué)協(xié)會(huì)公布其通用名為Bronopol。該物質(zhì)作為殺菌劑主要應(yīng)用于工業(yè)循環(huán)水、造紙紙漿、涂料、化妝品、木材、冷卻水循環(huán)系統(tǒng)以及其他領(lǐng)域包括農(nóng)業(yè)在內(nèi)的殺菌、防腐及防藻[1]。

圖1 溴硝醇化學(xué)結(jié)構(gòu)

溴硝醇在工業(yè)生產(chǎn)體系中，大多數(shù)的有機(jī)物、各種表面活性劑或低濃度蛋白都不會(huì)影響其活性，且彼此無(wú)拮抗作用。當(dāng)25%甲基異噻唑啉酮和75%溴硝醇復(fù)配時(shí)，其殺菌協(xié)同作用顯著。室內(nèi)人工感染預(yù)防實(shí)驗(yàn)和治療實(shí)驗(yàn)對(duì)這一結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明，溴硝醇和異噻唑啉酮配比為4∶1的復(fù)方制劑，其預(yù)防作用及治療作用均優(yōu)于單劑[2]。

目前，關(guān)于溴硝醇復(fù)配制劑利用高效液相色譜測(cè)定其含量的方法未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用的方法能夠在較短時(shí)間完成對(duì)溴硝醇原料及其制劑的定量檢測(cè)，該方法的重現(xiàn)性、精密度、回收率都可以達(dá)到定量分析的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

液相色譜儀：賽默飛高效液相色譜儀u3000配有紫外檢測(cè)器；工作站：變色龍工作站7.2.7版本；色譜柱：Phenomenex Kinetex C18不銹鋼柱(250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相抽濾裝置。

1.2 試劑

甲醇：色譜純；磷酸：色譜純；純凈水；溴硝醇標(biāo)樣(含量為99.46%)，市售；待測(cè)樣品A(溴硝醇+卡松)，萬(wàn)厚生物提供；待測(cè)樣品B(溴硝醇+OIT)，萬(wàn)厚生物提供。待測(cè)樣品C(溴硝醇+溶劑)。

1.3 操作條件

色譜柱: Phenomenex Kinetex C18柱或同等;檢測(cè)器波長(zhǎng):215 nm;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:甲醇∶0.05%磷酸水溶液(v/v)=15∶85; 流速:1.0 mL/min。溴硝醇保留時(shí)間約為7.1 min。

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1稱取配制

標(biāo)樣: 先用稱量紙精確稱取0.010 g(精確到0.001 g，實(shí)際稱取質(zhì)量為m1)含量為99.46%的標(biāo)準(zhǔn)溴硝醇標(biāo)樣粉末。將100 mL的潔凈帶蓋塑料瓶中置于電子天平上，清零，然后加入標(biāo)樣及流動(dòng)相稀釋到100.0 g(精確到0.001 g，實(shí)際稀釋后總質(zhì)量為m2)，超聲分散至原料完全溶解,震蕩混勻，靜置3 min待用。

待檢溴硝醇原料: 用稱量紙精確稱取0.010 g(精確到0.001 g，實(shí)際稱取質(zhì)量為m3)待測(cè)樣。將100 mL的帶蓋塑料瓶中置于天平上。清零，然后加入待測(cè)樣及流動(dòng)相稀釋到100.0 g(精確到0.001 g，實(shí)際稱取質(zhì)量為m4)，超聲分散至原料完全溶解,震蕩混勻，靜置3 min待用。

1.4.2液相穩(wěn)定

打開(kāi)液相色譜儀前先將流動(dòng)相超聲過(guò)濾，然后打開(kāi)液相色譜儀將參數(shù)設(shè)置好，打開(kāi)氘燈，穩(wěn)定30 min，等基線平穩(wěn)，壓力穩(wěn)定后，記下壓力值，然后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.3進(jìn)樣

先進(jìn)甲醇清洗進(jìn)樣器，試運(yùn)行一針空白甲醇。再將進(jìn)樣針用甲醇清洗干凈，然后再用標(biāo)樣清洗(次數(shù)不少于3次)，最后吸取100 μL的標(biāo)樣，快速注入樣品閥中(Load位置)，然后快速將閥門打到Inject位置，進(jìn)行分析。每針運(yùn)行時(shí)間不少于14 min。連續(xù)進(jìn)兩針標(biāo)樣，檢定兩次檢出峰面積偏差小于2.0%以后，再進(jìn)行待檢樣品的測(cè)定。待測(cè)樣品測(cè)定至少進(jìn)行兩次。

1.4.4結(jié)果計(jì)算

從圖2可以看到有一個(gè)峰為主要峰即為溴硝醇。將主要峰的保留時(shí)間，峰面積記錄下來(lái)。譜圖分析要自動(dòng)標(biāo)峰，本特定儀器標(biāo)定色譜峰起點(diǎn)和終點(diǎn)的斜率設(shè)定為1 000(推薦值，視色譜圖中積分線合理而定，但在本次定量中，該值保持一致)。然后進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

圖2 溴硝醇標(biāo)樣液相色譜圖

其中，

m1—稱取標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量, g；

m2—稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的總質(zhì)量, g；

m3—稱取待測(cè)樣品的質(zhì)量, g；

m4—稀釋后的待測(cè)樣品溶液的總質(zhì)量, g；

a—標(biāo)準(zhǔn)樣品中溴硝醇的含量, %;

x—待測(cè)樣品中溴硝醇的含量, %。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜實(shí)驗(yàn)參數(shù)的調(diào)整選擇

通過(guò)查閱溴硝醇紫外吸收的光譜圖及相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)在215 nm波長(zhǎng)下有較強(qiáng)吸收，所以我們選擇檢測(cè)器波長(zhǎng)為215 nm。選擇流動(dòng)相溶劑時(shí)，甲醇對(duì)帶有羥基官能團(tuán)的化合物有著更好的溶解性能。而從紫外吸收的角度來(lái)考慮，甲醇的截止波長(zhǎng)為205 nm，但其在215 nm處的吸光度大于0.3 AU。對(duì)甲醇的吸收-波長(zhǎng)曲線進(jìn)一步觀察可以得出如下結(jié)論，對(duì)于甲醇-水系統(tǒng)，若在波長(zhǎng)215 nm進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)控制溶劑的甲醇含量低于15%，這一點(diǎn)在后續(xù)梯度洗脫方法優(yōu)化時(shí)尤為重要，當(dāng)流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)進(jìn)行高靈敏度實(shí)驗(yàn)，不論采用何種泵系統(tǒng)，因流動(dòng)相成分產(chǎn)生的低吸收都將增大噪聲[3]。流動(dòng)相中的磷酸可以很好地減少溴硝醇主峰的拖尾情況，修飾峰型。

2.2 方法的線性相關(guān)性驗(yàn)證

運(yùn)行一針1.4.1的標(biāo)樣樣品，時(shí)長(zhǎng)30 min，利用變色龍工作站中的眼鏡蛇向?qū)占€噪聲，重新配制樣品至溴硝醇主峰濃度為基線噪聲3倍(S/N=3∶1)時(shí)[4]，選擇該濃度為溴硝醇在此系統(tǒng)下的最低檢出限，本次實(shí)驗(yàn)得到其最低檢出限為1.15 mg/kg。在最低檢出限下下選擇1 mg/kg為起點(diǎn)選擇5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg、30 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg共6個(gè)點(diǎn)進(jìn)樣，將得到峰面積列為縱坐標(biāo)，濃度設(shè)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=16.914X+8.344 2，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8(見(jiàn)圖3)。

圖3 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

從同一溴硝醇-溶劑組合成品中分別取出5個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定完成精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1 同一溴硝醇制劑樣品中5次溴硝醇含量測(cè)定結(jié)果

向空白基質(zhì)中分別添加一定量的溴硝醇標(biāo)樣粉末，在以上的測(cè)定方法與條件下進(jìn)行定量檢測(cè)，測(cè)得其回收率范圍為98.8%～100.4%，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2 溴硝醇制劑添加標(biāo)樣測(cè)得的回收率

2.3 方法應(yīng)用的普適性驗(yàn)證

選取待測(cè)樣品A(卡松+溴硝醇)、待測(cè)樣品B(溴硝醇+OIT)對(duì)其中溴硝醇進(jìn)行定量分析，(如圖4、圖5所示)色譜圖中溴硝醇主峰峰型較好，并且與其它組分分離情況較好。其定量結(jié)果如表3所示。

表3 溴硝醇與其它物質(zhì)的復(fù)配制劑回收率測(cè)定結(jié)果

圖4 溴硝醇-卡松復(fù)配制劑色譜圖

圖5 溴硝醇-OIT復(fù)配制劑色譜圖

注意，當(dāng)溴硝醇與部分非水溶性物質(zhì)共存體系中時(shí)需要添加一定比例的乳化劑來(lái)降低混合體系中各組分的界面張力來(lái)形成均勻混合的乳狀液，在此類樣品的前處理階段時(shí)，甲醇流動(dòng)相稀釋樣品和樣品超聲都會(huì)造成樣品破乳(可以明顯觀察到破乳現(xiàn)象)，所以在操作結(jié)束后需要對(duì)待測(cè)樣震蕩混勻并靜置，方可進(jìn)行余下操作。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法檢測(cè)溴硝醇標(biāo)樣及其復(fù)配制劑中溴硝醇含量有較高的準(zhǔn)確度和精密度，線性關(guān)系良好，具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確及分離效果好的優(yōu)點(diǎn)，是進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量檢測(cè)較理想的分析方法。